CN107683771A - 一种牡丹胚高效无菌培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牡丹胚高效无菌培养的方法，该方法创造性地综合考虑灭菌方式、培养基及激素添加量和胚的不同发育时期凝练出一种牡丹胚高效无菌培养的方法。提出直接对种子进行灭菌，借助修枝剪解剖种子，取出胚后接种于培养基，不仅方法简易，还能有效降低污染率(培养40d后诱导率<2％)，同时可避免胚直接与消毒液接触，有效的提高了诱导率(培养40d后诱导率>74％)，同时提出可对未成熟种子(花后90d)的胚进行无菌培养，大大缩短了种子的繁育时间，在牡丹组织培养技术中具有较大的推广应用前景。

Description

一种牡丹胚高效无菌培养的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体而言，涉及一种牡丹组织培养的方法，尤其涉及一种牡丹胚高效无菌培养的方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa)属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Paeonia sect.Moutan DC.)的灌木植物，是中国十大名花之一，被誉为“花中之王”。牡丹的9个野生种均原产于中国，并且已有数千年的自然生长和1500多年的人工栽培历史，目前已经引种至日本、欧洲和美国等地区。牡丹也因极具药用和油用价值而备受关注，2014年国务院办公厅颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》(国办发[2014]68号)，油用牡丹作为重点推介的木本油料植物被大力推广种植。2014年，牡丹在全国的种植面积达6.67万hm2，2015年发展到13.33万hm2。然而，农业生产上普遍采用播种育苗、分株和嫁接的方法对牡丹进行育苗和良种扩繁，但是牡丹种子生根困难，生根率低，优良株系缺乏，并且可用于嫁接的材料短缺，这些因素导致牡丹良种的繁殖系数低，生产周期长，严重制约着品种的繁育及推广，抑制了牡丹产业的可持续和规模化生产。
植物组织培养是一种重要的无性繁殖手段，具有快速、高效的优点，能有效提高牡丹的繁殖系数，保持亲代的优良性状，是促进牡丹产业化生产的重要技术。早在1965年Partanen就开始了牡丹的组织培养研究，中国也有20多年的牡丹组织培养研究历史，虽然牡丹组织培养体系日渐完善，但还有诸多问题需要解决。如：牡丹的芽诱导率低、褐化玻璃化现象严重、生根率低、移栽率低等，因此，优化组培体系，形成高质量的组培苗是亟待解决的问题，其中以胚为外植体进行的胚高效无菌培养技术是牡丹组织培养的重要研究内容。现有研究显示：牡丹种皮坚硬光滑，无菌操作过程中用解剖刀(解剖剪)从种子内取胚非常耗时耗力，大大降低了工作效率；直接对离体的胚灭菌时，往往会出现高诱导率伴随高污染率或低污染率伴随低诱导率的现象，很难做到低污染率和高诱导率并存。因此研究牡丹胚高效无菌培养的新技术，对于油用牡丹组织培养的深入研究和产业化开发具有现实意义。
通过检索国内外现有技术，目前尚未发现综合不同的灭菌方式、培养基及激素添加量和胚的不同发育时期等方面深入研究有效提高牡丹胚无菌培养的新方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牡丹胚高效无菌培养的方法，以克服芽诱导率低和污染率高的问题，从而填补牡丹胚高效无菌培养技术的空白。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)选取花后50～500d的牡丹种子；
(2)牡丹种子用流水冲洗干净后，加入杀菌剂溶液中浸泡5～150min，蒸馏水冲洗，再加入400～600mg·L-1的GA(gibberellin，赤霉素)浸泡30～50h，收集下沉的种子并用蒸馏水冲洗干净后置于超净工作台上的无菌三角瓶中；
(3)将种子用75％的(v/v)乙醇消毒1～3min，2％次氯酸钠溶液消毒10～15min，无菌水清洗2-10次，注意：期间需要不停的摇动三角瓶，使溶液与种子充分接触，提高灭菌效果；
(4)手拿种子，种脐至于上方，用灭菌的修枝剪沿中间部位从下至上剪开种子，无菌镊子取出靠近种脐的胚，直接接入备好的培养基中，所述的培养基为1/2MS或MS+0.01～0.03mg·L-1NAA(1-naphthaleneacetic acid，α-萘乙酸)+1～2mg·L-1 6-BA(6-benzyladenine，6-苄基腺嘌呤)；每瓶接种3～5个胚，接种后进行静置培养，培养条件：培养温度25±1℃，光照10～12h/d。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(1)中的花后时间为90～110d的当年生种子。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(2)中所述的杀菌剂溶液为800倍的多菌灵。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(2)中GA浓度为500mg·L-1，浸泡时间为46～48h。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(3)中乙醇消毒时间为1min，次氯酸钠溶液消毒时间为10min。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(4)中所述的修枝剪的灭菌方式为：紫外线照射10～60min，使用前用75％酒精擦拭并用酒精灯灭菌。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(4)中基础培养基为1/2MS，NAA浓度为0.01mg·L-1，6-BA浓度为2mg·L-1。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中步骤(4)中光照时间为12h。
进一步优选地，如上所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其中所述的牡丹种子选自耐湿热的‘凤丹’种子。
与现有技术相比，本发明创造性地利用灭菌方式、培养基及激素添加量和胚的不同发育时期提出一种牡丹胚高效无菌培养的方法，该发明具有如下进步性和有益效果：
(1)对未成熟种子的胚进行无菌培养，有效缩短了种子萌发的时间，为大幅降低苗木的繁育时间提供基础。
(2)提出直接对种子进行灭菌，借助修枝剪解剖种子，取出胚后接种于培养基。该方法不仅提供了一种从牡丹种子取胚的简易方法，还能有效降低胚的污染率(培养40d后污染率＜2％)，同时可避免胚直接与消毒液接触，从而有效提高胚的诱导率(培养40d后诱导率＞74％)，在牡丹组织培养技术中具有较大的推广应用前景。
附图说明
图1为不同灭菌方式和基础培养基对成熟胚诱导率的影响。图A-C为胚培养40d的形态图，图D为不同条件下胚培养40d时胚的诱导率。注：ES：embryo sterilization，胚灭菌；SS：seed sterilization，种子灭菌。注：材料为花后470d的胚(已收获存放1年的种子)。
图2为不同激素添加量对胚培养形态的影响。图A-D分别是分别对应表2中1-4号的激素添加量。注：材料为花后470d的胚。
图3为胚培养40d后不同激素添加量对诱导率及不定芽长度的影响。注：1-4号的激素添加量如表2所示；材料为花后470d的胚。
图4为不同发育时期种子及胚的发育形态。图A-E分别为花后15、30、70、90和110d时种荚解剖面，离体的种子及其解剖面，E图最右侧显示了离体胚的形态特征。
图5为不同时期胚无菌培养的形态特征。图A-D分别是花后70、90、110和470d时不同培养时期胚培养的形态特征。A图显示花后70d胚培养时存在严重的胚根褐化现象。注：所用培养基为1号培养基。
图6为不同时期胚对诱导率的影响。注：所用培养基为1号培养基。
具体实施方式
牡丹胚组织培养中存在污染率高和诱导率低等问题，这个技术问题已经困扰了本领域技术人员数十年。而本发明创造性地通过灭菌方式、培养基及激素添加量和胚的不同发育时期等因素对污染率、诱导率和胚培养形态特征的影响，提出一种牡丹胚高效无菌培养的方法，不仅降低了污染率，还能有效提高诱导率，并且方法流程清晰，效率高，有较强的推广应用价值。以下实施例结合附图进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。
实施例1：牡丹胚高效无菌培养的方法
(1)选取花后90～110d的当年生牡丹种子；
(2)牡丹种子用流水冲洗干净后，加入800倍的多菌灵浸泡15min，蒸馏水冲洗3次，再加入500mg·L-1的GA(gibberellin，赤霉素)浸泡48h，收集下沉的种子并用蒸馏水冲洗干净后置于超净工作台上的无菌三角瓶中；
(3)将种子用75％的(v/v)乙醇消毒1min，2％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水清洗5次，每次1min。注意：期间需要不停的摇动三角瓶，使溶液与种子充分接触，提高灭菌效果。
(4)将种子用无菌的修枝剪(紫外线照射30min，使用前用75％酒精擦拭并用酒精灯灭菌)解剖，用无菌镊子取出胚后置于无菌滤纸上除去其多余的水分，再接入合适的灭菌培养基进行无菌培养，培养基为1/2MS+0.01mg·L-1NAA+1mg·L-1 6-BA，每瓶接种3个胚，接种后置于组织培养室进行静置培养，培养条件：培养温度25℃，光照12h/d。
实施例2：牡丹胚高效无菌培养研究的实验设计
本研究以耐湿热的‘凤丹’种子为实验材料，灭菌方式为直接对胚灭菌和对种子灭菌2种；基本培养基选用MS(表1所示)和1/2MS(pH值和琼脂添加量不变，其它成分添加量均为MS培养基的1/2)；胚的不同时期为花后15、30、70、90、110和470d，其中花后470d胚取自收获满1年的种子；不同激素添加量共设置4种类型(表2所示)。采用实施例1的试验步骤，试验结果如下：
表1 MS基本培养基成分信息表
表2 不同编号培养基激素浓度设置
(1)不同灭菌方式和基础培养基类型对污染率和诱导率的影响
图1A-C显示不同灭菌方式对胚培养形态的影响。以花后470d的种子为试材，直接对胚灭菌，虽然污染率接近0，但培养40d后胚的形态仍然保持不变，诱导率也为0(图1A、图1D)；若先对种子进行灭菌，再解剖种子取出胚进行培养，污染率＜2％，胚培养后组织形态发育良好(图1B和图1C)诱导率在60％以上(图1D)；胚在1/2MS上的生长情况及诱导率(74.07％)均高于MS培养基(62.50％)，所以将1/2MS定为牡丹胚培养的基础培养基。
(2)不同激素对胚培养形态特征、诱导率及不定芽长度的影响
牡丹胚(花后470d)在第1种激素添加量的培养基上生长状态良好，不定芽上形成了分生能力强的松散的淡黄色的愈伤组织(图2A)，有利于后续培养中芽和根的形成，胚培养40d后的诱导率为74.07％，不定芽长度为10.4mm(图3)；牡丹胚在2号培养基上培养至40d时，虽然诱导率高达96.30％(图3)，但出现不定芽褐化(图2B)，严重影响了不定芽的长度，40d时不定芽长度为4种培养基中最低，仅为6.50mm(图3)，不利于后期的继代、芽生长和生根培养；牡丹胚在3号培养基上存在与2号培养基相似的情况(图2C和B)，在4号培养基上的诱导率低于50％，仅为44.44％，不定芽长度仅为6.80mm(图3)。综上所述，最终选择1号培养基中激素的配比及添加量。
(3)不同时期胚无菌培养对牡丹种子生根质量的影响
上述实验所用到的牡丹种子均为花后470d的种子，即已经采收放置1年的种子，非当年生种子，若能利用当年生种子甚至是未成熟种子的胚进行组织培养，将大大提高牡丹的育种周期。为了系统研究胚的不同发育时期对胚培养的影响，先了解一下牡丹种子：牡丹为蓇葖果，果五角，每一果角结籽7-13粒，种子圆形，种子由种皮、胚乳和胚3部分组成，随着种子的成熟种皮由淡黄色点缀红色变成黄色直至黑褐色(图4)。牡丹种子在花后15和30d时未看到形成的胚(图4A和图4B)，花后70d种子内已经形成完整的胚(图4C)，花后110d种子成熟(图4E)。分别取花后70、90、110和470d的种子在1号培养基上进行无菌培养，结果发现，这些不同时期的牡丹胚生长形态表现良好(图5)，然而诱导率存在较大差异，花后110d(97.14％)＞花后90d(94.95％)＞花后470d(74.07％)＞花后70d(21.43％)(图6)，花后90d与110d的胚培养无论形态还是诱导率均无显著性差异，但两者均远远高于采收后存在1年的种子及花后70d的种子内的胚，尤其是花后70d的胚在培养时胚根出现严重的褐化情况，随着培养时间的延长，褐化情况也越来越严重(图5A)，最终导致胚不能被进一步诱导形成不定芽。因此，用于牡丹胚无菌培养的种子其最佳采收时期为花后90～110d。

Claims (9)

1.一种牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)选取花后50～500d的牡丹种子；
(2)将牡丹种子用流水冲洗干净后，加入杀菌剂溶液中浸泡5～150min，蒸馏水冲洗，再加入400～600mg·L-1的GA浸泡30～50h，收集下沉的种子并用蒸馏水冲洗干净后置于无菌环境下的无菌三角瓶中；
(3)将种子用75％乙醇消毒1～3min，2％次氯酸钠溶液消毒10～15min，消毒期间不停的摇动三角瓶，无菌水清洗2～10次；
(4)手拿种子，种脐至于上方，用灭菌的修枝剪沿中间部位从下至上剪开种子，无菌镊子取出靠近种脐的胚，直接接入备好的培养基中，所述的培养基为：基础培养基+0.01～0.03mg·L-1NAA+1～2mg·L-16-BA，所述的基础培养基为1/2MS或MS；培养条件为：温度25±1℃，光照10～12h/d。
2.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(1)选取花后90～110d的当年生牡丹种子。
3.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的杀菌剂溶液为800倍的多菌灵。
4.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(2)中GA浓度为500mg·L-1，浸泡时间为46～48h。
5.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(3)中75％乙醇消毒时间为1min，2％次氯酸钠溶液消毒时间为10min。
6.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的修枝剪的灭菌方式为：紫外线照射10～60min，使用前用75％酒精擦拭并用酒精灯灭菌。
7.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的基础培养基为1/2MS，NAA浓度为0.01mg·L-1，6-BA浓度为2mg·L-1。
8.根据权利要求1所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，步骤(4)中光照时间为12h。
9.根据权利要求1-8任一项所述牡丹胚高效无菌培养的方法，其特征在于，所述的牡丹种子选自耐湿热的‘凤丹’种子。
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