CN115191355B

CN115191355B - 一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法

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Publication number: CN115191355B
Application number: CN202210895065.1A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 辛海波; 郭昊; 镡媛; 王茂良
Original assignee: Beijing Academy Of Landscape Science
Current assignee: Beijing Academy Of Landscape Science
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-07-27
Also published as: CN115191355A; CN116671437A

Abstract

元宝枫作为一种极具观赏价值和经济价值的乔木，科研人员对其叶色及种子中的不饱和脂肪酸等开展了大量研究。为了阐明候选基因在元宝枫体内的作用机制，科研人员需要首先建立元宝枫遗传转化体系。本发明涉及一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法：使用本发明提供的胚性愈伤组织诱导培养基培养元宝枫，能够提高元宝枫胚性愈伤组织诱导的概率。所述胚性愈伤组织诱导培养基选自以下组：1/2MS+0.5mg/L吲哚丁酸+1.0mg/L噻苯隆+3.0mg/L 6‑苄氨基嘌呤+0.1mg/L赤霉素；1/2MS+3.0mg/L 6‑苄氨基嘌呤+2.0mg/L噻苯隆+0.5mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L赤霉素。本发明提供的元宝枫胚性愈伤诱导方法不仅适用于元宝枫遗传转化体系的研究，也适用于元宝枫的快速繁殖。

Description

一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法。

背景技术

元宝枫又名元宝槭，为无患子目、槭树科、槭属落叶乔木。元宝枫是一种观赏性很强且生存能力很强的植物。元宝枫因其耐贫瘠、耐干旱、耐低温、适应性强等特性在园林绿化中有着特殊地位。

元宝枫树冠阔圆形，树皮灰黄色至灰色，有纵裂条纹，小枝对生光无毛，1年生枝。元宝枫耐半荫、耐寒、抗风、不耐干热和强烈日晒。

元宝枫叶片呈淡赤褐色或绿色并带有绯红色，后呈灰色。元宝枫单叶对生，掌状5裂，长5～10厘米，宽6～15厘米，全缘，先端渐尖，翅果。元宝枫树冠浓荫，树姿优美，叶形秀美，叶色艳丽。秋季叶色多变为亮丽的血红色或金黄色，是北方著名的秋色叶树种。

现有技术大多通过扦插或嫁接的方式获得新的元宝枫单株。然而元宝枫新优品种扦插较难，主要原因是生根难，到目前为止，扦插苗生根率仍然很低，达不到大规模繁殖的要求。

随着组织培养技术的成熟，元宝枫的组织培养成为元宝枫繁育的一种手段。公开号为CN111657151A的中国专利申请公开了一种元宝枫快速成苗方法，包括以下步骤：采集元宝枫当年生枝条，切割带芽茎段作为外植体，消毒后接种于外植体萌发培养基上，使芽体展叶，获得无菌苗；再将无菌苗的新生茎段置于生根培养基上，直接生根成苗，随后移栽。公开号为CN102726295A的中国专利公开了一种元宝枫组织培养繁殖方法，该方法包括：在3月上旬采集树龄为4～6年的元宝枫母树的当年生枝芽作为外植体，消毒后切段并接种到包含苄氨基腺嘌呤、萘乙酸的MS培养基中进行组织诱导培养，培养环境为pH 5.6～5.8，20～24℃，光照强度1500lux，每天18小时光照6小时黑暗。上述方法通过诱导外植体定向分化而使每个外植体能够分化成一个单株。

截至目前为止，尽管已有很多研究者开展了元宝枫再生体系和遗传转化体系的研究，但仍然没有建立真正有效的元宝枫遗传转化体系。基于培育胚性愈伤组织以实现元宝枫的再分化，本发明涉及一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法。

此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

发明内容

针对现有技术之不足，本发明提供了一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法和胚性愈伤组织诱导培养基。使用该培养基和该诱导方法能够显著提高元宝枫的茎段体细胞胚发生率，为低发芽率的元宝枫的培育和建立元宝枫遗传转化体系奠定技术基础。

本发明中涉及的一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法，包含以下步骤：

采集元宝枫茎段，将所述元宝枫茎段消毒处理后获得用于愈伤组织培育的外植体，并将所述外植体置于初级愈伤组织诱导培养基表面，获得元宝枫的初级愈伤组织；选择健康的初级愈伤组织，将健康的初级愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中，健康的初级愈伤组织是白色、绿色或淡红色，其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基选自以下组：

1/2MS+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+1.0mg/L噻苯隆(TDZ)+3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/L赤霉素(GA)；

1/2MS+3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+2.0mg/L噻苯隆+0.5mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L赤霉素。

根据一种优选实施方式，初级愈伤组织诱导培养基包含：1/2MS、2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.3mg/L 6-BA、0.5mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖(Sucrose)、7g/L琼脂(Agar)和0.5g/L酸水解酪蛋白(AHC)。

根据一种优选实施方式，元宝枫茎段的消毒方法包含以下步骤：

洗涤灵浸泡后水冲洗；酒精表面消毒后无菌水清洗；转入次氯酸钠中浸泡，无菌水清洗。

根据一种优选实施方式，胚性愈伤组织的继代培养方法包含以下步骤：

选择新生的胚性愈伤组织于胚性愈伤组织诱导培养基中培养，其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基选自以下组：

1/2MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA；

1/2MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L IBA。

根据一种优选实施方式，用于继代培养的所述胚性愈伤组织诱导培养基包含1/2MS、0.5mg/L IBA、2.0mg/L TDZ、3.0mg/L 6-BA、0.1mg/L GA。

根据一种优选实施方式，用于继代培养的所述胚性愈伤组织诱导培养基包含1/2MS、0.5mg/L IBA、1.0mg/L TDZ、3.0mg/L 6-BA、0.1mg/L GA。

根据一种优选实施方式，胚性愈伤组织能够为绿色颗粒状或白色颗粒状。

根据一种优选实施方式，消毒后的所述茎段能够被分割为长度在1～2cm之间的无生长点小段，所述无生长点小段能够作为外植体于所述初级愈伤组织诱导培养基中培养。

根据一种优选实施方式，胚性愈伤组织能够每2～4周进行一次继代培养，以维持稳定生长和增殖。

一种用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基包含：由1/2MS、30g/L蔗糖、0.5g/L酸水解酪蛋白、8g/L琼脂构成的1/2MS基础培养基和激素组合物，其中，激素组合物由以下质量浓度的组分组成：

0.1～1.0mg/L的IBA、0.1～4.0mg/L的TDZ、1.0～5.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的GA。优选地，赤霉素能够为GA₃。

本发明提供了如上述培育元宝枫的方法或用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导的培养基于元宝枫胚苗培养中的用途。

本发明提供了如上述培育元宝枫的方法或用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导的培养基于提高元宝枫体细胞胚性转化率中的用途。

根据一种优选实施方式，本发明中的MS培养基包含大量元素、微量元素、铁盐和有机物质。大量元素包含1650mg/L NH₄NO₃、1900mg/L KNO₃、440mg/L CaCl₂·2H₂O、370mg/LMgSO₄·7H₂O、170mg/L KH₂PO₄。微量元素包含0.83mg/L KI、6.3mg/L H₃BO₃、22.3mg/LMnSO₄·4H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O。铁盐包含27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L EDTA-FeNa₂·3H₂O。有机物质包含100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇(维生素B6)、0.1mg/L盐酸硫胺素(维生素B1)、2.0mg/L甘氨酸。

根据一种优选实施方式，本发明中的1/2MS培养基指将MS培养基中大量元素减少到原来的1/2。

附图说明

图1是本发明提供的含有不同浓度的IAA和IBA的胚性愈伤组织诱导培养基培养的胚性愈伤组织的出愈率对比；

图2是本发明提供的含有不同浓度TDZ的胚性愈伤组织诱导培养基培养的胚性愈伤组织的出愈率对比；

图3是本发明提供的含有不同浓度6-BA的胚性愈伤组织诱导培养基培养的胚性愈伤组织的出愈率对比；

图4是本发明提供的不同类型的愈伤组织；

图5是本发明提供的元宝枫胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在40×物镜下的细胞切片结构。

具体实施方式

下面结合附图进行详细说明。

现有技术中，元宝枫的传统无性繁殖方式主要有扦插和嫁接两种。本发明提供一种元宝枫的胚性愈伤组织的诱导方法。该诱导方法区别于传统的繁殖方法，通过将元宝枫体细胞转化为胚性愈伤组织后再分化的方式获得元宝枫单株。在本发明中，元宝枫外植体可以先被转化为胚性愈伤组织，然后胚性愈伤组织可以再被分化成完整的元宝枫个体。本发明提供的诱导方法能够用于建立元宝枫的再生体系和遗传转化体系。

优选地，将元宝枫愈伤组织转移到分化培养基上分化成不同的器官原基或形成胚状体。分化出芽苗的元宝枫转移至生根培养基中，促进元宝枫芽苗生根。生根处理能够提高元宝枫芽苗的健壮度。

元宝枫目前主要采用短枝扦插或外植体成芽分化的方式进行繁育，但本发明提供元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法适用于体细胞转化为胚状体后再分化的组培方法。

使用组织培养的方法培育元宝枫具有以下优点：

繁殖速度快、繁殖系数大：用试管快繁技术繁殖，可节约繁殖材料，只取元宝枫茎段上的一小块组织就能在短期内生产出大量胚性愈伤组织，每一个胚性愈伤组织均具有分化成为完整元宝枫个体的可能，该方法既不损伤元宝枫原植株又能够获得较高的经济效益；

繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状：试管繁殖是一种微型的无性繁殖，它取材于同一元宝枫的体细胞而不是性细胞，因此其后代遗传性非常一致，能保持元宝枫原有品种的优良性状，对保质、保纯有着特殊作用，组织培养的繁育方法能够获得大量的统一规格、高质量的元宝枫，元宝枫的商品性好；

可进行工厂化生产：组织培养快速繁育是在人工控制的条件下进行的集约化生产，不受自然环境中季节和恶劣天气的影响。因不受季节限制，植物组织培育可以全年进行连续生产，生产效率高。从取材到接种，再到培养，再到生根，最后移栽，该过程能够工厂化生产，对反季节生产有着特殊作用，例如在夏天培育不耐高温的元宝枫，夏天可在培养室内进行组培苗生产，秋天进行元宝枫移栽；

经济效益高：元宝枫的组织培养快速繁殖由于种苗在培养瓶中生长，立体摆放，所需要的空间小，节省土地，且生产按一定的程序严格执行，生产过程微型化、精密化，元宝枫的组织培养快速繁殖能最大限度发挥人力、物力和财力，取得很高的生产效率，如在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。

植物胚性愈伤组织让外植体在外界激素等诱导下，外植体切口处膨大，形成具有分生成完整植株潜力的无规则细胞团。随着植物组织培养技术的发展，体细胞胚胎发生已逐渐成为植物大规模繁殖的主要方式，该途径繁殖系数高、具有较高的遗传稳定性。优质的胚性愈伤组织是胚胎形成的前提，是规模植株再生的基础，是遗传转化的重要材料。随着基因工程不断发展，植物体导入外源基因并形成稳定遗传表达的新性状品种成为热门方向，而植物体再生则成了限制植物转基因技术的一大难题。

元宝枫属槭属落叶乔木，而槭属植物的组织培养研究比较少，仅能查阅到鸡爪槭、大槭树、美洲糖槭、红银槭、尖尾槭等几种树种的有关研究报道。与元宝枫组织培养相关的研究多为茎尖培养直接成苗技术。胚性愈伤组织的诱导及分化的方法不仅能够用于个体繁育，还能够用于元宝枫新品种繁育。基因工程技术运用到元宝枫新品种的繁育上，使得培育观赏性质稳定、抗虫抗病的元宝枫新品种培育相关工作更为简便快速。

控制着细胞分裂和分化方向的生长素与细胞分裂素会参与植物组织培养。本发明采用IAA、IBA、6-BA、TDZ和GA进行愈伤组织诱导。细胞分裂素和生长素能够有效促进胚性愈伤组织的形成和增殖。6-BA是最为常用的细胞分裂素，能促进细胞分裂，有利于愈伤组织的形态建成；TDZ属于人工合成的杂环脲类细胞分裂素，此类细胞分裂素可直接作用于细胞分裂素受体，激活下游信号网络中的酶。

本发明在MS培养基的基础上添加了生物激素。生物激素能够为IBA、IAA、TDZ、GA或6-BA。IBA的浓度为0.1～1.0mg/L。优选地，IAA与IBA中选择了IBA。IBA的浓度为0.5mg/L。TDZ的浓度为0.1～4.0mg/L。优选地，TDZ的浓度为2mg/L。6-BA的浓度为1.0～5.0mg/L。优选地，6-BA的浓度为3.0mg/L。优选地，GA3的浓度为0.1mg/L。

实施例1

试验步骤包含试验材料的采集、外植体的消毒处理、元宝枫初级愈伤组织的诱导、元宝枫胚性愈伤组织的诱导、元宝枫胚性愈伤组织的继代增殖、元宝枫胚性愈伤组织细胞学观察与鉴定和数据统计分析。

1.试验材料的采集

于每年4月至5月上旬采集‘丽红’元宝枫(Acer truncatum‘Lihong’)当年生幼嫩茎段作为试验材料。采集时间为上午8点至10点，采集时天气以晴朗无云为宜。

2.外植体的消毒处理

将采集的元宝枫茎段流水冲洗10分钟，然后加入1/1000洗涤灵洗涤10分钟，之后用流水反复漂洗4小时。对外植体清洗后将其置于无菌培养瓶中进行表面灭菌。表面灭菌处理为：首先用无菌水清洗2次，每次3分钟；加入75％酒精消毒1分钟，再用无菌水漂洗3次，每次3分钟；加入10％次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水漂洗3次，每次3分钟。无菌滤纸吸干茎段表面水分后切成1cm长的无生长点小段。

3.元宝枫初级愈伤组织的诱导

将茎段于愈伤组织诱导培养基中培养，元宝枫愈伤组织诱导培养基配方为1/2MS、2mg/L 2,4-D、0.3mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、0.5g/L酸水解酪蛋白、7g/L琼脂，经2周诱导后，获得元宝枫初级愈伤组织。

4.元宝枫胚性愈伤组织的诱导

从所获得的初级愈伤组织中选取白色、绿色或淡红色的健康初级愈伤组织，将其转移至胚性愈伤组织诱导培养基。胚性愈伤组织诱导采用1/2MS基础培养基：1/2MS、30g/L蔗糖、0.5g/L AHC、8g/L琼脂，对生长素(IAA)与吲哚-3-丁酸(IBA)在不同种类相同浓度及同种类不同浓度条件下进行对照试验、分别设置不同浓度梯度的细胞分裂素(TDZ)和6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，观察各激素配比对胚性愈伤组织形成的影响。本发明基于控制变量法探究不同激素对元宝枫胚性愈伤组织诱导的影响。

5.元宝枫胚性愈伤组织的继代培养

每2周选择结构紧密、质地硬实、颗粒状的新生愈伤组织继代培养一次，同时对愈伤组织的生长状态、质地和颜色进行总结记录。本发明人发现，胚性愈伤组织能够每2周进行继代培养，可以使愈伤组织维持稳定的生长和增殖。

6.元宝枫胚性愈伤组织细胞学观察与鉴定

取少量继代愈伤组织用FAA固定液固定，真空抽气后，树脂包埋制备超薄切片。将制备好的超薄切片置于显微镜下观察拍照，确定胚性愈伤组织类型。

7.数据统计分析

胚性愈伤组织诱导率(％)＝形成胚性愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100％；

试验数据采用Excel 2013进行数据分析。

在本实施例中，主要目的是探究IAA和IBA对胚性愈伤组织诱导的影响。

本实施例中还采用0.1～1.0mg/L的IAA和0.1～1.0mg/L的IBA进行对照试验。本实施例提供十组培养基，每个编号对应的成分为：

a.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.1mg/L IAA；

b.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.2mg/L IAA；

c.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.4mg/L IAA；

d.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IAA；

e.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+1.0mg/L IAA；

f.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.1mg/L IBA；

g.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.2mg/L IBA；

h.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.4mg/L IBA；

i.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

j.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+1.0mg/L IBA。

结果如表1所示，不同浓度的IAA和IBA培养基上胚性愈伤组织的生长状况和组织特性存在较大的差异。如图1所示，所有浓度梯度的IAA培养基中愈伤组织在继代培养的过程中生长速度缓慢并持续褐化，整体表现不如添加IBA的培养基。但当IBA浓度过高或过低时，愈伤组织结构开始变得致密，质地较硬，颜色也相对加深，并最终褐化死亡。图1中的a～e分别为0.1、0.2、0.4、0.5、1.0mg/L IAA浓度的培养皿中愈伤组织生长状况；f～j分别为0.1、0.2、0.4、0.5、1.0mg/L IBA浓度的培养皿中愈伤组织生长状况。因此，确定1/2MS、0.5mg/L IBA、1.0mg/L TDZ、3.0mg/L 6-BA和0.1mg/L GA诱导胚性愈伤组织更为理想。

表1

实施例2

本实施例与实施例1中所使用的试验方法相同，重复的内容不再赘述。

在本实施例中，主要目的是探究TDZ对胚性愈伤组织诱导的影响。

本实施例中采用0.1～4.0mg/L的TDZ进行对照试验。本实施例提供五组培养基，每个编号对应的成分为：

a.1/2MS基础培养基+0.1mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

b.1/2MS基础培养基+0.5mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

c.1/2MS基础培养基+1.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

d.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

e.1/2MS基础培养基+4.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA。

由表2和图2可知，在IBA、6-BA及GA浓度不变的前提下，调整TDZ浓度，胚性愈伤组织诱导率均表现较好，外植体大多整体膨大，各处理间形态差别不大。但随着TDZ浓度的升高，愈伤组织逐渐由松散状态转为致密状态。图2中的a～e分别为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0mg/L TDZ浓度的培养皿中愈伤组织生长状况。经4周观察后，仍没有出现再生芽分化，说明TDZ对胚性愈伤组织的诱导有积极作用，未出现再生芽分化可能是与配方中其它激素浓度相关。

表2

实施例3

本实施例与实施例1、实施例2中所使用的试验方法相同，重复的内容不再赘述。

在本实施例中，主要目的是探究6-BA对胚性愈伤组织诱导的影响。

本实施例中采用1.0～5.0mg/L的6-BA进行对照试验。本实施例提供五组培养基，每个编号对应的成分为：

a.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

b.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

c.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

d.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+4.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA；

e.1/2MS基础培养基+2.0mg/L TDZ+5.0mg/L 6-BA+0.1mg/L GA+0.5mg/L IBA。

由表3和图3可知，不同浓度的6-BA均可诱导产生胚性愈伤组织，且诱导率随激素浓度的升高而提高，但在3mg/L时达到顶峰，说明1/2MS、3.0mg/L 6-BA、2.0mg/L TDZ、0.5mg/L IBA和0.1mg/L GA为元宝枫胚性愈伤组织诱导的最佳培养基。但是在两次继代培养后仍未产生分化芽，这意味着元宝枫胚性愈伤组织的诱导条件已初步构建，但元宝枫体细胞胚发生的过程还需进一步探究。图3中的a～e分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L 6-BA浓度的培养皿中愈伤组织生长状况。

表3

胚性愈伤组织诱导与保持的关键在于其使用的培养基中的植物生长调节剂的浓度与配比。

实施例1中所示结果显示生长素IBA整体表现优于IAA。实施例2中所示结果显示细胞分裂素TDZ对元宝枫胚性愈伤组织的诱导有积极作用。实施例3中所示结果显示不同浓度的6-BA均可诱导产生胚性愈伤组织，且诱导率随激素浓度的升高而提高。

基于上述实施例中的结果，本发明中涉及的一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法，包含以下步骤：

采集元宝枫茎段，将所述元宝枫茎段消毒处理后获得用于愈伤组织培育的外植体，将所述外植体置于初级愈伤组织诱导培养基表面，获得元宝枫的初级愈伤组织；选择健康的初级愈伤组织，将健康的初级愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中，健康的初级愈伤组织能够是白色、绿色或淡红色。

初级愈伤组织诱导培养基包含：1/2MS、2mg/L 2,4-D、0.3mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂和0.5g/L酸水解酪蛋白。

元宝枫茎段的消毒方法包含以下步骤：

胚性愈伤组织的继代培养方法包含以下步骤：

选择新生的胚性愈伤组织于胚性愈伤组织诱导培养基中培养，其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+0.5mg/L IBA+2.0mg/L TDZ+3.0mg/L 6-BA。

消毒后的所述茎段能够被分割为长度在2cm之间的无生长点小段，所述无生长点小段能够作为外植体于所述初级愈伤组织诱导培养基中培养。

0.5mg/L的IBA、2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的GA。

实施例4

本实施例与实施例1中所使用的试验方法基本相同，重复的内容不再赘述。

本实施例用于对元宝枫多次继代培养后的胚性愈伤组织进行不同类型愈伤组织的探究。

茎段新诱导出的愈伤组织多呈白色或绿色，但若长时间不进行继代培养，愈伤组织会逐渐发黄最终成为松软的团状，直至褐化后死亡。

将元宝枫初级愈伤组织接种到胚性愈伤组织培养基上，每14d继代培养一次，多次继代培养后可见6种类型的愈伤组织：第I类为白色松软状愈伤组织(图4A)，生长极快，整体呈现水渍样，继代培养后基本无褐化，也未发生转变；第II类为白色颗粒状愈伤组织(图4B)，生长旺盛，多次继代培养后会向III、V类型愈伤组织转变；第III类为绿色松软状愈伤组织(图4C)，生长较快，质地疏松；第IV类愈伤组织为绿色紧实愈伤组织(图4D)，生长缓慢，在后续继代培养中逐渐褐化死亡；第V类为绿色颗粒状愈伤组织(图4E)，生长旺盛，多次继代培养后依旧保持活力；第VI类为红色愈伤组织(图4F)，生长较缓，后续继代培养中多转变为IV类愈伤组织。

选择生长状态基本一致的长势良好的愈伤组织接种至1/2MS、2mg/L TDZ、0.5mg/LIBA和3mg/L 6-BA的培养基上，每14d继代培养一次。多次继代培养后可见6种愈伤组织：白色松软愈伤组织、白色颗粒愈伤组织、绿色疏松愈伤组织、绿色紧密愈伤组织、绿色颗粒愈伤组织、红色愈伤组织。

实施例5

本发明采用组织切片的方法观察不同时期不同类型的愈伤组织的细胞形态。

将制备好的六种愈伤组织切片进行镜检，发现绿色颗粒状愈伤组织可能为胚性细胞团，细胞排列紧密，体积小，细胞核多位于细胞中央(图5e)；白色颗粒状愈伤组织既有胚性细胞团，也有不规则且体积较大的无核细胞(图5b)，说明这类愈伤组织可能处于胚性和非胚性愈伤组织的中间状态；其余四类愈伤组织细胞体积大，排列松散，无明显的细胞核(图5a、c、d、f)，鉴定为非胚性愈伤组织。

将各类愈伤组织进行超薄切片观察后得出绿色颗粒状愈伤组织可能为胚性细胞团，白色颗粒状愈伤组织可能处于胚性和非胚性愈伤组织的中间状态，其余四种皆为非胚性愈伤组织。

实施例6

本发明提供的元宝枫的胚性愈伤组织诱导方法显著提高了元宝枫的体细胞胚发生率。

本发明提供了如上述的培育元宝枫的方法或用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导的培养基于元宝枫胚苗培养中的用途。

本发明提供了如上述的培育元宝枫的方法或用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导的培养基于提高元宝枫体细胞胚性转化率中的用途。

本发明中的元宝枫的胚性愈伤组织能够用于克服杂种胚的败育以获得稀有杂种、快速繁育特殊品种、降低嵌合体的形成以提高遗传转化效率。

通过本发明提供的诱导方法得到的元宝枫胚性愈伤组织能够被转接到体细胞胚分化培养基上，进行分化培养，得到体细胞胚。上述体细胞胚分化培养基能够为常规分化培养基。

选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后移栽到疏松透气的基质中。待元宝枫组培苗完全成活并开始生长后，将元宝枫组培苗移栽至大田。

需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。

Claims

1.一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包含以下步骤：

采集元宝枫茎段，将所述元宝枫茎段消毒处理后获得用于愈伤组织培育的外植体，将所述外植体于初级愈伤组织诱导培养基中培养，获得初级愈伤组织；

所述初级愈伤组织诱导培养基由以下组分构成：1/2MS、2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.3mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、7g/L琼脂和0.5g/L酸水解酪蛋白，

从所述初级愈伤组织中选择健康的初级愈伤组织，将健康的初级愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养，获得胚性愈伤组织，所述健康的初级愈伤组织的颜色是白色、绿色或淡红色，其中，

所述胚性愈伤组织诱导培养基选自以下组：

1/2MS+0.5mg/L吲哚丁酸+1.0mg/L噻苯隆+3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.1mg/L赤霉素；

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述元宝枫茎段的消毒方法包含以下步骤：

用洗涤灵浸泡，然后用水冲洗；

用酒精进行表面消毒，然后用水清洗；

转入次氯酸钠中浸泡，然后用水清洗。

3.根据权利要求1～2任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述方法还包括对经胚性愈伤组织诱导培养基培养获得的胚性愈伤组织进行继代培养的步骤，所述继代培养的方法包括以下步骤：

从经胚性愈伤组织诱导培养基培养获得的胚性愈伤组织中选择新生的胚性愈伤组织，将所选取的胚性愈伤组织于胚性愈伤组织继代用培养基中培养，其中，所述胚性愈伤组织继代用培养基选自以下组：

1/2MS+0.5mg/L吲哚丁酸+2.0mg/L噻苯隆+3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤；

1/2MS+3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+1.0mg/L噻苯隆+0.5mg/L吲哚丁酸。

4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织为绿色颗粒状或白色颗粒状。

5.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，将消毒后的所述茎段分割为长度在1～2cm之间的无生长点小段，将所述无生长点小段作为外植体于所述初级愈伤组织诱导培养基中进行培养。

6.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述继代培养每2～4周进行一次的频率进行继代培养，以维持稳定生长和增殖。

7.一种用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，

所述胚性愈伤组织诱导培养基选自以下组：

8.如权利要求1～6所述的方法或权利要求7所述的用于元宝枫的胚性愈伤组织诱导的培养基于元宝枫胚苗培养中的用途。