CN111406649B - 一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，具体为：1）采集芍药花蕾，低温预处理，再进行消毒处理；2）将花药接种到愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下先黑暗培养0～15 d，再弱光培养60～90 d，诱导出胚性愈伤组织；3）将胚性愈伤组织移至体细胞胚分化培养基中培养30～40 d；4）挑选子叶胚或者具有胚根、胚轴和子叶的体胚，接种到成苗培养基进一步培养诱导真叶形成，最后获得具备根、茎、叶的完整植株。该方法利用花药培养获得单倍体植株，大大缩短了育种周期，成苗率较高，丰富了芍药的育种资源，对植物遗传理论研究和育种实践生产都具有重要意义。

Description

一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种诱导芍药花粉胚胎发生的组织培养方法。
背景技术
芍药是芍药科芍药属的多年生草本植物，我国的传统名花，自古就有“花相”、“花中皇后”的美称，与牡丹并称为“花中二绝”。芍药的花色、花型繁多，具有极高的观赏价值。在欧美国家，芍药以切花生产为主，是婚礼等喜庆场合使用的高档切花。我国芍药主要是药用栽培和园林庭园观赏栽培，市场需求十分有限；芍药切花应用在我国出现较晚，对其研究的深度和广度远不及其他名花的地位，芍药切花市场一直在起步期徘徊，其中优质品种匮缺是制约其发展的原因之一。因此，改变我国芍药传统的生产方式，培育具有自主知识产权的优良芍药切花品种，是今后芍药产业发展的一个的重要方向。
单倍体育种是获得植物新品种的途径之一。花药和花粉培养是获得单倍体的主要手段，目前已经在桔梗、百合、金银花、菊花等多种园林植物上获得了成功，在牡丹上有花药培养的报道，但是仅仅获得了愈伤组织。在芍药上有以茎段、叶片、叶柄为外植体诱导体细胞胚发生的报道，但是仅得到了球形胚和心形胚。目前尚未有利用芍药粉胚胎诱导成功的报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种诱导芍药花粉胚胎发生的组织培养方法，该方法利用花药培养获得单倍体植株，大大缩短了育种周期，成苗率较高，丰富了芍药的育种资源，对植物遗传理论研究和育种实践生产都具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其包括如下步骤：
1）采集芍药花蕾，低温预处理，再进行消毒处理；
2）将步骤1）所得花药接种到愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养0～15 d，再在光照条件1～500Lx下弱光培养60～90 d，诱导出黄褐色疏松的胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织移至体细胞胚分化培养基中培养30～40 d，获得了不同发育时期的胚状体；
4）挑选子叶胚或者具有胚根、胚轴和子叶的体胚（以下简称体胚），接种到成苗培养基进一步培养，诱导真叶形成，最后获得具备根、茎、叶的完整健壮小植株。将鉴定为单倍体的植株进行加倍获得纯合的DH株系，可以缩短育种周期，并且使一些优良的隐性性状得以表达，有利于育种材料的选择。
进一步的，步骤1）中，芍药花蕾优选大小在1.0～2.2cm之间，一般选用处于小风铃期、大风铃期或圆蕾期的花蕾。
进一步的，步骤1）具体为：采集花蕾后，装入自封袋中放在冰箱冷藏室于3-5℃条件下低温预处理0～15 d，然后将经过低温预处理后的芍药花蕾剥去萼片，用流水冲洗，先用70-75%乙醇（体积百分比）消毒，无菌水冲洗，再用0.5～2%次氯酸钠（NaClO，质量百分比）水溶液消毒10～12 min，无菌水冲洗，无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌的解剖刀切下花药即可。
进一步的，步骤2）中，所述的愈伤组织诱导培养基为：MS +2,4-D 1～2 mg/L+NAA0～1 mg/L +KT 0～1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L。
进一步的，步骤3）中，所述的体细胞胚分化培养基为：MS +KT 0～2 mg/L+IAA 0～1 mg/L+椰汁150ml/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度500～1000Lx。
进一步的，步骤4）中，所述的成苗培养基为WPM +BA 0～1.0 mg.L-1 +IAA 0～1.0mg.L-1+ GA3 0～2.0 mg.L-1 +蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度2000～3500Lx。
本发明方法中，所述的黑暗培养是指采用黑布遮住培养容器进行培养，。
本发明方法中，2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、KT（N6-呋喃甲基腺嘌呤）、IAA（吲哚-3-乙酸\）、BA（6-卞氨基腺嘌呤）、GA3（赤霉素）等均为本领域常规使用的植物生长调节物质，可以直接购买普通市售产品。MS、WPM为本领域常用的培养基，可直接购买或者按照现有技术常规配方进行配制。
和现有技术相比，本发明方法的有益效果如下：
本发明旨在提供一种有效可靠的诱导芍药花粉胚胎发生并将之培养成苗的方法。利用花药培养是获得单倍体植株的一种重要途径，单倍体植株在植物遗传理论研究和育种实践生产中具有重要意义。单倍体属于配子染色体的个体，仅有一套染色体，是进行植物基因、生理、胚胎和遗传等问题研究的重要材料；单倍体植株加倍可以获得纯合的DH株系，缩短育种周期，并且使一些优良的隐性性状得以表达，有利于育种材料的选择。本发明中芍药花药培养胚性愈伤组织的诱导率为19.02%，体细胞胚的分化率为74%，成苗率35.3%。因此，本发明方法适用于多种芍药的花药培养，不仅在芍药胚胎发生的理论研究领域有重要意义，本发明方法的推广应用还能丰富芍药的育种资源，大大缩短育种周期，对芍药育种发挥重大作用。
附图说明
图1 为用于花药培养的芍药花蕾；
图2 为芍药花药的胚性愈伤组织；
图3 为芍药花药胚性愈伤组织分化出的子叶胚;
图4 为具有子叶、胚轴和胚根的芍药体胚；
图5为长出2片真叶的芍药花粉植株。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，芍药花药培养所需的愈伤组织诱导培养基、体细胞胚分化培养基以及成苗培养基配方见下表1。
表1 芍药花药培养各阶段所需培养基配方
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实施例1
一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其包括如下步骤：
1）外植体的消毒灭菌：
采集1.3cm大小的外植体芍药花蕾（见图1），装入自封袋中放在冰箱冷藏室于4℃条件下低温预处理9 d，经过低温预处理后，剥去萼片，用流水冲洗10 min，然后拿至超净工作台上，先用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗一遍，再用0.5%次氯酸钠水溶液消毒12 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌解剖刀切下花药进行接种；
2）将步骤1）所得花药接种到表1中所示的Y3愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养7d，再在光照条件200Lx下弱光培养90 d，诱导出黄褐色疏松的胚性愈伤组织（见图2）；
3）将胚性愈伤组织移至表1中所示的F1体细胞胚分化培养基中培养30 d（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度500Lx），获得不同发育时期的胚状体（即从胚性愈伤组织中分化出鱼雷胚、子叶胚及体胚）；
4）挑选体胚（见图4），接种到表1中所示的C4成苗培养基进一步培养（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度2000Lx），促使诱导真叶萌发形成，最后获得具有真叶、根系的完整健壮小植株（见图5）。
实施例2
一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其包括如下步骤：
1）外植体的消毒灭菌：
采集1.8cm大小的外植体芍药花蕾，装入自封袋中放在冰箱冷藏室于4℃条件下低温预处理7 d，经过低温预处理后，剥去萼片，用流水冲洗10 min，然后拿至超净工作台上，先用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗一遍，再用0.5%次氯酸钠水溶液消毒12 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌解剖刀切下花药进行接种；
2）将步骤1）所得花药接种到表1中所示的Y2愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养5d，再在光照条件500Lx下弱光培养75 d，诱导出黄褐色疏松的胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织移至表1中所示的F1体细胞胚分化培养基中培养35 d（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度1000Lx），从胚性愈伤组织中分化出子叶胚及体胚；
4）挑选体胚，接种到表1中所示的C2成苗培养基进一步培养（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度2000Lx），促使诱导真叶萌发形成，最后获得具有真叶、根系的完整健壮小植株。
实施例3
一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其包括如下步骤：
1）外植体的消毒灭菌：
采集2.0cm大小的外植体芍药花蕾，装入自封袋中放在冰箱冷藏室于4℃条件下低温预处理5 d，经过低温预处理后，剥去萼片，用流水冲洗10 min，然后拿至超净工作台上，先用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗一遍，再用0.5%次氯酸钠水溶液消毒12 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌解剖刀切下花药进行接种；
2）将步骤1）所得花药接种到表1中所示的Y4愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养3d，再在光照条件100Lx下弱光培养60 d，诱导出黄褐色疏松的胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织移至表1中所示的F2体细胞胚分化培养基中培养40 d（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度500Lx），从胚性愈伤组织中分化出子叶胚及体胚；
4）挑选体胚，接种到表1中所示的C1成苗培养基进一步培养（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度2500Lx），促使诱导真叶萌发形成，最后获得具有真叶、根系的完整健壮小植株。
实施例4
一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其包括如下步骤：
1）外植体的消毒灭菌：
采集1.6cm大小的外植体芍药花蕾，装入自封袋中放在冰箱冷藏室于4℃条件下低温预处理3 d，经过低温预处理后，剥去萼片，用流水冲洗10 min，然后拿至超净工作台上，先用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗一遍，再用0.5%次氯酸钠水溶液消毒12 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌解剖刀切下花药进行接种；
2）将步骤1）所得花药接种到表1中所示的Y1愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养5d，再在光照条件500Lx下弱光培养75 d，诱导出黄褐色疏松的胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织移至表1中所示的F3体细胞胚分化培养基中培养35 d（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度1000Lx），从胚性愈伤组织中分化出子叶胚、及体胚；
4）挑选子叶胚（见图3），接种到表1中所示的C3成苗培养基进一步培养（培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度3000Lx），促使诱导真叶萌发形成，最后获得具有真叶、根系的完整健壮小植株。
本发明诱导芍药花粉胚胎发生的方法大大缩短了育种周期，成苗率35.3%，适用于多种芍药的花药培养，可以为芍药的胚胎发生理论研究提供替代体系，对芍药育种发挥重大作用。

Claims (3)

1.一种诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其特征在于， 包括如下步骤：
1）采集芍药花蕾，低温预处理，再进行消毒处理；
2）将步骤1）所得花药接种到愈伤组织诱导培养基上，于温度23±2℃条件下，先黑暗培养3～15 d，再在光照条件1～500Lx下弱光培养60～90 d，诱导出胚性愈伤组织；
3）将胚性愈伤组织移至体细胞胚分化培养基中培养30～40 d；
4）挑选子叶胚或者具有胚根、胚轴和子叶的体胚，接种到成苗培养基进一步培养，诱导真叶形成，最后获得具备根、茎、叶的完整植株；
所述的愈伤组织诱导培养基为：MS +2,4-D 1～2 mg/L+NAA 0～1 mg/L +KT 0～1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，其中NAA和KT的浓度不同时为0；
所述的体细胞胚分化培养基为：MS +KT 0～2 mg/L+IAA 0～1 mg/L+椰汁150ml/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，其中KT和IAA的浓度不同时为0；培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度500～1000Lx；
所述的成苗培养基为①WPM +BA 0.2～1.0 mg/L+IAA 0.2～1.0 mg/L + GA3 0.5～2.0mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，或者②WPM +BA 0.2～1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，或者③WPM + IAA 0.2～1.0 mg/L + GA3 0.5～2.0 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；培养条件为：温度23±2℃，光照周期12h/d，光照强度2000～3500Lx。
2.如权利要求1所述诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其特征在于，步骤1）中，芍药花蕾大小在1.0～2.2cm之间。
3.如权利要求2所述诱导芍药花粉胚胎发生的方法，其特征在于，步骤1）具体为：采集花蕾后，装入自封袋中于3-5℃条件下低温预处理3～15 d，然后将经过低温预处理后的芍药花蕾剥去萼片，用流水冲洗，先用70-75%乙醇消毒，无菌水冲洗，再用0.5～2%次氯酸钠水溶液消毒，无菌水冲洗，无菌的镊子去掉花瓣，露出花药，用无菌解剖刀切下花药即可。
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