CN109717080B - 一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，包括如下步骤：S1、外植体的取材：取百子莲未开裂的小花苞进行消毒处理，切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成小段；S2、愈伤组织的诱导和继代培养：取小花梗外植体小段接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养后，取带有残留小花梗组织的愈伤组织放置于愈伤组织继代培养基中继代培养；S3、胚性愈伤组织的诱导：取经步骤S2培养后获得的不含残留小花梗组织的愈伤组织放置于胚性愈伤组织诱导培养基中诱导培养；S4、胚性细胞的继代保存：取经步骤S3培养后获得的胚性细胞放置在继代保存培养基中继代保存。本发明优化了百子莲体胚发生体系，得到数量更多，性状更一致的百子莲胚性细胞。

Description

一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法。

背景技术

百子莲‘Big Blue’(Agapanthus praecox ssp.orientalis‘Big Blue’)又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产非洲南部，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为风靡全球的鲜切花、盆栽及地被花卉，并体现出极佳的观赏价值。此外，百子莲抗性极强，夏季可抗40℃以上的高温，冬季也可耐-10℃以下的低温，对土壤要求不严，且极少有病虫害发生，该物种在道路绿化、土壤修复领域也具有巨大的发展空间，目前市场上种苗供不应求。

百子莲在原产地南非常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低及后代易分化等缺点。体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等优势，因此被认为是百子莲无性扩繁和种子保存的较佳途径。

国内百子莲进行体胚诱导的一般流程为：选择小花梗诱导出愈伤组织，通过继代培养诱导出胚性细胞，进而将培养基中的生长素去除继续培养胚性细胞，以利于诱导成熟胚胎并萌发为种苗。在百子莲的体胚体系中，一般利用特异性的外源生长素——毒莠锭(Picloram，PIC)作为调控胚性形成及体胚萌发的关键因子，极少使用其它激素。

体胚体系进行快繁的核心在于：利用植物体细胞全能性发育成完整的植株，而体细胞的载体——胚性细胞，可以通过不断继代培养得以扩增。诱导初期的胚性细胞通过继代，每月的增殖系数可以达到6～7倍，但胚性细胞多为单细胞外部起源，且数量较少，通常在胚性细胞阶段进行多次继代培养。而频繁继代会导致材料的同步化程度降低，增殖系数减少，通常在继代1年之后，增殖系数会降低到3倍左右，而且材料同步化状态较差，细胞团形态参差不齐，有成畸形胚的，也有衰败的。为解决频繁继代培养造成的体胚数量减少，以及工作量增加的问题，相关研究人员做了百子莲胚性细胞的超低温保存研究，旨在减少继代频次，同时能够很好维持胚性愈伤组织的胚性，从而利于后期的体胚苗诱导。但超低温保存技术要求相对较高，同时也会导致材料损失。因此，在百子莲胚性愈伤组织继代增殖的过程中，通过优化继代方法，得到状态良好，同步化形态一致的胚性细胞是百子莲体胚快繁的一个关键环节。

福建农林大学赖钟雄教授课题组通过不断优化，龙眼(Dimocarpus longan)胚性细胞继代时间可以达到20年以上。而百子莲胚性细胞继代保存的研究还处于初级阶段，相关研究并未见报道。

公开号为CN 104126505A的发明专利申请中公开了一种用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，该方法包括取细叶百合无菌苗叶片接种于MS+BA1.0mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1中培养，获得非胚性愈伤组织，随后将其转于MS+BA 0.5mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1中培养，获得胚性愈伤组织后转入MS+NAA 0.5mg·L^-1中，调整胚性比例，而后依次交替使用这两种培养基，可获胚性比例高、萌发率低的胚性愈伤组织培养物，最后转于MS中，每1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。该方法以无菌苗为外植体，降低对百合原种的消耗；胚性愈伤组织诱导率高，保存效果好，肉眼可辨别，是遗传转化的良好受体。但该方法用无菌苗作为外植体，通常会导致性状的变异和品质的退化。同时，由于持续使用高浓度外源人工合成生长素类物质NAA，使内源IAA合成受到抑制，导致材料发育整齐度降低，胚性细胞颗粒较粗，并未见疏松的胚性细胞团结构，导致成胚数量较少，每1cm³胚性组织仅得到21个球形胚，未能发挥体胚体系在种苗扩繁领域的优势。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法。

本发明根据前期研究基础，优化胚性细胞的继代保存方法，以获得数量更多、状态一致的胚性细胞，更大限度地发挥百子莲体胚体系在种苗快繁领域的优越性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，包括如下步骤：

S1、外植体的取材：取百子莲未开裂的小花苞进行消毒处理，切取小花梗外植体，将所述小花梗外植体切成小段(取未开裂花苞内的小花梗作为外植体，容易得到无菌材料，愈伤诱导率可达100％，其它材料的愈伤诱导效果较差)；

S2、愈伤组织的诱导和继代培养：取小花梗外植体小段接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，然后，取带有残留小花梗组织的愈伤组织放置于愈伤组织继代培养基中进行继代培养；

S3、胚性愈伤组织的诱导：取经步骤S2培养后获得的不含残留小花梗组织的愈伤组织放置于胚性愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养；

S4、胚性细胞的继代保存：取经步骤S3培养后获得的胚性细胞放置在继代保存培养基中进行继代保存培养，所述继代保存培养基中含有麦芽糖和IAA。

优选地，步骤S1中，所述百子莲为5～6月份花期、4～5年生的百子莲；所述小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段。

优选地，步骤S1中，所述消毒处理的步骤为：先用75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次。

优选地，步骤S2中，所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·L^-1MS、1.5～2.0mg·L^-1PIC、2.5～3.5％蔗糖、0.6～1.0％琼脂；所述愈伤组织诱导培养基的pH为5.8。所有的MS干粉用量为4.43g·L^-1。

优选地，步骤S2中，所述愈伤组织诱导培养基的制备方法为：每升ddH₂O中加入4.43g MS干粉培养基，1.5～2.0mg PIC溶液，25～35g蔗糖，6～10g琼脂，调节pH5.8；然后在121℃高压环境中灭菌处理20～25min后进行分装，冷却凝固。

优选地，步骤S2中，所述愈伤组织继代培养基的组分包括：4.43g·L^-1MS、1.0～1.5mg·L^-1PIC、2.5～3.5％蔗糖、0.6～1.0％琼脂；所述愈伤组织继代培养基的pH为5.8。

优选地，步骤S2中，所述诱导培养的条件为：22～28℃暗培养15d；

所述继代培养的条件为：22～28℃暗培养，以50～70d为一个继代周期，继代培养2次。

更优选地，步骤S2中，所述诱导培养的条件为：25℃暗培养15d。

优选地，步骤S3中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·L^-1MS、1.0～1.5mg·L^-1PIC、2.5～3.5％蔗糖、0.6～1.0％琼脂；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH为5.8。

优选地，步骤S3中，所述诱导培养的条件为：22～28℃暗培养，50～70d。

优选地，步骤S4中，所述继代保存培养基的组分包括：4.43g·L^-1MS、1％蔗糖、1.8～2.2％麦芽糖、0.5mg·L^-1PIC、0.8～1.2mg·L^-1IAA、0.6～1.0％琼脂；所述继代保存培养基的pH为5.8。麦芽糖主要功能是促进胚性细胞的同步化，使生长更为一致。IAA的功能主要是促进了细胞的分裂，使材料数量增加。麦芽糖为分解较慢的二糖，通过持续缓慢分解释放，供给继代过程所需的单糖--葡萄糖，因此材料生长状态较为一致，促使胚性细胞的同步化效果。IAA为植物细胞自身合成的生长素，因其离体条件下容易氧化，通常在实验中使用较少，而以生长素类物质IBA、NAA作为替代品。但是，调控植物细胞的分裂的重要激素仍然是内源IAA，前期实验测定表明，外源生长素PIC用量较高的情况下，内源IAA含量降低。而本发明方法中，通过外源生长素类物质PIC和IAA的配比，保证了内源IAA的供给，因此，细胞分裂速度较快，继代后得到了数量更多的胚性细胞。同时，PIC在继代中是不可或缺的，没有PIC，基本难以维持百子莲胚性细胞的继代。

更优选地，步骤S4中，所述继代保存培养基的组分包括：4.43g·L^-1MS、1％蔗糖、2％麦芽糖、0.5mg·L^-1PIC、1.0mg·L^-1IAA、0.6～1.0％琼脂。当继代保存培养基采用该组分含量时，具有最佳效果。

优选地，步骤S4中，所述继代保存的条件为：放入2～8℃2～4d后取出，22～28℃黑暗培养，30d为一个继代培养周期。继代培养为胚性细胞材料保存的主要方法，所有的体胚发生材料，需要继代得以扩繁，通常30天继代一次，可保存3年以上。

更优选地，步骤S4中，所述继代保存的条件为：放入4℃2～4d后取出，22～28℃黑暗培养，30d为一个继代培养周期

愈伤组织：愈伤组织(Callus)是指植物体局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体多种组织的活细胞。

胚性细胞：胚性细胞即胚性愈伤组织细胞，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强，具有萌发成为体细胞胚胎的能力。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明利用糖配比和激素调控，优化了百子莲体胚发生体系，得到数量更多，性状更一致的百子莲胚性细胞。

2、百子莲在国内的组培和体细胞胚胎途径快繁中，一般不经低温培养。本发明利用短时间低温处理的方式，使细胞分裂活动暂时停滞，使得胚性细胞性状更为一致。

3、本发明突破了传统组培仅以蔗糖作为碳源的培养基配方，利用蔗糖以及麦芽糖作为碳源，通过种类和浓度配比的调控，利用麦芽糖释放葡萄糖分子速度较慢的特点，保证了后期细胞分裂过程中葡萄糖的供给，提高了胚性细胞继代效果，使细胞呈现为鲜黄色。

4、本发明突破传统组培极少使用IAA作为外源生长素的认识，经微孔滤膜过滤灭菌后，加入具有生物活性的IAA，直接诱导细胞的分裂和增殖，一定程度上减少了外源生长素和内源IAA的竞争，促进了增殖系数，得到更多的胚性细胞。

5、本发明技术处理简单，操作性强，有效改善了胚性细胞的长期继代过程中褐化、死亡，增殖系数低的问题。

6、通过本发明继代的胚性细胞，1cm³胚性细胞诱导成熟胚的数量达958.64个，远远高于公开号为CN 104126505A的发明中1cm³诱导21个体胚的效果，且有效提升了百子莲的体胚发生效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1中小花梗外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养15d后的解剖镜观察图；

图2为实施例1中不含残留小花梗组织的愈伤组织在胚性愈伤组织诱导培养基上培养60d后的解剖镜观察图；

图3为实施例1中愈伤组织诱导后的非胚性与胚性细胞显微形态观察图；

图4为实施例1中胚性细胞的解剖镜观察图；

图5为实施例与对比例中胚性细胞的增殖系数对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供的一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，具体步骤如下：

(1)外植体的取材：5～6月份花期，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理(先用75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次)。用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段；

(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养15d，可见白色半透明的愈伤组织生成(图1为小花梗外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养15d后的解剖镜观察图)，愈伤组织诱导率为100％，之后25～35d天后进行愈伤组织的继代培养；

所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+1.0％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH₂O中加入4.43g MS干粉培养基，1.5mg PIC溶液，-35g蔗糖，-10g琼脂，pH5.8。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理20～25min后拿到超净工作台内分装，培养皿规格为：90mm×16mm，每皿分装培养基25mL，冷却凝固后，进行外植体的接种，每皿接种10～15个小花梗外植体小段。

(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，22℃暗培养，以70d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙；

所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.5％蔗糖+1.0％琼脂，pH5.8。培养皿规格为：90mm×16mm。

(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基(培养基组分为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.5％蔗糖+1.0％琼脂，pH5.8)上，22℃暗培养，70d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织(图2为不含残留小花梗组织的愈伤组织在胚性愈伤组织诱导培养基上培养60d后的解剖镜观察图)；

胚性细胞的细胞染色验证：取3mm大小的细胞团，放入1.5mL的离心管中，加入500μL的醋酸洋红染色液，在室温下静置30min，用移液器吸取染色液，弃去染色液；然后加入超纯水，不断吹打细胞团，用移液器吸取溶液，再次加入超纯水，本步骤重复3次，取载玻片一枚，用1mL吸头剪去顶端2mm处，吸取直径1mm大小的细胞团，放在载玻片上，放置盖玻片，避免产生气泡，然后轻轻压平，放在Leica DM2500显微镜下观察并拍照(见图3，图3愈伤组织诱导后的非胚性与胚性细胞显微形态观察图)，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。

(5)胚性细胞的继代保存：取微黄色、状态良好的胚性细胞，放置在继代保存培养基(MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+0.5mg·L^-1PIC+1.0mg·L^-1IAA+0.8％琼脂，pH5.8)上，放入2℃冰箱2d后取出，22℃黑暗培养。30d为一个继代培养周期，结果表明：胚性细胞增殖较快，形态一致，色泽为微黄色(图4为胚性细胞的解剖镜观察图)，培养30d后，本发明继代保存方法中胚性细胞的增殖系数可以达到5.63倍(图5为胚性细胞的增殖系数对比图)，显著高于传统胚性细胞继代方法。

实施例2

本实施例提供的一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，具体步骤如下：

(1)外植体的取材：5～6月份花期，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理(先用75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次)。用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段；

(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养15d，可见白色半透明的愈伤组织生成，愈伤组织诱导率为100％，25～35d天后进行愈伤组织的继代培养；

所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+2.0mg·L^-1PIC+2.5％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH₂O中加入4.43g MS干粉培养基，2.0mg PIC溶液，25g蔗糖，6g琼脂，pH5.8。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理20～25min后拿到超净工作台内分装，培养皿规格为：90mm×16mm，每皿分装培养基25mL，冷却凝固后，进行外植体的接种，每皿接种10～15个小花梗外植体小段。

(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，28℃暗培养，以50d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙；

所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.0mg·L^-1PIC+2.5％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.8。培养皿规格为：90mm×16mm。

(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基(培养基组分为：MS+1.0mg·L^-1PIC+2.5％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.8)上，28℃暗培养，50d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织；

通过胚性细胞的细胞染色验证实验，在Leica DM2500显微镜下观察并拍照，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。

(5)胚性细胞的继代保存：取微黄色、状态良好的胚性细胞，放置在继代保存培养基(MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+0.5mg·L^-1PIC+1.0mg·L^-1IAA+1.0％琼脂，pH5.8)上，放入8℃冰箱4d后取出，28℃黑暗培养。30d为一个继代培养周期，结果表明：胚性细胞增殖较快，形态一致，色泽为微黄色，培养30d后，本实施例继代保存方法中胚性细胞的增殖系数可以达到5.56倍，显著高于传统胚性细胞继代方法。

实施例3

本实施例提供的一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，具体步骤如下：

(1)外植体的取材：5～6月份花期，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理(先用75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次)。用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段；

(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养15d，可见白色半透明的愈伤组织生成，愈伤组织诱导率为100％，25～35d天后进行愈伤组织的继代培养；

所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.8mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH₂O中加入4.43g MS干粉培养基，1.8mg PIC溶液，30g蔗糖，8g琼脂，pH5.8。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理20～25min后拿到超净工作台内分装，培养皿规格为：90mm×16mm，每皿分装培养基25mL，冷却凝固后，进行外植体的接种，每皿接种10～15个小花梗外植体小段。

(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，25℃暗培养，以60d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙；

所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.2mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8。培养皿规格为：90mm×16mm。

(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基(培养基组分为：MS+1.2mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.8％琼脂，pH 5.8)上，25℃暗培养，60d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织；

通过胚性细胞的细胞染色验证实验，在Leica DM2500显微镜下观察并拍照，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。

(5)胚性细胞的继代保存：取微黄色、状态良好的胚性细胞，放置在继代保存培养基(MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+0.5mg·L^-1PIC+1.0mg·L^-1IAA+0.6％琼脂，pH5.8)上，放入4℃冰箱3d后取出，25℃黑暗培养。30d为一个继代培养周期，结果表明：胚性细胞增殖较快，形态一致，色泽为微黄色，培养30d后，本实施例继代保存方法中胚性细胞的增殖系数可以达到5.75倍，显著高于传统胚性细胞继代方法。

对比例1

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代保存的低温处理环节去掉，即将胚性细胞转接后，直接放置在22℃黑暗培养，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，在不经4℃低温处理的情况下，胚性细胞继代增殖系数为4.39。

对比例2

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代培养基中的麦芽糖去掉，仅以蔗糖作为碳源，培养基为MS+3％蔗糖+0.5mg·L^-1PIC+1.0mg·L^-1IAA+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，在不含麦芽糖的培养基上，胚性细胞同步化状态较差，部分材料由微黄色转为白色，继代增殖系数为4.21。

对比例3

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代培养基中的IAA去掉，即将体胚苗诱导阶段的胚性细胞转接后，放置在不含IAA的培养基上，培养基为MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+1.5mg·L^-1PIC+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，在不含IAA的培养基上，胚性细胞有部分褐化现象，继代增殖系数为4.42。

对比例4

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代培养基中的麦芽糖、IAA都去掉，且不经低温处理环节，即将体胚苗诱导阶段的胚性细胞转接后，直接放置在不含麦芽糖和IAA的培养基上，培养基为MS+3％蔗糖+1.5mg·L^-1PIC+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，胚性细胞同步化程度较低，有部分褐化现象，也有部分衰老死亡的细胞团出现，继代增殖系数为3.08。

对比例5

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代培养基中的麦芽糖的用量调整为3％，即培养基为MS+1％蔗糖+3％麦芽糖+0.5mg·L^-1PIC+1.0mg·L^-1IAA+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，胚性细胞同步化程度较好，褐化现象较少，但由于麦芽糖分解较慢，而糖总量提升导致渗透压提高，继代增殖系数仅为2.38倍。

对比例6

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例1的步骤(5)中胚性细胞继代培养基中的IAA的用量调整为1.50mg·L^-1，即培养基为MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+0.5mg·L^-1PIC+1.50mg·L^-1IAA+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，由于缺少特异性外源激素PIC，胚性细胞同步化程度较差，褐化现象明显，有少数畸形胚产生，也有部分胚性细胞脱分化成为非胚性愈伤细胞，继代增殖系数为2.87。

对比例7

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：本对比例中的步骤(5)中，采用NAA代替PIC，即培养基为MS+1％蔗糖+2％麦芽糖+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1IAA+0.8％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。

采用本对比例的方法，胚性细胞同步化程度较差，部分细胞团发育为不规则状的畸形胚，且多数为半透明状，难以成苗，胚性愈伤细胞褐化比例较高，部分细胞脱分化成非胚性细胞，大部分胚性愈伤组织丧失胚性，继代增殖系数为1.53。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (3)

1.一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、外植体的取材：取百子莲未开裂的小花苞进行消毒处理，切取小花梗外植体，将所述小花梗外植体切成小段；

S2、愈伤组织的诱导和继代培养：取小花梗外植体小段接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，然后，取带有残留小花梗组织的愈伤组织放置于愈伤组织继代培养基中进行继代培养；

S3、胚性愈伤组织的诱导：取经步骤S2培养后获得的不含残留小花梗组织的愈伤组织放置于胚性愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，其中，所述诱导培养的条件为：22~28℃暗培养，50~70 d；

S4、胚性细胞的继代保存：取经步骤S3培养后获得的胚性细胞放置在继代保存培养基中进行继代保存培养，所述继代保存培养基中含有麦芽糖和IAA，其中，所述继代保存培养基由4.43 g∙L^-1MS、1%蔗糖、1.8~2.2%麦芽糖、0.5 mg·L^-1 PIC、0.8~1.2mg·L^-1 IAA、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述继代保存培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述愈伤组织诱导培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.5~2.0 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述愈伤组织继代培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.0~1.5 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述愈伤组织继代培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述诱导培养的条件为：22~28℃暗培养15d；

所述继代培养的条件为：22~28℃暗培养，以50~70 d为一个继代周期，继代培养2次；

步骤S3中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.0~1.5 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；

步骤S4中，所述继代保存的条件为：放入2~8℃ 2~4 d后取出，22~28℃黑暗培养，30 d为一个继代培养周期。

2.根据权利要求1所述的提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，步骤S1中，所述百子莲为5~6月份花期、4~5年生的百子莲；所述小花梗外植体切成0.7~1.0 cm的小段。

3.根据权利要求1所述的提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，步骤S1中，所述消毒处理的步骤为：先用75%（v/v）乙醇处理50~70 s，用ddH₂O冲洗3~5次，然后用5%次氯酸钠消毒处理5~7 min，之后ddH₂O冲洗3~5次，再用75%乙醇处理50~70 s，用ddH₂O冲洗3~5次。

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