CN102283124B

CN102283124B - 菘蓝根外植体器官发生方法

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Publication number: CN102283124B
Application number: CN 201110198906
Authority: CN
Inventors: 步怀宇; 潘红艳; 李娜; 毕彦博; 王英娟
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2011-07-16
Filing date: 2011-07-16
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2031-07-16
Also published as: CN102283124A

Abstract

一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，具体选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10～15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0.5～1.0cm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根。本发明所提供的菘蓝植株再生方法，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，毛状根在分化培养基中仅需2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培养时间短的优点。

Description

菘蓝根外植体器官发生方法

技术领域

本发明涉及利用植物组织培养技术培养菘蓝试管苗无菌根获得再生植株的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

菘蓝( Isatis indigotica Fort. )为十字花科（ cruciferae ）菘蓝属（Isatis Linn） 2年生草本植物。菘蓝全株入药，是我国南北各地广为栽培的药用植物。在中药学中，菘蓝的干燥根称为板蓝根，干燥叶称为大青叶，两者都具有清热解毒、凉血消斑的功效，广泛用于各种方剂中。大青叶中所含生物碱类化学成分靛玉红还有治疗慢性粒细胞白细胞病的作用。

利用组织培养进行快速繁殖和高产栽培、对节约耕地、提高产量有重要意义。在植物离体器官发生过程中，根据不同的培养条件，不定芽可以不经过愈伤组织阶段从外植体上直接分化形成（直接器官发生）；也可以从外植体脱分化形成的愈伤组织中发生（间接器官发生）。有关菘蓝组织培养直接器官发生和间接器官发生生成不定芽均有报道。叶片在MS + 6 - BA 2 mg/L+ NAA 1 mg/L培养可直接诱导形成不定芽（中草药，1995，（1）：52）；用含KT 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L的MS培养基诱导菘蓝下胚轴分化形成不定芽，诱导率达87.5%（西南师范大学学报，2004，29（6）：1069）；用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎为外植体（四川师范学院学报，1991，12（4）:358），以下胚轴为外植体分别建立了菘蓝的快速繁殖体系（中国中药杂志，1993，18（1）:21），这些都是直接器官发生的报道。而附加 6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.2 mg/L 的MS培养基诱导欧洲菘蓝子叶愈伤组织（湖北大学学报（自然科学版），2006，28（2）:183），以及“不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应，广西热带农业，2007，（6）:30”等报道是菘蓝通过间接器官发生途径再生。

组织培养过程中，采用不同来源外植体和不同培养条件对优化培养过程，降低生产成本具有积极意义。根段相对于其他类型外植体具有以下优点：首先，它们很容易获得，其次，根作为外植体不会彻底杀死供体植株，另外，根中还可获得稳定的次生代谢产物。液体培养作为试管苗培养的方式也有着独特的优点，液体培养基省略了琼脂等凝固剂，降低了经济成本，减少了凝固剂的杂质，保证了培养基在分批配制中的一致性，并且液体培养基更易于配制。

已有的菘蓝组培文献报道中，无论是直接器官发生、还是间接器官发生，都是以菘蓝子叶、叶片、下胚轴或子房为外植体，在固体培养基上通过不同激素的配比，诱导外植体的分化，完成其再生过程。

发明内容

本发明的目的是以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根，毛状根进一步培养可逐步分化出不定芽，进而生根、长成完整植株。本发明具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，培养时间短的优点。

本发明的实现过程如下：

一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于：以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根。

毛状根的培养：选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10-15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0.5～1.0cm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根。

所述的MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加0～2 mg/L 6-BA，0～1mg/ L NAA， 30 g/L蔗糖，调pH到5.8～6.2。

上述形成的毛状根在固体或液体分化培养基上分化形成不定芽，液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加0～2 mg/L 6-BA，0～1mg/ L NAA， 30 g/L蔗糖，调pH到5.8～6.2；固体分化培养基是在液体分化培养基中加入7 g/L琼脂。

上述形成的不定芽切成单株，接种至生根培养基中生根，生根培养基组成为：MS基本培养基，附加0～1 mg/L IBA，0.5～1mg/L NAA，30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，调pH到5.8～6.2。

继代苗或无菌苗的培养、毛状根培养、分化不定芽、生根培养温度为25 ± 2 ℃，光照强度是30～40 mol·m^-2·s^-1，16 h / 8 h光/暗培养，液体振荡培养转速80 r/min。

本发明的优点和积极效果：

现有组培技术方法中，毛状根的获得通常都是通过发根农杆菌转化的方法，发明人发现菘蓝根在液体培养基中未经转化先形成大量的毛状根，本发明可获得一种新的可用于药理学和植物化学研究的根扩增体系。对于用根的药用植物而言，根中的次生代谢产物含量高于其他组织，在体外建立根培养体系利于药用成分的提取利用。本发明所提供的菘蓝植株再生方法，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，毛状根在分化培养基中仅需2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培养时间短的优点，对于菘蓝的育种及加速良种的无性繁殖具有积极作用。

附图说明

图1为液体分化培养的毛状根；

图2为液体分化培养的不定芽；

图3为再生完整植株；

图4为固体分化培养的毛状根。

具体实施方式

本发明使用的缩略语对应的中文名称如下：

6-BA（6-苄基嘌呤） NAA（萘乙酸）　IBA（3-吲哚丁酸）

本发明使用的MS培养基按手册通用方法配制，组成与含量如下：大量元素：NH₄NO₃ 1650 mg/L，KNO₃1900 mg/L，CaCl₂·2H₂O 440 mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄ 1700 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L，FeSO₄·7H₂O（27.8）mg/L +Na₂-EDTA·2H₂O（27.3）mg/L；有机成分：肌醇 100 mg/L，烟酸 0.5 mg/L，盐酸吡哆醇（维生素B6） 0.5 mg/L，盐酸硫胺素（维生素B1） 0.5 mg/L，甘氨酸 2 mg/L。

以下通过实施例进一步描述本发明。

实施例 1：菘蓝种子剥除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0.1 % HgCl₂消毒10 min，无菌水振荡清洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分，接种于MS培养基上于黑暗处萌发，获得无菌苗。

培养10～15d的无菌苗根、下胚轴切成约1 cm 的小段，子叶切成约0.5×0.5 cm 的小块，置于附加2mg/L的 6-BA和0.2mg/L NAA，3% 蔗糖，0.7% 琼脂的固体分化培养基上进行分化培养。均可出现绿色芽点，继续培养每个芽点处可形成不定芽，呈丛生状。将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培养基诱导不定芽的生根，生根率达85.4%。再生的组培苗可通过扦插方式继代培养。

通过上述组织培养过程获得的继代无菌苗根切成约1 cm 的小段，置于不附加激素的液体分化培养基上振荡培养。根段首先形成大量的白色毛绒状根，包裹整个外植体（图1）。将白色毛绒状根接种在含2mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA，3% 蔗糖的固体分化培养基中，观察到不定芽点的形成，继续培养可形成不定芽（图2）。将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培养基诱导不定芽的生根，生根率达80.3%，形成完整植株（图3）。

实施例2：菘蓝种子剥除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0.1 % HgCl₂消毒10 min，无菌水振荡清洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分，接种于MS培养基上于黑暗处萌发，获得无菌苗。

培养10～15d的种子苗根切成约1 cm 的小段，置于不附加激素的液体分化培养基上振荡培养。根段首先形成大量的白色毛绒状根，包裹整个外植体。将白色毛绒状根接种在含2mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA，3% 蔗糖的固体分化培养基中，观察到不定芽的形成，继续培养可形成不定芽（图4）。将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培养基诱导不定芽的生根。

实施例3：菘蓝种子剥除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0.1 % HgCl₂消毒10 min，无菌水振荡清洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分，接种于MS培养基上于黑暗处萌发，获得无菌苗。

培养10～15d的无菌苗根切成约1 cm 的小段，直接置于附加0.5mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA液体分化培养基上振荡培养。根段首先形成白色毛绒状根，但数量明显少于实施例2和3中所述在MS无激素培养基中数量。继续培养，观察到不定芽的形成。将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种在附加0.2 mg/L IBA的MS生根培养基诱导不定芽的生根，生根率达49.2%。

在已有菘蓝组培文献中，取苗龄10天的无菌苗子叶和胚轴，接种于诱导丛生芽培养基中，1周后所有外植体略显膨大，并于切口处长出愈伤纪织，20天左右陆续出现绿色芽点（植物生理学通讯，1990，（12）:43）。菘蓝幼嫩叶片外植体置于分化培养基上进行培养，7天后叶片边缘向叶远轴面卷曲，叶片有膨大现象，20天左右露出不定芽点，不定芽出现的高峰期在接种后的28~32天（安徽科技学院学报，2007, 21( 4): 14）。比较菘蓝毛状根段在固体或液体分化培养基中分化时间和文献报道中子叶，下胚轴，幼叶等外植体分化时间，发现根段分化所需时间最短，仅2～7天就可分化芽点。外植体可100%分化，并且每个外植体的繁殖系数高，可达到四十个不定芽，以此方法可在30天周期中快速高效繁殖出大量组培试管苗。

本发明所提供的菘蓝植株再生方法，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，毛状根在分化培养基中仅需2～7天就可逐步分化出不定芽，具有培养时间短的优点，对于菘蓝的育种及加速良种的无性繁殖具有积极作用。

Claims

1.一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于：

（1）选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10～15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0.5～1.0 cm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根；

MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，调pH到5.8～6.2；

（2）毛状根在不定芽固体或液体分化培养基上分化形成不定芽；

不定芽液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加2 mg/L 6-BA，0.5 mg/ L NAA，30 g/L蔗糖，调pH到5.8-6.2；

不定芽固体分化培养基是在不定芽液体分化培养基中加入7 g/L琼脂；

（3）将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种至生根培养基中生根；

生根培养基组成为：MS基本培养基，附加0.4 mg/L IBA，30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，调pH到5.8～6.2；

所述MS基本培养基组成与含量如下：大量元素：NH₄NO₃ 1650 mg/L，KNO₃1900 mg/L，CaCl₂·2H₂O 440 mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄ 1700 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L +Na₂-EDTA·2H₂O 27.3 mg/L；有机成分：肌醇 100 mg/L，烟酸 0.5 mg/L，盐酸吡哆醇即维生素B6 0.5 mg/L，盐酸硫胺素即维生素B1 0.5 mg/L，甘氨酸 2 mg/L。