CN112616677B - 枫香属植物体胚直接播种成苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枫香属植物体细胞胚胎(体胚)直接播种培养成苗的方法及枫香属植物繁殖方法，属于林木组培技术领域，本方法包括对枫香属植物体胚进行前处理培养(低温培养、光照培养、添加渗透剂和氮源)，通过对体胚和培养基质的处理，促使枫香属植物体胚发生的鱼雷胚发育为成熟子叶胚的过程中积累更多内含物，以抵抗无土栽培基质中的胁迫，在栽培基质中体胚生根，直接形成体胚苗。本发明方法节省了常规步骤，前处理培养的成熟子叶胚直接转化成体胚苗，在短时间内大量繁殖成苗，体胚苗生产效率高，操作方法简便，出苗整齐一致，生产周期短，易养护管理，节约人力，降低成本，且不受季节限制，持续获得再生植株，适于枫香苗木产业化生产。

Description

枫香属植物体胚直接播种成苗的方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及枫香属植物成熟体细胞胚胎(简称体胚)直接播种成苗的方法，属于林业行业中的林木组培技术领域。
背景技术
枫香属(Liquidambar L.)树种是世界性重要林业资源，特别是枫香(L.formosana)和北美枫香(L.styraciflua)，二者具有较高经济价值、观赏价值和生态价值，北美枫香与枫香杂交可配性强且二者杂交获得的杂交枫香具有明显的杂种优势。
枫香属既可以通过有性繁殖也可以通过无性繁殖，近年来随着组培快繁技术和体胚技术的不断进步，枫香无性繁殖手段和繁殖效率也有较大提高。在无性离体繁殖方法中，体胚技术具有彻底幼化，繁殖效率高等特点，受到了广泛重视。近年来，Sommer和Brown利用北美枫香胚轴切段进行体胚诱导，随后美国佐治亚大学Merkle团队用未成熟合子胚和花序成功建立了北美枫香体胚发生体系并用未成熟合子胚成功建立了杂交枫香体胚发生体系，完成对胚性愈伤组织的悬浮培养，以及胚胎同步化发育的研究(Merkle,Neu et al.1998；Vendrame,Holliday et al.2001；Merkle,Battle et al.2003)。
通常植物体胚发生可以分为两个阶段，即诱导阶段和形态建成阶段。在诱导阶段，已分化的体细胞脱分化，重新获得胚性能力；在形态建成阶段，胚性细胞展现其胚性能力，分化形成体细胞胚(甄艳与陈金慧等,2013)。此外，在体胚发育到子叶胚阶段还需要放进萌发培养基进行生根萌发，然后将生根的体胚苗进行移栽驯化，整个过程步骤较多，操作繁琐，在更换培养基过程中体胚会有损耗，且不利于运输，这在很大程度上限制了其实际工业生产。目前亟需一种可以直接体胚播种的方法，缩短生产周期，提高生产效率，降低成本。
植物的体胚繁殖除了可以通过培养基萌发，温室驯化外还可以利用人工种子技术来实现。人工种子是指将植物离体培养后产生的体细胞胚或分生组织包埋在含有养分和保护功能的物质中，在适宜条件下萌发成苗的球状结构。自Redenbaugh等(1986)成功建立了人工种子的完整体系以来，人工种子在许多物种取得了重要进展(丁绍欢等，2011；Haque，Ghosh et al.2016；Micheli，Standardi et al.2016)。在繁殖苗木、人工育林等方面，人工种子比试管育苗繁殖成本更低，节省了人力、物力和财力，也方便了运输。但从总体来看，人工种子的研制仍然存在着许多问题，例如，制作步骤更为繁琐，制作费用较高，包埋基质不够成熟等。因此建立体胚直播方法至关重要。
杂交枫香体胚直播是指将体胚发生过程中的成熟子叶胚直接播种到基质中，直接在基质中生根长成小苗。该方法节省了成熟体胚在萌发培养基上培养，萌发长成无菌小苗的过程。在培养基上成熟体胚再分化、生根形成的组培苗容易根部相连，不利于体胚苗的移栽、分离；在移栽过程中，体胚苗根部的培养基不易清洗干净，且容易破坏根，增大了体胚苗污染的机率，导致体胚无菌小苗萌发率低。而体胚直播避免了这些问题，直接在基质中生根，可以提前让体胚适应基质的环境，提高了杂交枫香体胚苗的生产效率。
本实验室已经成功建立杂交枫香液体成熟培养体系，通过液体成熟，可以获得大量、发育同步的子叶胚。然而大量子叶胚在液体培养基或者固体培养基中萌发生根，则需要大量的人力物力，不利于大规模工业化生产。因此，本申请通过对杂交枫香子叶胚和培养基质进行处理，以期获得一种成熟体胚直播的方法，促进杂交枫香的工业化生产效率，降低成本。
发明内容
本发明的目的是针对现有枫香属植物体胚快速繁殖方法中存在枫香成熟体细胞胚胎(即子叶胚)需要在萌发培养基上进行萌发，培养成无菌体胚苗后，再进行移栽驯化成苗，现有的繁殖方法存在操作过程复杂，需要耗费大量人力，同时容易造成污染，导致杂交枫香体胚无菌小苗移栽成活率低等技术缺陷，本发明提供一种枫香属植物体胚直接播种培养成苗的方法，本发明方法通过对枫香植物的体胚和培养基质进行处理，成熟体胚直接播种至无土栽培基质中，直接发育成幼苗，成熟子叶胚直接播种，其子叶胚同步化更易获得，同步化的子叶胚直接播种后出苗整齐一致、操作方法简便，生周期短，繁殖系数高，便于养护管理，节约人力及土地资源，生产成本低，不受季节限制持续获得再生植株，特别适用于枫香苗木产业化生产。促进杂交枫香的工业化生产效率，降低成本。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种枫香属植物体胚直接播种培养成苗的方法，对枫香属植物的体胚成熟中期阶段的体胚进行前处理，获得成熟体胚后，栽培于无土栽培基质中，进行基质成苗培养，获得植株苗。
其中，所述枫香属植物为枫香、北美枫香或杂交枫香。
特别是，所述杂交枫香为(北美枫香×枫香)。
其中，所述体胚成熟中期阶段的体胚为鱼雷胚、长梨形胚，优选为鱼雷胚。
特别是，所述体胚的前处理包括依次进行的低温培养、胁迫处理培养。
尤其是，所述低温培养是将枫香属植物的体胚成熟中期阶段的体胚接种至固体成熟前处理培养基中，于低温条件下进行体胚的前处理培养，获得低温处理体胚。
特别是，所述固体成熟前处理培养基为改良Blaydes基本培养基+30-40g/L蔗糖+20-30g/L PEG4000+3-6g/L植物凝胶+1-2g/L酶水解酪蛋白，优选为改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG4000+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白。
特别是，所述低温培养的培养条件为：暗培养；培养温度为4-6℃，优选为4℃；培养时间为1-2d，优选为1d。
其中，所述成熟体胚为子叶胚。
尤其是，所述体胚成熟中期阶段的体胚按照如下方法获得：
A)将灭菌的枫香属植物外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养；
B)将诱导培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养；
C)将增殖培养后的胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚；
D)将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，获得成熟中期阶段的体胚；
其中，步骤A)中所述枫香属植物为枫香、北美枫香或杂交枫香，优选为杂交枫香，进一步优选为(北美枫香×枫香)。
特别是，所述外植体为未成熟合子胚。
其中，所述诱导培养基为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 1-4mg/L+6-BA 0-2mg/L。
特别是，所述胚性组织诱导培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为3-4周。
其中，步骤B)中所述增殖培养基为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1 mg/L，优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5-3g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0.25-1mg/L。
特别是，所述胚性愈伤组织增殖培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为3-4周。
其中，步骤C)中所述体胚发生培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3-6％。
特别是，所述体胚发生培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，暗培养；培养时间为1-4个月，优选为1-2个月。
尤其是，所述未成熟体胚为球形胚、心形胚。
其中，步骤D)中所述体胚液体成熟培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L，优选为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L。
特别是，所述体胚液体成熟培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，暗培养；培养时间2-3周。
尤其是，所述成熟中期阶段的体胚为鱼雷胚、长梨形胚，优选为鱼雷胚。
特别是，对体胚液体成熟培养2-3周后的体胚进行筛分处理，过20-40目筛，选择尺寸在20-40目大小的体胚，即20-40目大小的鱼雷胚。
本发明的枫香属植物的成熟中期阶段的体胚除了采用上述培养方法获得之外，其他本领域中现有、已知的培养方法均适用于本发明，只要是成熟中期阶段的体胚(鱼雷胚或长梨形胚)均适用于本发明方法。
其中，所述胁迫处理培养包括光照-胁迫处理培养、暗-胁迫处理培养，优选为光照-胁迫处理培养。
特别是，所述胁迫处理培养获得的成熟体胚为体胚成熟后期子叶胚。
特别是，所述光照-胁迫处理培养是将低温培养后的低温处理体胚接种至胁迫处理培养基中，于光照条件下进行体胚的成熟培养，获得成熟子叶胚。
特别是，所述暗-胁迫处理培养是将低温培养后的低温处理体胚接种至胁迫处理培养基中，于黑暗条件下进行体胚的成熟培养，获得成熟子叶胚。
尤其是，所述胁迫处理培养基为改良Blaydes基本培养基+30-40g/L蔗糖+20-30g/L PEG4000+3-6g/L植物凝胶+1-2g/L酶水解酪蛋白，优选为改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG4000+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白。
特别是，所述光照-胁迫处理培养的培养条件：光周期为(10-16)光照/(8-14h)黑暗，优选为16h光照/8h黑暗；光照强度为1500-2000Lux；培养温度为25±2℃；培养时间为10-20天。
特别是，所述暗-胁迫处理培养的培养条件：黑暗条件；培养温度为25±2℃；培养时间为10-20天。
其中，所述无土栽培基质包括草炭、蛭石、珍珠岩，其中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为(2-3)：(1-2)：(1：2)，优选为3:1:1。
特别是，所述基质成苗培养的培养条件为：温度为25-30℃；相对湿度为(90±10)％；培养时间为2-4周，优选为3周。
尤其是，栽培过程中栽培深度为：无土栽培基质埋到子叶下端，保证枫香体胚的下胚轴完全被土壤覆盖，但不能将子叶埋住。
特别是，还包括用保护膜或育苗盖覆盖栽培后的子叶胚和栽培基质，保护膜或育苗盖起到保温保湿的作用，避免了没有种皮和胚乳的子叶胚失水。
尤其是，在基质成苗培养过程中，从栽培之日起每2-4d喷洒无土栽培营养液，直至子叶胚生根为止，其中所述无土栽培营养液为：1/2改良Blaydes基本液体培养基(不加有机成分)，优选为每3d喷洒一次。
特别是，在无土栽培的栽苗当天，用无土栽培营养液喷洒无土栽培基质后，在将成熟体胚(子叶胚)栽培在无土栽培基质中
尤其是，所述1/2改良Blaydes基本液体培养基(不加有机成分)的每次喷洒量为：无土栽培营养液与无土栽培基质的体积之比为(1-1.2)：(20-25)，优选为1：20。
所述无土栽培营养液为：不含有有机成分(肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1)的1/2改良Blaydes基本液体培养基。
特别是，还包括对光照培养获得的成熟体胚进行浸泡处理，即将成熟子叶胚放入含有NAA和IBA的蒸馏水中，浸泡1-2h后，再栽培于无土栽培基质中。
其中，所述蒸馏水中NAA的浓度为0.1-0.2mg/L，优选为0.1mg/L；IBA的浓度为2.0-3.0mg/L，优选为2.0mg/L.
特别是，浸泡时间优选为1h。
尤其是，还包括将在无土栽培基质中进行基质成苗培养的小苗转移至温室或气候室内，进行温室培养，获得所述的可以移栽的成熟完整的植株苗。
特别是，温室培养的培养条件为：温度为25-30℃，相对湿度为(50±10)％。
与现有枫香属植物的组织培养繁殖方法相比，本发明具有如下优点：
1、本发明方法克服了现有枫香属植物体细胞胚胎只能通过萌发培养基培养至生根后才能移栽基质中培养成苗的技术缺陷，本发明方法将成熟体胚(子叶胚)直接播种到基质培养基中，可以在较短的时间获得大量体胚苗，提高了体胚苗生产效率。
2、采用本发明的成熟体胚直接播种的方法，能充分发挥体胚发生的产业化优势，即在更短的时间里生产更多的体胚苗，进而提供更多的造林用枫香苗。
3、采用本发明方法显著降低了枫香属植物繁殖的生产成本。
4、采用本发明的成熟体胚直接播种的方法，使得生产过程中省略了一些常规培养步骤，方法简便，节约人力，同时子叶胚更利于运输和储存。本发明适用于枫香苗木产业化生产。
附图说明
图1A为杂交枫香的液体成熟培养获得大量鱼雷胚；
图1B为杂交枫香的液体成熟培养的子叶胚放大图；
图1C为杂交枫香的液体成熟培养的鱼雷胚放大图；
图2A为杂交枫香体胚经过前处理培养(低温培养、光照培养)的成熟子叶胚；
图2B为杂交枫香体胚依次经过低温培养，暗培养的子叶胚；
图3为杂交枫香体胚经过前处理培养后，不同形态尺寸的子叶胚；
图4为杂交枫香子叶胚直接栽培播种；
图5为杂交枫香成熟子叶胚直接栽培播种后硬化萌发；
图6为杂交枫香成熟子叶胚直接栽培播种后的体胚苗，其中A为长出根的体胚小苗；B为温室环境继续生长的杂交枫香体胚幼苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一、试验方法
本发明实施例参照下列已发表学术论文中的方法：W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation of hybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somatic embryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695。
二、试验材料
1、杂交枫香未成熟种子
本发明以杂交枫香(北美枫香为母本，枫香优树为父本)的未成熟种子为外植体实验材料。
于每年6,7月，采集杂交枫香(北美枫香×枫香)未成熟的球形蒴果，从中取出种子，作为外植体材料。
2、植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节剂采用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。
3、培养基
(1)改良的Blaydes培养基(Merkle et al.,1998)
表1改良Blaydes培养基的配方
Figure BDA0002906201470000071
Figure BDA0002906201470000081
改良的Blaydes培养基为基本培养基，根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液成分和称量好的植物凝胶、蔗糖、水解酪蛋白，pH调整至5.8。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
改良的Blaydes培养基基本配方参考：Merkle SA,Neu KA,Battle PJ,BaileyRL.1998.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature andmature tissues of sweetgum(Liquidambar styraciflua).Plant Science 132:169-178.
(2)诱导培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 1-4mg/L+6-BA 0-2mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(3)继代增殖培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1 mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(4)体胚发生培养基、体胚固体成熟培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3％，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(5)体胚液体成熟培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(6)固体成熟前处理培养基：改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(7)胁迫处理培养基：改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
(8)无土栽培基质：草炭、蛭石、珍珠岩的体积比3：1：1。
(9)无土栽培营养液：1/2改良Blaydes基本培养基(不加有机成分)，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。
4、培养条件
(1)胚性组织的诱导培养、继代培养、增殖固体培养的培养条件：黑暗条件，培养温度(25±2)℃。
(2)胚性组织增殖液体培养的培养条件：三角瓶，黑暗条件，培养温度(25±2)℃，摇床(100-120转/分)。
(3)体胚发生、固体成熟培养：培养皿，置于(25±2)℃条件下，暗培养。
(4)体胚液体成熟培养：三角瓶，置于(25±2)℃条件下，暗培养，摇床(100-120转/分)。
(5)体胚液体悬浮培养：三角瓶/培养瓶/生物反应器，置于(25±2)℃条件下，暗培养，摇床(100-120转/分)。
(6)体胚固体成熟低温培养：培养皿，置于4℃条件下，暗培养；
(7)光照-胁迫处理培养：置于(25±2)℃条件下，光周期：(10-16)光照/(8-14h)黑暗，光照强度为1500-2000Lux。
(8)暗-胁迫处理培养：(25±2)℃、黑暗条件培养
实施例2
1、外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养
参照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somaticembryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行外植体的灭菌和胚性愈伤组织诱导培养。
外植体未成熟合子胚在诱导培养基上培养3-4周后，胚性组织的生长速度开始变慢且外植体开始褐化，此时将胚性组织选出进行胚性组织继代增殖培养，转至继代培养基上于黑暗条件、(25±2)℃下进行重复继代增殖培养(每3周继代培养一次)。
2、体胚发生培养
将继代增殖培养的杂交枫香胚性组织接种到体胚发生培养基上，在黑暗条件下进行体胚的发生培养，其中，培养温度为(25±2)℃，体胚发生培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3g/L。
杂交枫香在体胚发生培养过程中，在增殖愈伤组织上形成未成熟体胚(即从初步发育的球形胚到未成熟鱼雷胚中间任何发育阶段的体胚)，体胚发生培养2个月(通常为1至4个月)后，获得具有初步发育体胚的愈伤组织，即胚性愈伤组织在体胚发生培养基上培养，转化成在肉眼下表面呈白色或淡黄色，体视镜下可以观察到大量微小的位于球形胚或/和心形胚发育阶段的初期体胚(即未成熟体胚，优选为“球形体胚、心形体胚”)。
3、体胚液体成熟培养：
将在体胚发生培养基上培养得到的初期体胚(即未成熟体胚，优选为“初期球形、心形体胚”)的胚性愈伤组织选出，接种于体胚液体成熟培养基中，体胚液体成熟培养基置于三角锥形瓶内，接种量为每100ml体胚成熟液体培养基中接种2g(通常为1-5g/100ml)，在摇床上进行体胚的悬浮液体成熟培养。杂交枫香体胚的液体成熟培养在黑暗条件下进行，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转，体胚液体成熟培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。
这个是胚性愈伤组织上出现初期体胚，并不是上面的所有愈伤组织都变成了体胚，所以选择开始长初期体胚的整块愈伤。
杂交枫香体胚液体成熟培养2-3周后获得中期体胚(即鱼雷胚)，观察体胚的生长状况和形态，体胚体积增大，体积数倍至数十倍于球形胚和心形胚，每个鱼雷胚具有明显的两级结构，下胚轴较长，子叶开始伸长未展开，鱼雷胚在液体培养基中呈独立、分散状态(如图1A)。
外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养、体胚发生培养、体胚液体成熟培养按照中国发明专利申请“申请号：201910776425.4；发明名称：一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法”进行处理。
实施例3杂交枫香体胚固体成熟前处理培养
杂交枫香体胚成熟中期阶段的鱼雷胚依次在固体成熟前处理培养基中进行低温培养、光照培养基中进行光照培养，体胚进一步成熟，形成晚期成熟子叶胚。
1、低温培养
将实施例2中在液体成熟培养基中培养2-3周后的体胚进行筛分处理，即过20-40目筛，选择尺寸在20-40目大小的体胚，筛选出大量的鱼雷胚(如图1C)；
将鱼雷胚接种于固体成熟前处理培养基上，放入4℃冰箱，进行低温暗培养1d，获得低温前处理体胚；其中，固体成熟前处理培养基为改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG4000+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白，黑暗培养。
低温可以使细胞停止分裂但不能停止细胞的生物合成，低温培养可以使得细胞内含物(蛋白质、淀粉、核酸等)积累，提高了子叶胚抵抗胁迫的能力。PEG和植物凝胶都是渗透调节物质，高渗透压可以抑制体胚过早萌发，增加贮藏蛋白质的积累，进而提高了体胚的质量；酶水解酪蛋白是多种氨基酸的复合物，添加可以提高体胚内源精胺和亚精胺的含量，有利于体胚的继续成熟，提高了体胚的质量。
2、光照-胁迫处理培养
低温暗培养1d后，将低温培养获得的前处理体胚接种至胁迫处理培养基中进行光照-胁迫处理培养，培养过程中控制培养温度为25±2℃；光照周期为16h光照/8h黑暗(通常为(10-16)h光照/(8-14)h黑暗)；光照强度为1500-2000Lux；光照培养基为改良Blaydes基本培养基+40g/L蔗糖+25g/L PEG4000+4g/L植物凝胶+1g/L酶水解酪蛋白
光照-胁迫处理培养10-20d后，杂交枫香植物鱼雷胚的下胚轴变粗，两片子叶明显伸长。在光培养条件下(光周期为16h光照/8h黑暗)子叶胚子叶部分呈淡绿色，下胚轴更粗(如图2A)；
杂交枫香的体胚经过前处理培养转化成成熟子叶胚，其形态、尺寸如图3。子叶胚长度基本大于5mm，长度大于5mm的子叶胚数量多，下胚轴较粗，子叶呈淡绿色，且子叶更伸展。
图2A是大量子叶胚的状态图，图3是单独拿出来不同尺寸的子叶胚。
实施例3A
除了将低温培养获得的前处理体胚接种至胁迫处理培养基中，在黑暗条件下进行暗培养(即进行暗-胁迫处理培养)之外，其余与实施例3相同。
暗-胁迫处理培养过程中，在暗培养培养下，鱼雷胚的下胚轴开始继续伸长，粗度也逐渐变大，子叶开始伸长并展开。在培养10-20d后获得大量成熟子叶胚。
在暗培养条件下(25±2℃)，暗培养10-20d获得的成熟子叶胚呈乳白色(如图2B)，下胚轴跟光照-胁迫处理培养比，较细。子叶胚长度不等，在4～6mm之间，且长度绝大多数小于5mm，长度大于5mm的数量较少。
实施例4杂交枫香子叶胚在无土栽培基质直播
将草炭、蛭石、珍珠岩按照体积比为3:1:1(v:v:v)的比例混合，配制成枫香无土栽培基质，并分装至深穴盘(105孔)中；
将实施例3、3A中经过前处理培养获得的子叶胚用自来水洗净残留的培养基，接种放入加有0.1mg/L NAA和2.0mg/L IBA的无菌蒸馏水中浸泡1h，然后取出，直接栽种(播种)至装有枫香无土栽培基质的深穴盘中，如图4，其中：
在栽苗的当天，用无土栽培营养液即1/2浓度的改良Blaydes基本液体培养基(不加有机成分)浇透穴盘中的基质，即向无土栽培基质中喷洒无土栽培营养液，其中无土栽培营养液的喷洒量为无土栽培营养液与无土栽培基质的体积之比为1：20(通常为(1-1.2)：(20-25))；在深穴盘表面再覆盖一层蛭石，用喷嘴头将蛭石全部淋湿，减少播种过程中，体胚与基质间的摩擦。
因为体胚不像种子一样有胚乳提供营养，所以需要添加无土栽培营养液，帮助体胚存活，直至子叶胚生根后停止补充无土栽培营养液。
播种过程中最适合深度埋到子叶下端，保证枫香体胚的下胚轴完全被土壤覆盖，但不能将子叶埋住，每孔播种一粒子叶胚，然后，盖上穴盘盖或者覆一层保鲜膜，其中保鲜膜或育苗盖上具有通气孔。
将穴盘移至气候室，要保证气候室温度为25-30℃，相对湿度为(90±10)％，在子叶胚的根长出之前每3d(通常为2-4d)喷洒无土栽培营养液，其中无土栽培营养液的喷洒量为无土栽培营养液与无土栽培基质的体积之比为1：20(通常为(1-1.2)：(20-25))。
子叶胚播种5-7d后子叶开始伸展，下胚轴硬化直立(如图5)；在10-15d以后子叶开始伸长展开，长出主根(如图6A)。在温室环境继续生长，得到杂交枫香体胚幼苗(如图6B)。
硬化培养是子叶胚放进基质的初始阶段，刚放进去的时候子叶胚是软的，后面培养5-7d后下胚轴和子叶都挺直生长，这个可以成为萌发的标准。
实施例5枫香子叶胚直播后体胚苗成苗率试验
将实施例3、3A中经过固体成熟前处理培养获得的子叶胚分别按照表2中体胚的颜色和长度分成4类，每类30个；然后将无菌的成熟子叶胚按照实施例4的方法进行直接无土栽培培养，其中：
实施例3中成熟子叶胚(绿色)按照体胚长度分为2类：长度≥5mm，30个；长度<5mm，30个；
实施例3A中成熟子叶胚(白色)按照体胚长度分为2类：长度≥5mm，30个；长度<5mm，30个。
将子叶胚播种至深穴盘内，在播种的当天，按照与实施例4相同的方法进行处理；然后将深穴盘移至气候室进行培养，培养条件与实施例4相同；播种5-7d后，统计子叶伸展，下胚轴硬化直立(如图5)的数量，计算体胚苗萌发率，实验结果如表2。培养2周后，统计长出根的体胚幼苗，计算体胚苗成活率，实验结果如表3。
表2杂交枫香成熟子叶胚的气候室培养萌发情况
Figure BDA0002906201470000131
表3杂交枫香成熟子叶胚的气候室培养成苗情况
Figure BDA0002906201470000132
实验证明，杂交枫香体胚苗的成苗率与固体成熟前处理后子叶胚的质量密切相关(表2)。鱼雷胚经过低温处理、光照、黑暗、渗透压胁迫、充足氮源的处理下，特别是在光照-胁迫处理的条件下，形成的子叶胚中内含物积累更多。其中绿色子叶胚，长度在5毫米以上，具有较大尺寸的子叶胚在条件更稳定的气候室成活率高，达到57％以上，甚至可能达到60％以上。
对照例
将实施例2的步骤2)体胚发生培养获得的初期体胚(即未成熟体胚，优选为“初期球形、心形体胚”)的胚性愈伤组织选出，接种于体胚液体成熟培养基中，体胚液体成熟培养基置于三角锥形瓶内，接种量为每100ml体胚成熟液体培养基中接种2g(通常为1-5g/100ml)，在摇床上进行体胚的悬浮液体成熟培养。杂交枫香体胚的液体成熟培养在黑暗条件下进行，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转，体胚液体成熟培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L；
枫香体胚液体成熟培养过程中每3-4周更换新培养基，进行继代培养，以提供充足的营养成分以保证体胚的持续生长、成熟，直接进行液体成熟培养至子叶胚阶段，成熟体胚的体积比接种时的初期幼小体胚显著增大，成熟体胚具有两片发育良好的子叶(如图1B)；
将体胚液体成熟培养获得的子叶胚用自来水洗净残留的培养基，接种放入加有0.1mg/L NAA和2.0mg/L IBA的无菌蒸馏水中浸泡1h，然后取出，直接栽种(播种)至装有枫香无土栽培基质的深穴盘中，栽培、管理等与实施例4相同。
但因为液体成熟培养直接获得的成熟子叶胚积累的内含物较少，体胚的尺寸较小，特别是子叶窄长且薄，直接播种到无土栽培基质中不能存活，获得的植株苗。
本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种枫香属植物体胚直接播种成苗的方法，其特征是，对枫香属植物的体胚成熟中期阶段的体胚依次进行低温培养、胁迫处理培养的前处理，获得成熟体胚；然后将成熟子叶胚放入含有NAA和IBA的蒸馏水中，浸泡1-2h后，再直接栽培于无土栽培基质中，进行基质成苗培养，获得植株苗，其中：
所述枫香属植物为枫香、北美枫香或杂交枫香，其中杂交枫香以北美枫香为母本，枫香为父本；所述体胚成熟中期阶段的体胚为鱼雷胚或长梨形胚；
所述低温培养是将枫香属植物的体胚成熟中期阶段的体胚接种至固体成熟前处理培养基中，于低温4-6℃、黑暗条件下进行体胚的前处理培养，获得低温处理体胚；其中固体成熟前处理培养基为改良Blaydes基本培养基 +30-40 g/L蔗糖 + 20-30g/L PEG + 3-6g/L植物凝胶 + 1-2g/L酶水解酪蛋白，低温培养时间为1-2d；
所述胁迫处理培养为光照-胁迫处理培养或暗-胁迫处理培养，即将低温培养后的低温处理体胚接种至胁迫处理培养基中，于光照条件或黑暗条件下进行体胚的成熟培养，获得成熟子叶胚，其中，
所述光照-胁迫处理培养的培养条件：光周期为（10-16）光照/（8-14h）黑暗；光照强度为1500-2000Lux；培养温度为25±2℃；培养时间为10-20天；
所述暗-胁迫处理培养的培养条件：黑暗条件；培养温度为25±2℃；培养时间为10-20天；
所述蒸馏水中NAA的浓度为0.1-0.2mg/L，IBA的浓度为2.0-3.0mg/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述胁迫处理培养基为改良Blaydes基本培养基 + 30-40 g/L蔗糖 +20-30g/L PEG + 3-6g/L植物凝胶 + 1-2g/L酶水解酪蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述无土栽培基质包括草炭、蛭石、珍珠岩，其中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为（2-3）：（1-2）：（1-2）。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述无土栽培基质包括草炭、蛭石、珍珠岩，其中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3:1:1。
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