CN114532227A - 一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法，通过以百子莲无菌苗幼根的根尖为外植体，使用含PIC、KT、NAA的MS培养基诱导愈伤组织，解决了组织培养时间受限的问题，实现了80％～100％的高诱导率；并通过含6‑BA、NAA和石墨烯量子点的MS培养基增殖根系愈伤组织，培养15天后的增殖率达到124.50％。为优质种苗产业化生产拓展了新的外植体类型和外源添加物种类。

Description

一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法

技术领域

本发明涉及一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法。

背景技术

早花百子莲(Agapanthus praecox，以下简称百子莲)，是石蒜科(Amaryllidaceae)百子莲属(Agapanthus)的多年生草本植物，原产非洲南部区域，喜阳光丰沛、气候温和的环境。百子莲根系发达，肉质根茎强壮，可以有效地防风固沙、减少水土流失和降低环境污染，有着重要的生态功能。近年来，百子莲作为新优花卉资源在我国东部和南部的辽阔疆域大幅推广应用，在花境、花海、公园绿地、屋顶花园和道路隔离带等各类园林中大放异彩，有着较大的发展潜力和应用空间。

百子莲于2002年引入我国亚热带地区后，因受积温影响不易结实，其分株繁殖速度慢且长势不一致。组织培养成苗时间短、繁殖速率快，广泛应用在百子莲优良性状保持、优质种苗高效生产、诱变育种和转基因遗传改良等领域，是商业化水平最高的植物离体繁殖方法之一。目前百子莲组织培养主要分为器官发生和体细胞胚胎发生两种途径，每种途径又分为直接发生和间接发生两种方式。愈伤组织的诱导是间接器官发生和间接体胚发生的关键环节。因此，快速获得状态良好、活力旺盛的愈伤组织对百子莲组织培养具有重要意义。

目前百子莲多用小花梗进行愈伤组织诱导，该外植体消毒操作简单，脱分化容易，但采集时间严重受花期制约，每年仅6月份前后的百子莲花蕾期可以取材，外植体取材周期较短，且花苞开裂后会大大增加灭菌的难度，降低诱导效率。

中国专利申请号201910060531.2公开一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，然而百子莲叶片作为外植体也可以诱导愈伤组织，取材相对方便，但是分化程度较高，含有的酚类物质较多也易导致褐化，增加组培难度。而单子叶植物花卉百子莲具有根系发达这一特点，以无菌苗根尖为外植体进行愈伤组织诱导，脱分化容易并可实现随时取材，能够克服小花梗采集受花期制约及叶片容易污染褐化等瓶颈问题，有效扩充了外植体来源，大大提高了愈伤组织诱导效率。

发明内容

本发明的目的是克服现有组织培养外植体来源受限的难题，提供一种以百子莲根尖作为外植体诱导、增殖愈伤组织的方法。本发明以根尖作为外植体，能够突破原有以小花梗及叶片作为外植体，其采集时间有限、诱导率低的局限性。本发明进一步优化了激素配比，将纳米材料GQDs应用于植物组培中，提高增殖速率，拓宽了纳米材料在植物组织培养中的应用。

本发明通过以下技术方案实现研究目的：

本发明提供了一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法，包括如下步骤：

A、无菌苗的获得：取百子莲种子进行消毒处理后，接种到种子萌发培养基，萌发后转入生根培养基，获得无菌苗；

B、愈伤组织的诱导：取步骤A获得的无菌苗的根尖的小段作为外植体，将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养；

C、愈伤组织的增殖：取经步骤B诱导后获得的愈伤组织放置在增殖培养基中增殖培养，获得愈伤组织块。

所述增殖培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.05～0.25mg·L^-1NAA、0.05～0.4g·L^-1GQDs、0.2～0.3％(w/v)植物凝胶，pH为5.8～6。

优选的，所述增殖培养基的配方为：4.33g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、1.0mg·L^-16-BA、0.1mg·L^-1NAA、0.05g·L^-1GQDs、0.3％(w/v)植物凝胶，pH为5.8。

步骤A中，消毒方法具体为，无菌水清洗，然后无菌水浸泡20～30min，75％(v/v)酒精表面杀菌50～90s，之后无菌水冲洗，之后采用NaClO和纳米银水溶液处理，再用无菌水冲洗4～6次。

所述NaClO和纳米银水溶液处理的步骤具体为，10～20％NaClO表面杀菌10～20min，无菌水冲洗，再用20～60mg·L^-1纳米银水溶液处理10～20min，无菌水冲洗。

所述种子萌发培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.6～1.0％(w/v)琼脂，所述培养基pH为5.8～6。

优选的，所述种子萌发培养基的组分包括：4.33g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂，所述培养基pH为5.8。

所述生根培养基的组分为：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.1～0.2mg·L^-1IBA、0.5～0.8％(w/v)琼脂，pH为5.8～6。

优选的，所述生根培养基的组分为：2.17g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、0.15mg·L^-1IBA、0.5％(w/v)琼脂，pH为5.8。

所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、2.0～3.0mg·L^-1PIC、1.0～1.5mg·L^-1KT、0.05～0.1mg·L^-1NAA、0.2～0.4％(w/v)植物凝胶，pH为5.8～6。

进一步，所述愈伤组织诱导培养基配方为：4.33g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、2.0mg·L^-1PIC、1.5mg·L^-1KT、0.1mg·L^-1NAA、0.3％(w/v)植物凝胶，pH为5.8。

所述步骤A中，所述百子莲的种子为当年采收的千粒重6.60～6.80g的饱满干燥种子。干瘪潮湿的种子不易萌发且内生菌复杂，较难获得无菌苗；所述百子莲为2～3年生百子莲。

所述步骤B中，外植体为从距离根尖1.0～1.5cm处垂直横切获得的组织块。

种子萌发和生根的条件为：温度23～27℃，相对湿度65～85％，光照10～14h/黑暗10～14h，光照强度2000～3000lx。

优选地，步骤A中，所述消毒处理的方法是：无菌水清洗2次，无菌水浸泡20min，75％(v/v)酒精表面杀菌1min，无菌水冲洗3次，NaClO和纳米银水溶液处理，无菌水冲洗6次，吸干种子水分，置于种子萌发培养基中培养45～60天，然后转入生根培养基中培养。

优选地，所述NaClO和纳米银水溶液处理的方法是：10～20％NaClO表面杀菌10～20min，无菌水冲洗3次，再用20～60mg·L^-1纳米银水溶液处理10～20min，无菌水冲洗6次。

更优选地，步骤A中，所述NaClO和纳米银水溶液处理的方法是：15％NaClO表面杀菌20min，无菌水冲洗3次，再用40mg·L^-1纳米银水溶液处理15min，无菌水冲洗6次。

优选地，所述无菌苗萌发生根及愈伤组织诱导增殖的培养基的制备方法包括以下步骤：

每升ddH₂O中加入4.33g MS固体培养基干粉，溶解后加入蔗糖和实验所需浓度的植物激素溶液，调节pH值为5.8，加入固化剂；获得的培养基在高压蒸汽灭菌锅中以121℃、0.11MPa压力下灭菌20min，取出后将培养基置于超净工作台上，分装至90mm×18mm玻璃培养皿中，冷却凝固备用。

步骤B中，所述无菌苗平均根长超过2cm，直径1.0～2.0mm，根系呈现白绿色。

优选地，步骤B中，所述根尖需用解剖刀从距离根尖顶端1.0cm左右处垂直横切获得；所述诱导培养条件为：温度23～27℃，相对湿度40～50％，暗培养45～55天。

步骤C中，所述继代培养条件为：温度23～27℃，相对湿度40～50％，光照条件为暗培养，时间为25～35天转接一次。

本发明中所述无菌苗是利用表面灭菌后的种子，在适宜的人工条件下，培育而成的完整植株。

本发明中所述愈伤组织(Callus)是指植物局部受到刺激之后，在伤口表面新生的组织。它是由生活的具有全能性薄壁细胞组成，可继续分化为植物的任何组织和器官。

本发明在研究中发现，利用从幼苗中分离出来的根尖作为植物再生的外植体，能够产生较多的初级愈伤组织。这是因为根尖是由含有生长点的分生组织组成，内源生长素类物质含量较高，且细胞发育状态更容易去分化诱导产生愈伤组织，诱导率一般高于幼叶等分化程度更高的器官。未见报道诱导、增殖出能够进行不定芽分化的愈伤组织的成熟技术。

本发明在研究中进一步发现，纳米材料(Nano materials，NM)几何尺寸可以达到纳米级(1～100nm)，具有优于同类块状材料的某些微型高效的新特性。纳米银在控制植物组织培养污染上具有较好的应用效果。添加纳米银时，其颗粒直径极其微小，可以轻易地进入病原体，与菌体中蛋白质巯基结合；加之银离子可以使菌体中的蛋白质变性，进而达到良好的灭菌效果。

本发明进一步发现，石墨烯量子点(Graphene quantum dots，GQDs)是一种碳纳米材料，对愈伤组织具有良好的调节作用。

本发明利用百子莲根系发达的这一优势特点，以根尖为外植体研究建立愈伤组织诱导、增殖技术体系，可以极大地扩充外植体来源，对于快速、高效繁殖新优品种具有重要价值。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、百子莲在国内的离体快繁体系多以小花梗为外植体，但是百子莲花期较短，每年采集小花梗的时间受限，而本发明的无菌苗根尖可随时取材，且取材后的无菌苗可在生根培养基上快速生根，能够实现周而复始循环取材。

2、部分方法采用茎基部作为外植体，但是每株百子莲仅有一个茎基部，取材后植株死亡，生产成本较高；而本发明的取材外植体为根尖，可充分发挥百子莲根系极其发达的优良特性，有效地扩充外植体来源；以萌发60天左右的无菌苗为例，每株幼苗均有8～10个根尖。

3、采用叶片作为外植体，取材靠近茎基部较易出愈但会对植株造成不可逆损伤，并且叶片是分化程度较高的器官，其脱分化难度相对较大且所含酚类物质易导致外植体褐化；而本发明的取材外植体为根尖，其分裂旺盛，脱分化容易且再生迅速；切去根尖的无菌苗生长30天后便可再次取材。

4、本发明探究了不同种类及浓度配比的植物激素诱导百子莲根尖形成愈伤组织的效果差异，筛选出诱导率较高的几种培养基配方，其中4.33g·L^-1MS+2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8的培养基配方中的愈伤组织诱导率高达100％，极大地提高了百子莲种苗产业化生产效率。

5、本发明在愈伤组织增殖培养基中添加适宜浓度、比例的植物激素和纳米材料石墨烯量子点(GQDs)，可以显著提高和改善百子莲根系愈伤组织的增殖效率和状态，探究了碳纳米材料在组织培养中应用的可行性。

6、本发明以根系为外植体建立了愈伤组织诱导、增殖技术体系，可以快速高效地获得愈伤组织，不仅为进一步诱导百子莲不定芽和胚性愈伤组织提供了重要的材料保障，也为优质种苗产业化生产拓展了外植体新类型和外源物质种类。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1中种子萌发60天后无菌苗根系的图片；

图2为本发明实施例1中根尖外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养0、10、20天后的图片；

图3为本发明实施例1中根尖外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养45天后的图片；

图4为本发明实施例1中根尖愈伤组织在增殖培养基中扩繁60天后的图片；

图5为本发明实施例1中根尖愈伤组织经醋酸洋红染色后的细胞形态观察图片；

图6为本发明实施例1中根尖愈伤组织诱导成苗25、90天后(左、右)的图片；

图7为不同浓度GQDs对百子莲根系愈伤组织增殖效果影响的图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例和对比例中，所述植物凝胶，货号：71010-52-1，厂家：Sigma公司生产。

实施例1

本实施例提供了一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法，具体步骤如下：

1、无菌苗的获得：

选取饱满的、去除种翅的百子莲成熟种子100粒(所述百子莲的种子为当年采收的千粒重6.60g的饱满干燥种子)，放入50mL离心管中；将离心管置于超净工作台上，无菌水清洗2遍去除杂质；无菌水浸泡20min后倒掉；75％(v/v)酒精表面杀菌1min，期间不停晃动，无菌水冲洗3次后倒掉，然后加入15％NaClO表面杀菌20min，无菌水冲洗3次，再用40mg·L^-1纳米银水溶液处理15min，期间不停晃动，无菌水冲洗6次后倒掉，再用灭菌滤纸吸干种子的残余水分。将消毒后的种子接种到种子萌发培养基中进行萌发，每皿放置9粒种子，重复3次，培养皿放置于恒温培养箱中，温度23～27℃，相对湿度65～85％，光照10h/黑暗14h，光照强度2000lx；培养45天。

其中种子萌发培养基的组分包括：4.33g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂，所述培养基pH为5.8。

萌发后转入生根培养基，生根培养基组分包括：2.17g·L^-1MS+0.15mg·L^-1IBA+3％(w/v)蔗糖+0.6％(w/v)琼脂，pH5.8。每天光照14h/黑暗10h，光照强度为2500lx；相对湿度65～85％；培养温度为23～27℃。

2、愈伤组织诱导培养基的制备：

每升ddH₂O加入4.33gMS固体培养基(Sigma)干粉，溶解后加入2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA溶液(植物激素的母液浓度为100mg·L^-1，利用NaOH助溶)，蔗糖浓度为3％(w/v)，充分溶解后调节pH值为5.8，最后添加的植物凝胶浓度为0.3％(w/v)。培养基放置于高压蒸汽灭菌锅中以121℃、0.11MPa压力下灭菌20min。取出后将培养基置于超净工作台上，分装至90mm×18mm玻璃培养皿中，冷却凝固后备用。

3、愈伤组织的诱导：

取培养60天后的无菌幼苗材料(图1)，在超净工作台上选择直径1.0～2.0mm的根系，用解剖刀切下0.8～1.5cm的含根尖的小段，将根尖外植体小段平放方式接种于愈伤组织诱导培养基中培养，取材后的幼苗放入生根培养基。

愈伤组织诱导培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

培养条件：温度23～27℃，相对湿度40～50％，暗培养。

根尖接种至培养基10天后明显膨大，并逐渐脱分化出微黄色的愈伤组织，培养至20天时可以明显观察到大量愈伤组织的出现(图2)，愈伤组织诱导率可高达100％，选用诱导45天后的根尖愈伤组织(图3)进行增殖培养。

4、愈伤组织的继代：

取经愈伤组织诱导后获得的带有残留根尖组织的愈伤组织块，放置在愈伤组织增殖培养基上进行培养；

增殖培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+0.05g·L^{- 1}GQDs+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

培养条件：温度23～27℃，相对湿度40～50％，暗培养。培养15天后的增殖率高达124.50％，以30天为一个继代周期。继代培养后，愈伤组织大量增殖(图4)，可以进一步诱导成体细胞胚或转入光下培养成苗。

愈伤组织的细胞形态学观察：

参考醋酸洋红染色法。取适量增殖培养15天的愈伤组织于1.5mL离心管中，加入1mL醋酸洋红溶液以浸没愈伤组织，轻轻晃动使其与溶液充分接触。染色30min后去除红色染液，用蒸馏水重复冲洗愈伤组织至洗涤废液无色。用镊子夹取少许愈伤组织置于载玻片上，加1滴蒸馏水后小心盖上载玻片，注意不要产生气泡。用滤纸在载玻片周围吸取多余的液体，之后置于Olympus光学显微镜下，可以观察到愈伤组织细胞呈圆球状、排列规则，大小整齐，细胞核大而明显，细胞质较浓，淀粉粒等营养物质的积累较多(图5)。

愈伤组织成苗诱导验证：取生长状态良好的愈伤组织块，放置在成苗诱导培养基上进行培养，培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+1.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+1％(w/v)琼脂，pH5.8。培养条件：温度23～27℃，相对湿度30～40％，光照14h/黑暗10h，光照强度2500lx。25天后部分愈伤组织细胞团表面出现不定芽(图6左)，呈嫩绿色；90天后不定芽快速生长成苗(图6右)，幼叶上部绿色加深，下部为淡黄绿色，叶片直立生长，无菌苗生长健壮。

实施例2

本实施例提供了一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法，具体步骤如下：

1、无菌苗的获得：

选取饱满的、去除种翅的百子莲成熟种子100粒(所述百子莲的种子为当年采收的千粒重6.80g的饱满干燥种子)，放入50mL离心管中；将离心管置于超净工作台上，无菌水清洗2遍去除杂质；无菌水浸泡20min后倒掉；75％(v/v)酒精表面杀菌1min，期间不停晃动，无菌水冲洗3次后倒掉，然后加入15％NaClO表面杀菌20min，无菌水冲洗3次，再用40mg·L^-1纳米银水溶液处理15min，期间不停晃动，无菌水冲洗6次后倒掉，再用灭菌滤纸吸干种子的残余水分。将消毒后的种子接种到种子萌发培养基中进行萌发，每皿放置9～15粒种子，重复3～4次，培养皿放置于恒温培养箱中，温度23～27℃，相对湿度65～85％，光照14h/黑暗10h，光照强度3000lx；培养60天。

其中种子萌发培养基的组分包括：2.17g·L^-1MS固体培养基、2.0％(w/v)蔗糖、1.0％(w/v)琼脂，所述培养基pH为6。

萌发后转入生根培养基，生根培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+0.15mg·L^-1IBA+3％(w/v)蔗糖+0.8％(w/v)琼脂，pH6。每天光照14h/黑暗10h，光照强度为2500lx；相对湿度65～85％；培养温度为23～27℃。

2、愈伤组织诱导培养基的制备：

每升ddH₂O加入4.33gMS固体培养基(Sigma)干粉，溶解后加入2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA溶液(植物激素的母液浓度为100mg·L^-1，利用NaOH助溶)，蔗糖浓度为3％(w/v)，充分溶解后调节pH值为5.8，最后添加的植物凝胶浓度为0.3％(w/v)。培养基放置于高压蒸汽灭菌锅中以121℃、0.11MPa压力下灭菌20min。取出后将培养基置于超净工作台上，分装至90mm×18mm玻璃培养皿中，冷却凝固后备用。

3、愈伤组织的诱导：

取培养60天后的无菌幼苗材料，在超净工作台上选择直径1.0～2.0mm的根系，用解剖刀切下0.8～1.5cm的含根尖的小段，将根尖外植体小段平放方式接种于愈伤组织诱导培养基中培养，取材后的幼苗放入生根培养基。

愈伤组织诱导培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

培养条件：温度23～27℃，相对湿度40～50％，暗培养。

根尖接种至培养基10天后明显膨大，并逐渐脱分化出微黄色的愈伤组织，培养至20天时可以明显观察到大量愈伤组织的出现，愈伤组织诱导率可高达100％，选用诱导45天后的根尖愈伤组织进行增殖培养。

4、愈伤组织的继代：

取经愈伤组织诱导后获得的带有残留根尖组织的愈伤组织块，放置在愈伤组织增殖培养基上进行培养；

增殖培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+0.05g·L^{- 1}GQDs+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

培养条件：温度23～27℃，相对湿度40～50％，暗培养。培养15天后的增殖率高达124.50％，以30天为一个继代周期。继代培养后，愈伤组织大量增殖，可以进一步诱导成体细胞胚或转入光下培养成苗。

愈伤组织的细胞形态学观察：

参考醋酸洋红染色法。取适量增殖培养15天的愈伤组织于1.5mL离心管中，加入1mL醋酸洋红溶液以浸没愈伤组织，轻轻晃动使其与溶液充分接触。染色30min后去除红色染液，用蒸馏水重复冲洗愈伤组织至洗涤废液无色。用镊子夹取少许愈伤组织置于载玻片上，加1滴蒸馏水后小心盖上载玻片，注意不要产生气泡。用滤纸在载玻片周围吸取多余的液体，之后置于Olympus光学显微镜下，可以观察到愈伤组织细胞呈圆球状、排列规则，大小整齐，细胞核大而明显，细胞质较浓，淀粉粒等营养物质的积累较多。

愈伤组织成苗诱导验证：取生长状态良好的愈伤组织块，放置在成苗诱导培养基上进行培养，培养基组分包括：4.33g·L^-1MS+1.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+1％(w/v)琼脂，pH5.8。培养条件：温度23～27℃，相对湿度30～40％，光照14h/黑暗10h，光照强度2500lx。25天后部分愈伤组织细胞团表面出现不定芽，呈嫩绿色；90天后不定芽快速生长成苗，幼叶上部绿色加深，下部为淡黄绿色，叶片直立生长，无菌苗生长健壮。

实施例3百子莲愈伤组织诱导的外植体类型优化

本实施例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于外植体类型。

采用本实施例的方法，在愈伤组织诱导阶段，分别以无菌苗叶片、根尖、根段，为外植体，在添加不同浓度PIC和6-BA的MS基本培养基上诱导愈伤组织，各类型外植体的最高诱导率存在差异(表1)，可见外植体类型对愈伤组织的形成有着显著的影响。

表1百子莲愈伤组织诱导的外植体类型优化

实验表明：无菌苗根尖是诱导愈伤组织的最佳外植体，在4.33g·L^-1MS+3.0mg·L^-1PIC+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8的诱导培养基上的出愈率为63.95％。

实施例3百子莲愈伤组织诱导的激素组合配方优化

本实施例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于激素组合配方。

采用本实施例的方法，在愈伤组织诱导阶段，以无菌苗根尖为外植体，分别在PIC+6-BA，PIC+TDZ+2,4-D，PIC+NAA+KT激素组合的MS基本培养基上诱导愈伤组织，各激素组合下最高诱导率存在差异，因此激素组合对愈伤组织的形成有着显著的影响。

表2百子莲愈伤组织诱导的激素组合配方优化

实验表明：以无菌苗根尖为外植体诱导愈伤组织，在PIC+NAA+KT激素组合下可达到较高的出愈率，其中4.33g·L^-1MS+2.0mg·L^-1PIC+1.5mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8的诱导培养基上的出愈率为100％。

实施例4激素用量对百子莲无菌苗根尖愈伤组织诱导的影响

本实施例进一步测试激素用量对百子莲无菌苗根尖愈伤组织诱导的影响。

本实施例中，愈伤组织诱导培养基组分包括：

4.33g·L^-1MS+(激素)+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8，其中激素用量如下表。

其他方法步骤同实施例1

结果见表3。

表3 PIC、NAA和KT激素组合对百子莲无菌苗根尖愈伤组织诱导的影响

实验表明：愈伤组织诱导率较高的培养基配方为：4.33g·L^-1MS固体培养基、3.0％(w/v)蔗糖、2.0～3.0mg·L^-1PIC、1.0～1.5mg·L^-1KT、0.05～0.1mg·L^-1NAA、0.2～0.4％(w/v)植物凝胶，pH为5.8。尤其是在激素组合为2.0mg·L^-1PIC、1.5mg·L^-1KT、0.1mg·L^{- 1}NAA时达到了100％的诱导率。

实施例5继代代次的优化

本实施例的目的是为了确认无菌苗继代代次。

本实施例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于以保存2年以上且继代代次超过20次的无菌苗根尖为外植体，在培养基组分相同的条件下诱导，外植体在7天时开始膨大；30天时有少数根段纵向开裂，出现极少量的浅黄色愈伤组织；继续培养至40天左右时，外植体陆续开始褐化、死亡；培养60天左右时绝大多数根系外植体死亡。

这是由于多次继代导致无菌苗根系活力降低，在外源激素的诱导下仅停滞于膨大阶段，无法进一步分化形成愈伤组织，因此不适宜作为组织培养的外植体。因此，无菌苗继代代次不能超过20次。

对比例1

本对比例与实施例1的无菌苗的获得步骤基本相同，不同之处仅在于：所述百子莲的种子为隔年采收的千粒重3.10～3.30g的干燥种子，播种45天后统计所得萌发率仅25％～30％。由于种胚较薄且发育不良，质量较差，因而大大降低了获得无菌苗的效率，不适宜作为获得无菌苗的实验材料。

对比例2

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例采用的外植体为不含尖端的根段。

采用本对比例的方法，根段外植体在配方相同的培养基上暗培养，外植体膨大变化较晚，表面开裂、愈伤组织生长的时间较晚，诱导率极低，绝大多数配方(表4)的诱导率仅为10～25％，最高仅为36.03％(激素配比为2.0mg·L^-1PIC+0.4mg·L^-16-BA)，可以获得的愈伤组织数量较少。生长素信号的最大值已被证实出现在根尖静止中心，可以调控细胞分裂、细胞扩张和干细胞分化，对愈伤组织的形成会有所影响，一定程度上说明了根尖的存在对百子莲愈伤组织诱导的重要性。

表4 PIC与6-BA激素组合对百子莲无菌苗根段愈伤组织诱导的影响

对比例3

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例的增殖培养基中的组分包括：4.33g·L^-1MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+0.4g·L^-1GQDs+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

采用本对比例的方法，15天时测定的愈伤组织增殖速率极低，仅为42.67％。结果表明，添加0.05g·L^-1GQDs可以显著促进根系愈伤组织增殖，浓度高于0.2g·L^-1时反而会有抑制效果(图7)。

对比例4

本对比例与实施例1的制备步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例的增殖培养基中的组分包括：4.33g·L^-1MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3％(w/v)蔗糖+0.3％(w/v)植物凝胶，pH5.8。

采用本对比例的方法，15天时测定的愈伤组织增殖速率为65.33％。结果表明，添加0.05g·L^-1GQDs可以显著促进根系愈伤组织增殖，若不添加GQDs，愈伤组织的增殖速率会降低47.55％(图7)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种百子莲根尖的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、无菌苗的获得：取百子莲种子进行消毒处理后，接种到种子萌发培养基，萌发后转入生根培养基，获得无菌苗；

B、愈伤组织的诱导：取步骤A获得的无菌苗的根尖的小段作为外植体，将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养；

C、愈伤组织的增殖：取经步骤B诱导后获得的愈伤组织放置在增殖培养基中增殖培养，获得愈伤组织块。

2.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，增殖培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.05～0.25mg·L^-1NAA、0.05～0.4g·L^-1GQDs、0.2～0.3％(w/v)植物凝胶，pH为5.8～6。

3.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，步骤A中，消毒方法具体为无菌水清洗，然后无菌水浸泡20～30min，75％(v/v)酒精表面杀菌50～90s，之后无菌水冲洗，之后采用NaClO和纳米银水溶液处理，再用无菌水冲洗4～6次。

4.根据权利要求3所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述NaClO和纳米银水溶液处理的步骤具体为，10～20％NaClO表面杀菌10～20min，无菌水冲洗，再用20～60mg·L^-1纳米银水溶液处理10～20min，无菌水冲洗。

5.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述种子萌发培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.6～1.0％(w/v)琼脂，所述培养基pH为5.8～6。

6.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述生根培养基的组分为：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、0.1～0.2mg·L^-1IBA、0.5～0.8％(w/v)琼脂，pH为5.8～6。

7.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：2.17～4.33g·L^-1MS固体培养基、2.0～3.0％(w/v)蔗糖、2.0～3.0mg·L^-1PIC、1.0～1.5mg·L^-1KT、0.05～0.1mg·L^-1NAA、0.2～0.4％(w/v)植物凝胶，pH为5.8～6。

8.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤A中，所述百子莲的种子为当年采收的千粒重6.60～6.80g的饱满干燥种子。

9.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤B中，外植体为从距离根尖1.0～1.5cm处垂直横切获得的组织块。

10.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，种子萌发和生根的条件为：温度23～27℃，相对湿度65～85％，光照10～14h/黑暗10～14h，光照强度2000～3000lx。

Images