CN110896853B - 一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进枫香属植物体细胞胚胎(体胚)成熟的液体悬浮培养方法，属于林木组培技术领域，包括对枫香属植物的胚性愈伤组织进行体胚发生培养后接种于体胚液体成熟培养基中进行体胚的液体悬浮成熟培养。采用本发明的枫香属树种的体胚成熟悬浮培养方法促使枫香属植物体胚在液体培养基中正常成熟，在短时间内生产大量的枫香成熟体胚，成熟体胚经萌发，成苗效率高。本发明方法简便，再生周期短，繁殖系数高，移栽成活率高，出苗整齐一致，便于养护管理，节约人力及土地资源，生产成本低，不受季节限制持续获得再生植株，特别适用于枫香苗木产业化生产。

Description

一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及枫香体胚成熟的液体悬浮培养方法，属于林业行业中的细胞工程繁育技术领域。

背景技术

枫香属(Liquidambar spp.)树种是世界性重要林业资源，特别是枫香(Liquidambar formosana)和北美枫香(L.styraciflua)，二者具有较高经济价值、观赏价值和生态价值，且二者杂交获得的杂交枫香具有杂种优势。

枫香既可以通过有性繁殖也可以通过无性繁殖，近年来随着扦插技术和组培快繁技术的不断进步，枫香无性繁殖效率也有较大提高。

组织培养是一种高效的林木快繁技术，在诸多树种中被广泛应用，例如杨树、桉树、杉木等树种。除以离体快繁为目的外，器官离体再生技术也为开展林木遗传转化和离体染色体加倍研究提供了技术支持。目前，枫香属中的北美枫香开展的组培快繁研究较为深入，枫香属树种的组织培养研究工作者先后利用北美枫香和枫香胚轴、子叶、花序轴、叶片、叶柄等器官建立了组培再生或体胚发生体系。例如Sommer和Brown利用北美枫香胚轴切段进行体胚诱导，随后美国佐治亚大学Merkle团队分别用北美枫香和杂交枫香未成熟胚和花序轴成功建立了北美枫香和杂交枫香体胚发生体系，完成对胚性愈伤组织的悬浮培养，使得胚性组织增殖，并进行了体胚同步化的研究(Merkle，Neu et al.1998；Vendrame，Holliday et al.2001；Merkle，Battle et al.2003)。又如Brand和Lineberger(1988)报道用北美枫香叶片和叶柄进行分化，获得再生植株。Kim，Sommer等(1997)以离体下胚轴为研究材料，建立了北美枫香不定芽再生体系。南京林业大学施季森团队对枫香的组培离体快繁做了较为全面的研究，该团队(2003)分别利用茎尖、叶片和叶柄、下胚轴、雄花序轴、未成熟胚为外植体开发出成套枫香组培技术。许林(2008)以离体叶片为材料，建立了枫香不定芽再生体系。龚峥、王洪峰等(2012)利用嫩芽进行不定芽诱导，并对IBA和NAA等生根的条件进行了探索。

枫香属离体器官再生繁殖方法的研究众多。在诸多无性离体繁殖方法中，体胚技术具有彻底幼化，繁殖效率高等特点，但是由于直接将枫香属植物的胚性组织转移到液体成熟培养基中，植物细胞难以从增殖状态直接转为体胚发育成熟状态，从而导致枫香属植物体胚在液体培养基中不能成熟。因此，现有促进枫香属植物体胚成熟的技术必须全程使用固体成熟培养基。然而枫香属植物体胚在固体培养基上成熟时，只有在胚性组织表面的胚胎能成熟。由于接触培养基的程度不同，胚胎发育成熟的同步性较差。固体培养基上成熟的体胚一般基部与胚性组织相连。由于植物组织较干，多个体胚很难分开，不利于工业化生产，也不利于同步化筛选和继后的萌发。

发明内容

本发明的目的是针对现有枫香属树种的组织培养快速繁殖方法中存在枫香属植物体胚在液体培养基中不能正常成熟，导致液体培养的优点在体胚成熟阶段不能体现，用现有技术生产枫香属植物体胚苗效率低，生产成本较高的技术缺陷，本发明提供一种促进枫香属植物体胚(体细胞胚胎)成熟的液体悬浮培养方法，本发明方法能促进枫香属植物体胚在液体培养基中正常成熟，并在其后的培养阶段转化为体胚苗，本发明方法能高效生产成熟体胚，成熟体胚的生产量大，降低生产成本，能对成熟体胚进行筛选；进行同步化管理体胚发育；提高后续体胚萌发的一致性。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法，包括对枫香属植物的胚性愈伤组织进行体胚发生培养后接种于体胚液体成熟培养基中进行体胚的液体悬浮成熟培养。

其中，所述枫香属植物为枫香、北美枫香或杂交枫香。

特别是，所述杂交枫香为(北美枫香×枫香)。

其中，所述体胚液体成熟培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L。

特别是，所述体胚的液体悬浮培养的培养条件为：置于(25±2)℃条件下，摇床上暗培养。

其中，所述体胚发生培养使用的培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3-6g/L。

特别是，所述体胚发生培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，暗培养。

本发明另一方面提供一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法，包括如下步骤：

1)将枫香属植物外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养，获得胚性愈伤组织；

2)将胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚；

3)将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，获得成熟体胚。

其中，步骤1)中所述外植体为未成熟种子胚胎、成熟种子胚胎、花序轴中的一种或多种，优选为未成熟种子胚胎。

本发明的枫香属植物的外植体按照文献(W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somatic embryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行灭菌、消毒处理。

特别是，步骤1)中所述诱导培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 1-4mg/L+6-BA0-2mg/L。

尤其是，所述胚性组织诱导培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度25±2℃；培养时间为3-4周。

特别是，还包括对胚性愈伤组织进行继代培养，每3-4周继代培养一次。

尤其是，胚性组织继代培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L。

特别是，继代培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为3-4周。

特别是，还包括步骤1A)，将步骤1)培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养，获得增殖培养后的胚性愈伤组织后再进行所述的体胚发生培养。

其中，步骤1A)中所述胚性愈伤组织增殖培养为将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织固体增殖培养基上，进行胚性愈伤组织固体增殖培养；或将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织液体增殖培养基上，进行胚性愈伤组织液体增殖培养。

特别是，所述胚性愈伤组织固体增殖培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L，优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0.25-1mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

尤其是，所述胚性愈伤组织固体增殖培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为3-4周。

特别是，所述胚性愈伤组织液体增殖培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1.0mg/L，优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0.25-1mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

尤其是，所述胚性愈伤组织液体增殖培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；摇床100-120转/分；培养时间为3-4周。

其中，步骤2)中所述体胚发生培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3-6g/L。

特别是，所述体胚发生培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为1-4个月，优选为1-2个月。

尤其是，所述未成熟体胚为初步发育的体胚，

特别是，所述未成熟体胚包括从球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚。

尤其是，所述未成熟体胚为球形胚或/和心型胚。

特别是，所述未成熟体胚为增殖胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，于(25±2)℃，黑暗条件下培养1-4个月后的体胚。

其中，步骤3)中所述体胚液体成熟培养基是改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。

特别是，所述体胚液体成熟培养的培养条件为：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；摇床100-120转/分；培养时间为4-8周。

尤其是，在体胚成熟培养过程中，还包括对具有初期体胚的愈伤组织进行继代培养，每3-4周继代培养一次。

特别是，还包括步骤3A)，将经过体胚液体成熟培养的混合物通过孔径大于1mm的筛子，未通过筛孔的体胚，即为成熟体胚。

尤其是，所述筛子的孔径为1-5mm，优选为2-4mm。

本发明在一方面提供一种杂交枫香的繁殖方法，包括对杂交枫香的胚性愈伤组织进行体胚发生培养后再进行液体悬浮成熟培养。

本发明又一方面提供一种杂交枫香的繁殖方法，还包括如下步骤：

A)将灭菌的杂交枫香的外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养；

B)将诱导培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养；

C)将增殖培养后的胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚；

D)将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，获得成熟体胚；

E)将成熟体胚接种到萌发培养基上，进行体胚萌发培养，获得体胚苗；

F)对体胚苗进行炼苗，温室培养，移栽。

枫香属植物体胚在固体培养基上成熟时，只有在胚性组织表面的胚胎能成熟，体胚发育同步性较差，而且成熟的胚胎的基部与胚性组织相连，不易分离；另外由于植物组织较干，多个体胚混杂在一起，难分开，不利于工业化生产，也不利于同步化筛选和继后的萌发；而且枫香属植物体胚在液体培养基中不能正常成熟，不能获得成熟的体胚体胚。

与现有枫香属植物的组织培养繁殖方法相比，本发明具有如下优点：

1、本发明方法克服了现有枫香属植物的愈伤组织不能在液体培养基中正常发育为成熟体胚的技术缺陷，本发明方法在体胚培养过程中分两个阶段进行体胚的成熟培养，促使枫香属植物体胚在液体培养基中正常成熟，并在其后的培养阶段转化为体胚苗，而且成熟体胚苗生产效率高。

本发明的体胚培养技术过程分成两个阶段：第一阶段的主要作用是在固体成熟培养基(即体胚发生培养基)上启动体胚的成熟过程，胚性组织在固体体胚发生培养基上从愈伤组织增殖状态转向体胚发育状态。第二阶段的主要作用是在液体成熟培养基中促进体胚进一步生长，直至完全成熟。

第一阶段：胚性愈伤组织在固体体胚发生培养基上启动体胚的成熟过程，如果直接将胚性组织放在液体成熟培养基中培养，则很难促进体胚在液体中发育成熟。本发明方法首先能保证将胚性组织从增殖状态转向体胚发育的过程；其次是在体胚成熟培养开始前，从体胚发育形态上区分，选出已具初期微小体胚(球形胚和心形胚)的胚性愈伤组织进入液体成熟培养，从而保证植物组织的质量和体胚生产的高效率。

第二阶段：促进体胚进一步生长，直至完全成熟。成熟胚又叫子叶胚，体积数倍至数十倍于球形胚和心形胚，具有两片发育良好的子叶。本发明方法中第一阶段体胚发生培养的微小的发育初期体胚在液体成熟培养中能全方位接触培养基从而快速生长；而且液体培养成本低，效率高，特别适宜规模化生产；并且在液体培养基中成熟的胚胎是独立、分散的，有利于筛选和后期的处理。

2、本发明方法用液体培养能高效生产成熟体胚,即在更短的时间里生产更多的成熟体胚，成熟体胚萌发培养，获得更多的体胚苗，进而提供更多的造林用枫香苗；

3、采用本发明方法显著降低了枫香属植物繁殖的生产成本；

4、采用本发明的液体成熟培养，使得枫香属植物的体胚发育能进行同步化处理，使体胚发育能更加同步，便于后续的培养和管理。

5、本发明方法中采用液体培养基进行体胚的成熟培养，成熟体胚在液体培养基中呈独立、分散状态，对成熟体胚采用筛子进行筛选，获得大量彼此独立的、发育成熟且发育程度一致或相近的体胚，避免了采用固体培养基进行成熟培养形成的体胚不易分离的缺陷。

6、本发明方法中使用筛子筛选获得合格的发育程度相同或基本相同的成熟体胚，除去其他组织。而在液体中使胚胎成熟的技术使筛选成为可能。用筛子筛选在液体培养基里成熟的体胚，操作方便容易，效率高。本发明方法在无菌条件下让液体培养的成熟体胚和液体培养基一起过筛，留在筛子里不能通过筛孔的胚胎为成熟胚胎，通过筛孔的体胚继续进行体胚成熟培养，直至成熟。

附图说明

图1为杂交枫香胚性愈伤组织；

图2为体胚发生培养时枫香胚性组织(黄色)和发育初期的体胚(白色)；

图3为图2中部分未成熟体胚的放大图；

图4为体胚液体成熟培养获得的成熟体胚；

图5为体胚液体成熟培养获得的成熟体胚放大图：左)成熟子叶胚；右)萌发中的体胚；

图6A为单个成熟体胚接种于装有萌发培养基萌发、转化成具有活跃生长端的体胚苗；

图6B为萌发转化的体胚苗在萌发培养基的培养瓶内生长图；

图7为炼苗处理后的温室下杂交枫香体胚幼苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验方法

本发明实施例参照下列已发表学术论文中的方法：W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation of hybrid sweetgum(Liquidambarstyraciflua×L.formosana)by somatic embryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695。

二、试验材料

1、杂交枫香未成熟种子

本发明以杂交枫香(北美枫香为母本，枫香优树为父本)的未成熟种子为外植体实验材料。

于每年6,7月，采集杂交枫香(北美枫香×枫香)未成熟的球形蒴果，从中取出种子，作为外植体材料。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节剂采用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。

3、培养基

(1)改良的Blaydes培养基(Merkle et al.,1998)

表1 改良Blaydes培养基的配方

改良的Blaydes培养基为基本培养基，根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液成分和称量好的植物凝胶、蔗糖、水解酪蛋白，pH调整至5.8。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。

改良的Blaydes培养基基本配方参考：Merkle SA,Neu KA,Battle PJ,BaileyRL.1998.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature andmature tissues of sweetgum(Liquidambar styraciflua).Plant Science(1998)132:169-178.

(2)诱导培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 1.0–4.0mg/L+6-BA0-2.0mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(2A)继代培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2.0mg/L+6-BA 0-1.0mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(3)胚性组织固体增殖培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2.0mg/L+6-BA 0-1.0mg/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(4)胚性组织液体增殖培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2.0mg/L+6-BA0-1.0mg/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(5)体胚发生培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3-6g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(6)体胚液体成熟培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟

(7)萌发培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

4、培养条件

(1)胚性组织的诱导培养、继代培养、增殖固体培养的培养条件：黑暗条件，培养温度(25±2)℃。

(2)胚性组织增殖液体培养的培养条件：三角瓶，黑暗条件，培养温度(25±2)℃，摇床(100-120转/分)。

(3)体胚发生培养：置于(25±2)℃条件下，暗培养。

(4)体胚液体成熟培养：三角瓶，置于(25±2)℃条件下，暗培养，摇床(100-120转/分)。

(5)体胚萌发培养：培养瓶，置于(25±2)℃条件下，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux；培养时间为6-8周。

实施例2

1、外植体的灭菌

按照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somaticembryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行外植体的灭菌。

2、胚性愈伤组织诱导培养

按照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somaticembryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行胚性愈伤组织诱导培养。图1为从未成熟杂交枫香种子胚诱导的胚性愈伤组织。

外植体未成熟合子胚在诱导培养基上培养3-4周后，胚性组织的生长速度开始变慢且外植体开始褐化，此时将胚性组织选出进行继代培养，转至继代培养基上于黑暗条件下、(25±2)℃，进行重复继代培养(每3周继代培养一次)。

3、胚性愈伤组织增殖培养

将继代培养后的典型胚性愈伤组织接种于胚性愈伤组织固体增殖培养基上，在黑暗条件下进行杂交枫香胚性愈伤组织增殖培养，其中，培养温度为(25±2)℃，固体增殖培养基中，所用2,4-D为1.0mg/L，6-BA为0.5mg/L，水解酪蛋白1g/L，蔗糖40g/L，植物凝胶3g/L，在杂交枫香胚性愈伤组织增殖培养过程中每3-4周继代一次，在培养皿中，获得大量的增殖的杂交枫香胚性增殖愈伤组织。

胚性组织增殖培养条件：25±2℃，暗培养，继代周期为3～4周。

4、体胚发生培养

将增殖培养的杂交枫香胚性组织接种到体胚发生培养基上，在黑暗条件下进行体胚的发生培养，其中，培养温度为(25±2)℃，体胚发生培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3g/L。杂交枫香在体胚发生培养过程中，观察体胚的生长状况和形态，在增殖愈伤组织上形成未成熟体胚(即从初步发育的球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚)，体胚发生培养2个月(通常为1至4个月)后，获得具有初步发育体胚的愈伤组织，即胚性愈伤组织在体胚发生培养基上培养，转化成在肉眼下表面呈白色或淡黄色，体视镜下可以观察到大量微小的位于球形胚或/和心形胚发育阶段的初期体胚(即“球形体胚和心形体胚”)(如图2、图3)，图2中黄色为体胚发生培养中杂交枫香胚性组织，白色为发育初期的体胚(“初期球形、心形体胚”)，图3为图2中部分未成熟体胚的放大图(球形胚、心形胚、鱼雷形胚)。

本发明以体胚发生培养基上培养获得体细胞的“初期体胚”，初步发育的体胚，又可称为球形胚或心型胚为例进行说明。本发明中除了初期球形或心形体胚之外，其他在体胚发生培养基上培养得到的未成熟体胚(从球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚)均适用于本发明

本发明的体胚发生培养主要是启动愈伤组织向体胚转化，用固体发生培养基启动体胚成熟的过程。胚性组织在固体发生培养基上更容易从组织增殖状态转向体胚发育。直接将胚性组织放在液体成熟培养基中培养，则很难促进体胚在液体中发育。本发明体胚发生培养既能保证将胚性组织从增殖状态转向体胚发育的过程，又能在第二个阶段(即体胚成熟阶段)开始前能从形态上区分，筛选出已具有初期微小体胚的组织进入液体成熟培养(非胚性组织不用)，从而保证植物组织的质量和体胚生产的高效率。

5、体胚液体成熟培养

将在体胚发生培养基上培养得到的具有未成熟体胚(优选为“初期球形或/和心形体胚”)的胚性愈伤组织选出，接种于体胚液体成熟培养基中，体胚液体成熟培养基置于三角锥形瓶内，接种量为每100ml体胚成熟液体培养基中接种2g(通常为1-5g/100ml)，在摇床上进行体胚的悬浮成熟培养。杂交枫香体胚的成熟培养在黑暗条件下进行，其中，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转，体胚液体成熟培养基与体胚发生培养基相同，但不包含植物凝胶，即：改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。

杂交枫香体胚液体成熟培养4-8周后获得成熟体胚(即成熟胚或后期子叶胚)，观察体胚的生长状况和形态，成熟体胚体积增大，体积数倍至数十倍于球形胚和心形胚，每个成熟体胚具有两片发育良好的子叶.成熟体胚在液体培养基中呈独立、分散状态(如图4)，图5为体胚液体成熟培养获得的成熟体胚：左)成熟子叶胚；右)萌发中的体胚。

通常，枫香体胚液体成熟培养过程中每3-4周更换新培养基，进行继代培养，以提供充足的营养成分以保证体胚的持续生长、成熟。

在50ml液体成熟培养基中接种2g经体胚发生培养处理的胚性组织，4-8周液体成熟培养后，每50ml中平均得到1106个成熟体胚。胚性组织在发生培养阶段已开始的幼小胚胎会不断长大成熟，故繁殖系数大，操作容易，所需人工少。

本发明中杂交枫香体胚液体成熟培养的主要作用是在液体成熟培养基中促进体胚生长，直至完全成熟。成熟体胚的体积比接种时的初期幼小体胚显著增大，成熟体胚具有两片发育良好的子叶，如图5左侧的成熟子叶胚。

1)本发明方法使杂交枫香体胚在液体中发育成熟成为可能，从而使该系统具有液体培养的多重优势；2)本发明采用促进体胚成熟的两步法，在第1步培养(即体胚发生培养)结束时，根据组织形态选择具多个胚胎的组织进行第2步培养(即体胚液体成熟培养)，从而能保证植物材料的质量；3)幼小体胚在第2步液体成熟培养中能全方位接触培养基从而快速生长，绝大部分幼小体胚都能发育成熟，繁殖率高；4)杂交枫香体胚液体成熟培养具有培养基成本低，人工操作容易，生产效率高的特点；5)在液体中成熟的胚胎大多是分散的，有利于同步化处理及后期的使用。

6、体胚萌发培养

6-1、选择孔径为1-5mm(通常为≥1mm)的筛子，高温灭菌后，在无菌条件下让液体培养的成熟体胚和液体培养基一起通过筛子。选择1-5mm留在筛子里不能通过筛子孔的胚胎为成熟胚胎；通过筛子的胚胎在液体成熟培养基里继续培养，直至长大成熟，；筛选后获得成熟体胚如图4，成熟体胚呈独立、分散状态。

使用筛子筛选体胚的目的是为了获得合格的成熟体胚，除去其他组织。筛子筛选的作用是将成熟体胚与其他组织分开。用筛子筛选液体成熟体胚，操作方便容易，效率高，而且经筛子分离得到发育程度相同或基本相同的成熟胚，在后续进行体胚萌发培养过程中，体胚萌发时间相一致，出苗的尺寸相近，提高处理效率。

6-2、将筛选到的成熟体胚接种于装有萌发培养基(Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3g/L)的培养基瓶或培养皿内，于25±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux条件下培养，成熟体胚的子叶在光下很快变绿，下胚轴伸长生长，出现根的生长端，根伸长生长；培养2-3周后其另一顶端的子叶展开，真叶生长，形成具有两个活跃生长端的体胚苗(如图6A)，培养瓶内培养6-8周后体胚苗(如图6B)。

在萌发培养基上体胚出现根生长，即为体胚的萌发；而成熟体胚进一步发育为具有茎尖和根尖生长的完整植株的过程为体胚向体胚苗的转化(转苗)。

经选择合格的液体成熟体胚的：萌发率(％)＝100；转苗率(％)＝93.3。

体胚的萌发率和体胚转苗率的计算公式如下：

体胚萌发率(％)＝萌发的体胚数/接种的体胚数×100

体胚转苗率(％)＝成熟体胚苗数/接种的体胚数×100

在体胚萌发培养过程中，每次处理接种优选体胚10个，重复处理3次。

7、炼苗，培养为成品体胚苗

体胚苗长到2厘米高，根较粗壮时，打开培养瓶瓶盖，在移栽室中培养1-3天后，取出植株，用自来水洗净试管苗根部残留的培养基，移栽到枫香无土栽培基质(珍珠岩、蛭石，珍珠岩与蛭石的体积之比为1:1)中，在移栽炼苗室进行容器培养。移苗后两周内保持相对湿度为90-70％，培养温度25±5℃，两周炼苗后，在温室环境继续生长，得到杂交枫香体胚幼苗(如图7)。进一步培养得到杂交枫香体胚成品苗。

实施例2A

除了步骤3、胚性愈伤组织增殖培养过程中，将继代培养的杂交枫香的典型胚性愈伤组织接种于胚性愈伤组织增殖液体培养基中，悬浮培养，接种量为每100ml胚性愈伤组织增殖液体培养基中2-4g；在黑暗条件下进行杂交枫香胚性愈伤组织的液体增殖培养，其中，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转，胚性愈伤组织增殖液体培养基中所用2,4-D为0.5mg/L，6-BA为0.25mg/L，酶水解酪蛋白1g/L，蔗糖40g/L；在杂交枫香胚性愈伤组织增殖培养过程中每3-4周继代一次，即每3-4周开始新培养，即加入90％新鲜培养基，并保持接种量为2-4％，在不同的基因型中每周期增殖量为接种量的1.5-4倍，根据胚性愈伤组织的需求和基因型决定增殖培养的周期数，获得大量的增殖的杂交枫香胚性增殖愈伤组织之外，其余步骤与实施例2相同。

对照例

将实施例2步骤4)进行增殖培养获得的杂交枫香胚性增殖愈伤组织直接接种到体胚液体成熟培养基中，即不进行体胚发生培养，而是直接进行液体摇床悬浮培养，接种量为每100ml体胚液体成熟培养基中接种样本量为2-4g，培养条件与实施例2步骤5-2)相同，在黑暗条件下，(25±2)℃，每分钟100-120转。

在这种悬浮培养中，观察体胚的生长状况和形态，期间胚性组织开始增生，颜色变浅，但体胚很难在液体中开始发育。培养8-12周(继代3-4次)之后，未观察到形态正常的球形胚或心形胚，也未观察到发育良好的子叶胚(即成熟体胚)，故直接将胚性组织放在液体成熟培养基中培养，不能获得正常发育成熟的体胚。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法，其特征是，包括如下步骤：

1）将枫香属植物外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养，获得胚性愈伤组织；

2）将胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚，其中所述未成熟体胚包括从球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚，其中所述体胚发生培养基为改良Blaydes基本培养基 +蔗糖 40 g/L+ 植物凝胶 3-6 g/L；

所述改良Blaydes基本培养基为：

KNO₃ 1000 mg/L KI 0.6 mg/L

MgSO₄.7H₂O 71.5 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025 mg/L

KH₂PO₄ 300 mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L

CaCl₂.2H₂O 210 mg/L CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L

KCl 71.5 mg/L Na₂EDTA·2H₂O 37.2 mg/L

NH₄NO₃ 1000 mg/L FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O 500 mg/L 肌醇 2 mg/L

MnSO₄·4H₂O 6.06 mg/L 烟酸 0.1 mg/L

ZnSO₄·7H₂O 4 mg/L 维生素B6 0.1 mg/L

H₃BO₃ 2 mg/L 维生素B1 1 mg/L；

3）将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，将经过体胚液体成熟培养的混合物通过孔径大于1mm的筛子，未通过筛孔的体胚，即为成熟体胚，其中所述体胚液体成熟培养基是改良的 Blaydes 培养基+蔗糖40g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，还包括步骤1A），将步骤1）培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织后再接种到体胚发生培养基上，进行所述的体胚发生培养。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是，步骤1A）中所述胚性愈伤组织增殖培养为将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织固体增殖培养基上，进行胚性愈伤组织固体增殖培养；或将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织液体增殖培养基中，进行胚性愈伤组织液体增殖培养。

4.一种杂交枫香的繁殖方法，其特征是，包括如下步骤：

A）将灭菌的杂交枫香的外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养；

B）将诱导培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养；

C）将增殖培养后的胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚，其中所述未成熟体胚包括从球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚；所述体胚发生培养基为改良Blaydes基本培养基 +蔗糖 40 g/L+ 植物凝胶 3-6 g/L；

所述改良Blaydes基本培养基为：

KNO₃ 1000 mg/L KI 0.6 mg/L

MgSO₄.7H₂O 71.5 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025 mg/L

KH₂PO₄ 300 mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L

CaCl₂.2H₂O 210 mg/L CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L

KCl 71.5 mg/L Na₂EDTA·2H₂O 37.2 mg/L

NH₄NO₃ 1000 mg/L FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L

Ca(NO₃)₂·4H₂O 500 mg/L 肌醇 2 mg/L

MnSO₄·4H₂O 6.06 mg/L 烟酸 0.1 mg/L

ZnSO₄·7H₂O 4 mg/L 维生素B6 0.1 mg/L

H₃BO₃ 2 mg/L 维生素B1 1 mg/L；

D）将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，将经过体胚液体成熟培养的混合物通过孔径大于1mm的筛子，未通过筛孔的体胚，为成熟体胚，其中所述体胚液体成熟培养基是改良的 Blaydes 培养基+蔗糖40g/L；

E）将成熟体胚接种到萌发培养基上，进行体胚萌发培养，获得体胚苗；

F）对体胚苗进行炼苗，温室培养，移栽。

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