KR0170820B1 - 체세포배의 배양에 의한 재분화된 인삼식물체의 생산방법 - Google Patents

체세포배의 배양에 의한 재분화된 인삼식물체의 생산방법 Download PDF

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Abstract

이 발명은 인삼 종자에서 적출한 자엽에서 유기된 체세포배를 증식시킨 구형배를 질소 농도가 변형된 MS 배지에 오옥신류와 사이토카이닌을 첨가한 고체 배양기에 접종하여 4-25℃에서 자엽형배로 발육시키는 공정, 발육된 자엽형배를 질소농도가 변형된 MS배지에 오옥신과 사이토카이닌이 첨가된 고체 배양기에 접종하여 4-25℃에서 2-6주간 배양하여 자엽형배를 성숙시키는 공정 및 발육된 자엽형배를 질소 농도가 변형된 MS배지에 지베렐린을 첨가한 고체 배양기에 접종하여 4-25℃에서 배양시켜 배를 발아시키는 공정을 포함하는 인삼 식물체 제조 방법으로 구성됨. 본 발명에 따르면 인삼의 체세포배를 증식시킨 구형배가 자엽형배로 발육된 다음 충분한 성숙공정을 거치므로 줄기와 뿌리가 모식물과 동일한 인삼 식물체가 얻어짐.

Description

[발명의 명칭]
체세포배의 배양에 의한 재분화된 인삼식물체의 생산방법
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 조직 배양을 통하여 인삼식물체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 특히 인삼의 체세포로부터 체세포배를 유도하고 체세포배를 배양하여 인삼 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
[선행 기술]
체세포배 발생과정을 통하여 분화된 식물체의 유전자형은 모식물과 유사한 것이 대부분이므로 최근에는 번식이 까다롭거나 장시일이 소요되는 식물의 체세포배를 배양하여 모식물과 동일한 식물체를 생산하는 방법이 널리 이용되고 있다.
인삼은 종자로 번식하는 다년생 식물로서 채종하는데 3-4년이 소요되고 일회 채종량이 타식물에 비하여 대단히 적으므로 개체 증식 및 보급에 장시일이 소요되므로 최근에는 조직배양방법을 이용한 인삼식물체의 증식에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다.
Bot. Zh. 7:9606-913, 1968. 인삼조직배양을 통한 기관발생과 체세포배 발생에 관한 연구에는 조직배양방법에 의하여 인삼의 재분화에 대한 내용이 기재되어 있는바, 줄기는 분화되었으나 뿌리의 분화에는 성공하지 못한 것으로 나타났다.
Theor. Appl. Genet. 57:133-135, 1980. 인삼의 뿌리조직에서 유기한 켈러스에서 체세포배 발생을 통한 식물체 재분화에 관한 연구에는 인삼의 뿌리조직에서 유기된 켈러스를 2,4-D 1㎎/ℓ를 첨가한 MS배양기에서 배양 8개월후에 갈변된 켈러스에서 체세포배가 발생하였으며 비에이피(BAP) 1㎎/ℓ와 지벨렐린(GA3) 1㎎/ℓ를 첨가한 1/2배 MS고체배양기에 체세포배를 접종 배양한 결과 줄기만 분화된 식물체가 얻어지고 뿌리가 나타나지 않은 것으로 나타났다.
Experimentia 42:193-194, 1986. 인삼의 켈러스 배양을 통한 식물체 재분화에 관한 연구에는 인삼의 뿌리조직에서 유기된 켈러스를 2,4-D 1㎎/ℓ와 카이네틴(kinetin) 0.1㎎/ℓ를 첨가한 MS배양기에 접종 배양하였을 때 분열조직이 형성되었으며 카이네틴 1㎎/ℓ을 첨가한 MS배양기에 분열조직을 접종 배양하였을대 지상부가 분화+하였으며 IBA 1㎎/ℓ가 첨가된 MS배양기에 분화된 지상부를 배양한 결과 실뿌리는 형성되었지만 정상적인 인삼의 뿌리를 갖춘 식물체로는 생장하지 못한 것으로 나타났다.
Plant Cell Reports, 10: 277-281, 1991. 인삼의 원형질체로부터 체세포배 발생을 통한 식물체 재분화에 대한 연구에는 체세포배 발생능이 높은 인삼 배발생켈러스로부터 원형질체를 나출시킨 다음 이로부터 켈러스를 유도한 후 2,4-D 1㎎/ℓ와 카이네틴 0.01㎎/ℓ을 첨가한 MS배양기에 접종배양하여 체세포배를 유도한 후 비에이피 1㎎/ℓ와 지베렐린 1㎎/ℓ를 첨가한 1/2배 MS배양기에 체세포배를 접종 배양하여 발아된 식물체를 얻었으나 정상적인 인삼의 줄기와 뿌리를 갖춘 식물체로는 생장하지 못한 것으로 나타났다.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 34:157-162, 1993, 체세포배 발생을 통한 인삼의 급속 증식에서는 미성숙된 인삼 자엽조직을 2,4-D 1㎎/ℓ와 카이네틴 0.01㎎/ℓ를 첨가한 MS배양기에 접종하여 체세포배를 유도시킨 후 2,4-D 1㎎/ℓ를 첨가한 MS배양기에 자엽형배를 접종하여 2차, 3차의 체세포배를 유도하고 유도된 2차 3차 체세포배를 카이네틴 1㎎/ℓ이 첨가된 MS배양기로 옮겨 20℃에서 5주간 배양하여 지상부를 유도한 후 지베렐린 1㎎/ℓ와 카이네틴 1㎎/ℓ를 첨가한 MS배양기로 옮겨 뿌리를 유도하였으나 대부분의 식물체가 다시 탈분화되었으며 정상적인 인삼의 줄기와 뿌리를 갖춘 식물체로는 생장하지 못한 것으로 나타났다.
Biotechnology in Agriculture and Forestry, 31, 체세포배 발생과 인공종자 II(Y.P.S.Bajaj), 343-356,1995. 인삼의 체세포배 발생에서는 인삼 화아조직을 2,4-D 1㎎/ℓ가 첨가된 MS배양기에 접종하여 배양하였을 때 체세포배가 발생하였으며 NAA 2㎎/ℓ와 비에이피 10㎎/ℓ가 첨가된 MS배양기에 체세포배를 배양하였을 때 배의 증식이 일어났고 지베렐린 0.5㎎/ℓ와 비에이피 0.5㎎/ℓ가 첨가된 1/2배 MS배양기에 증식된 배를 배양하였을 때 배가 발아하여 지상부와 뿌리를 갖춘 식물체를 얻었으나 지상부가 더 이상 생장하지 않고 자엽과 유사한 유식물 상태를 유지한 것으로 나타났다.
전술한 바와같이 인삼의 뿌리, 자엽, 화서등의 조직에서 체세포배를 유기시킨 후 체세포배에서 식물체를 분화시켰으나 지상부만 출현하거나 지상부는 정상이나 지하부가 실뿌리 형태를 이루거나 또는 지하부는 정상이나 지상부가 자엽상태에 머무는 등 정상적인 식물체를 얻는데는 성공하지 못하였는 바, 이는 인삼 특유의 배발달 및 성숙단계를 충분히 거치지 않은 상태에서 배의 발아를 시도하였기 때문으로 사료된다.
[본 발명의 목적]
인삼체세포배를 조절된 온도와 적절한 배양기에서 배양하면서 구형배에서 자엽형배로 발육시키고 이어 배성숙과정을 거친 다음 배의 발아를 도모하여 종자에서 발아한 유식물과 동일한 생육특성을 갖는 인삼식물체를 육성하는 것이다.
[발명의 개요]
전술한 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 질소원의 농도를 변형시킨 MS배지에 오옥신류와 사이토카이닌이 첨가된 고체배양기에 구형의 체세포배를 접종하여 4-25℃에서 4-6주간 배양하며 자엽형배로 발육시키는 공정, 질소원의 농도를 변형시킨 MS배지에 오옥신과 사이토카이닌이 첨가된 고체배양기에 자엽형배를 접종하여 4-25℃에서 2-6주간 배양하여 배를 성숙시키는 공정, 및 질소원의 농도를 변형시킨 MS배지에 지베렐린이 첨가된 고체배양기에 성숙된 배를 접종하여 4-25℃에서 3-6주간 배양시켜 배를 발아시켜 인삼유식물을 생산하는 공정으로 구성된다.
전술한 본 발명의 각 단위공정에서의 처리조건은 다음과 같다.
1) 배의 발육을 위한 공정:
MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3:10-60mM, NH4NO3:0-40 mM
오옥신류의 농도범위: 0.01-10㎎/ℓ
사이토카이닌류의 농도범위: 0-1.0㎎/ℓ
당류의 농도범위: 1-10중량%
배양온도의 범위: 4-25℃
2) 배의 성숙을 위한 공정:
MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3:10-60 mM, NH4NO3:0-20 mM
오옥신류의 농도범위: 0.01-1.0㎎/ℓ
사이토카이닌류의 농도범위: 0.01-10㎎/ℓ
당류의 농도범위: 1-10중량%
배양온도의 범위: 4-25℃
3) 배의 발아를 위한 공정:
MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3:10-40mM, NH4NO3:0-20 mM
지베렐린류의 농도범위: 0.001-10㎎/ℓ
당류의 농도범위: 1-10중량%
배양온도의 범위: 4-25℃
본 발명에 있어서 배의 발육을 위한 공정, 배의 성숙을 위한 공정, 및 배의 발아를 위한 공정에 사용하는 MS배지의 질소원으로는 KNO3와 NH4NO3을 사용하는바, 이들은 10-60mM KNO3와 0-40mM NH4NO3을 배합 사용하는 것이 좋다. 가장 바람직한 KNO3의 농도는 10-40 mM이고, NH4NO3의 농도는 0-20 mM이다.
본 발명에 있어서 오옥신류로는 2,4-D, NAA, IAA 등이 사용될 수 있으며 농도는 0.001-10㎎/ℓ, 특히 0.01-1㎎/ℓ의 범위로 되게 하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 사이토카이닌류로는 카이네틴, 비에이피, 제아틴(zeatin)등이 사용될 수 있으며 농도는 0.001-10㎎/ℓ, 특히 0.01-1㎎/ℓ의 범위로 되게 하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서 당류로는 서당, 포도당, 과당등이 사용된다.
본 발명에 있어서 배양온도는 4-25℃가 범위이지만 특히 4-20℃ 범위가 더 바람직하다.
[발명의 구체적인 설명]
본 발명을 각개 공정에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
인삼 종자로부터 무균적으로 적출한 자엽을 수크로스 5중량%와 2,4-D 1㎎/ℓ을 첨가한 MS고체배양기에 접종하여 체세포배를 유기시킨 다음, 수크로스 5중량%와 2,4-D 0.5㎎/ℓ 및 BAP 0.01㎎/ℓ를 첨가시킨 MS고체배양기에서 체세포배를 증식시켜서 본 발명의 재료로 사용되는 구형배를 얻었다.
1) 배의 발육을 위한 공정:
질소원인 KNO3와 NH4NO3농도가 각기 10-60 mM, 0-40 mM로 변형된 MS배지를 사용하였으며 당류 1-10중량%, 오옥신류(2,4-D, NAA, IAA) 0.001-10㎎/ℓ, 사이토카이닌류(비에이피, 카이네틴, 제아틴) 0.001-10㎎/ℓ, 및 겔라이트(gelrite) 0.2%를 첨가한 고체배지를 10cm의 샤레에 35㎖씩 분주한 다음 위에서 얻은 구형배를 배양기에 접종하여 25℃에서 4-6주간 배양시켜 배를 발육시켜 자엽형배를 얻었다.
2) 배의 성숙육을 위한 공정:
질소원인 KNO3와 NH4NO3농도가 각기 10-60 mM, 0-40 mM로 변형된 MS배지에 당류 1-10중량%, 오옥신류(2,4-D, NAA, IAA) 0.001-10㎎/ℓ, 사이토카이닌류(비에이피, 카이네틴, 제아틴) 0.001-10㎎/ℓ, 및 겔라이트 0.2%를 첨가한 고체배지를 10cm의 샤레에 35㎖씩 분주한 다음 자엽형배를 배양기에 접종하여 4-25℃의 온도범위에서 2-6주간 배양하며 자엽형배를 성숙시켰다.
3) 배의 발아를 위한 공정:
질소원인 KNO3와 NH4NO3농도가 각기 10-40 mM, 0-20 mM로 변형된 MS배지에 당류 1-10중량%, 지베렐린 0.001-10㎎/ℓ, 겔라이트 0.2%를 첨가한 고체배지를 100㎖ 삼각프라스크에 35㎖씩 분주한 다음 성숙된 배를 배양기에 접종하여 4-25℃의 온도범위에서 3-6주간 배양하며 배를 발아시켰다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 배의 발육을 위한 공정은 실시예 1에서 13에 기재하고, 배의 성숙을 위한 공정은 실시예 14에서 26에 기재하며 배의 발아를 위한 공정은 실시예 27에서 35에 기재한다.
[실시예 1]
MS배지의 질소첨가량인 20mM KNO3와 20 mM NH4NO3대신에 20 mM KNO3가 첨가된 변형된 MS배지에 당류인 수크로스 3중량%, 오옥신류인 2,4-D 1㎎/ℓ, 사이토카이닌류인 비에이피 0.01㎎/ℓ, 및 겔라이트 0.2중량%을 첨가한 체세포배를 10cm의 사례에 35㎖씩 분주한 다음 구형의 체세포배를 배양기에 접종하여 25℃에서 4-6주간 배양하며 배의 발육을 조사하였다.
[실시예 2]
질소원으로 10 mM NH4NO3와 10 mM KNO3가 첨가된 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 3]
질소원으로 10 mM NH4NO3와 20 mM KNO3가 첨가된 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 4]
질소원으로 10 mM NH4NO3와 40 mM KNO3가 첨가된 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 5]
오옥신류인 2,4-D 1㎎/ℓ 대신에 0.1㎎/ℓ 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 6]
오옥신류인 2,4-D 1㎎/ℓ 대신에 0.01㎎/ℓ 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 7]
오옥신류인 2,4-D 1㎎/ℓ 대신에 NAA 1㎎/ℓ 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 8]
사이토카이닌인 비에이피 0.01㎎/ℓ 대신에 0.001㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 9]
사이토카이닌인 비에이피 0.01㎎/ℓ 대신에 카이네틴 0.01㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 10]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 5중량%가 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 11]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 5중량%가 첨가된 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 12]
배양온도 25℃ 대신에 20℃에서 배양한 것 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다
[실시예 13]
배양온도 25℃ 대신에 10℃에서 배양한 것 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다.
MS기본배지의 질소원 KNO와 NHNO의 첨가량은 각기 20 mM인바, NHNO를 기본량의 절반이하로 첨가하고 KNO는 10-40 mM을 첨가하였을 때 구형배가 심장형배, 어뢰형배를 거쳐 자엽형배로 발육하였으며(실시예 1,2,3,4), 오옥신류인 2,4-D를 0.01-1㎎/ℓ 첨가하였을 때 배의 발육이 이루어졌으며(실시예 3,5,6). NAA 1㎎/ℓ를 첨가하였을 때 배의 발육이 이루어졌으며(실시예 7), 사이토카이닌류인 비에이피를 0.001-0.01㎎/ℓ를 첨가하였을 때 배의 발육이 이루어졌으며(실시예 3,8), 카이네틴을 0.01㎎/ℓ를 첨가하였을 때 배의 발육이 이루어졌으며(실시예 9), 당류인 수크로스를 1-5중량% 첨가하였을 때 배의 발육이 이루어졌으며(실시예 3,10,11), 배양온도 10-25℃에서 배양하였을 때 배의 발육이 이루어졌다(실시예 3,12,13).
[실시예 14]
MS기본배지의 질소첨가량인 20 mM KNO와 20 mM NHNO대신에 10mM KNO가 첨가된 변형된 MS배지에 당류인 수크로스를 3중량%, 오옥신류인 NAA 0.1㎎/ℓ, 사이토카이닌류인 비에이피 1.0㎎/ℓ, 겔라이트 0.2중량%를 첨가한 고체배지를 35㎖씩 10cm의 샤레에 분주한 다음 성숙된 배를 배양기에 접종하여 20℃에서 2-6주간 배양하며 배의 성숙을 도모한다.
[실시예 15]
질소첨가량으로 10 mM KNO대신에 10 mM NHNO와 10 mM KNO가 첨가된 외에는 실시예 14와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 16]
질소첨가량으로 10 mM KNO대신에 10 mM NHNO와 20mM KNO가 첨가된 외에는 실시예 14와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 17]
질소첨가량으로 10 mM KNO대신에 10 mM NHNO와 40mM KNO가 첨가된 외에는 실시예 14와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 18]
오옥신류인 NAA 0.1㎎/ℓ 대신에 0.01㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 19]
오옥신류인 NAA 0.1㎎/ℓ 대신에 IAA 0.1㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 20]
사이토카이닌인 비에이피 1㎎/ℓ 대신에 0.1㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 21]
사이토카이닌인 비에이피 1㎎/ℓ 대신에 0.01㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 22]
사이토카이닌인 비에이피 1㎎/ℓ 대신에 제아틴 1㎎/ℓ가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 23]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 1중량%가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 24]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 5중량%가 첨가된 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 25]
배양온도 20℃ 대신에 10℃에서 배양한 것 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 26]
배양온도 20℃ 대신에 4℃에서 배양한 것 외에는 실시예 15와 동일한 방법으로 배양하였다.
MS기본배지의 질소원인 KNO와 NHNO의 첨가량은 각기 20 mM인 바, NHNO를 기본첨가량인 20 mM의 절반이하로 첨가하고 KNO는 10-40 mM 농도범위에서 첨가하였을때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 14,15,16,17), 오옥신류인 NAA를 0.01-1㎎/ℓ 첨가하였을 때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 15,18). IAA를 0.1㎎/ℓ를 첨가하였을 때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 19), 사이토카이닌인 비에이피를 0.01-1㎎/ℓ을 첨가하였을 때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 15,20, 21), 제아틴을 1㎎/ℓ를 첨가하였을 때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 22), 수크로스 1-5중량% 첨가하였을 때 배의 성숙이 이루어졌으며(실시예 15,23,24), 배양온도 4-20℃에서 배양하였을 때 배의 성숙이 이루어졌다(실시예 15,25,26).
[실시예 27]
MS기본배지의 질소첨가량인 20 mM KNO와 20 mM NHNO대신에 10 mM KNO가 첨가된 변형된 MS배지에 당류인 수크로스를 3중량%, 지베렐린 1.0㎎/ℓ, 겔라이트 0.2중량%를 첨가한 고체배지를 35㎖씩 100㎖ 삼각프라스크에 분주한 다음 성숙된 배를 배양기에 접종하여 20℃에서 3-6주간 배양하며 배의 발아를 도모하였다.
[실시예 28]
질소첨가량으로 10 mM KNO대신에 10 mM NHNO와 10 mM KNO가 첨가된 외에는 실시예 27과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 29]
질소원으로 10 mM KNO대신에 10 mM NHNO와 20mM KNO가 첨가된 외에는 실시예 27과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 30]
지베렐린 1㎎/ℓ 대신에 0.1㎎/ℓ 첨가된 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 31]
지베렐린 1㎎/ℓ 대신에 0.01㎎/ℓ 첨가된 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 32]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 1중량%가 첨가된 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 33]
당류인 수크로스 3중량% 대신에 5중량%가 첨가된 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 34]
배양온도 20℃ 대신에 10℃에서 배양한 것 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
[실시예 35]
배양온도 20℃ 대신에 4℃에서 배양한 것 외에는 실시예 28과 동일한 방법으로 배양하였다.
MS기본배지의 질소원인 KNO와 NHNO의 첨가량은 각기 20 mM인바, NHNO는 기본량의 절반이하로 첨가하고 KNO는 10-20 mM을 첨가하였을 때의 정상적인 발아가 이루어졌으며(실시예 27,28,29), 지베렐린 0.01-1㎎/ℓ를 첨가한 배양기에서 배의 정상적인 발아가 이루어졌으며(실시예 28,30,31). 수크로스 1-5중량%를 첨가하였을 때 배의 정상적인 발아가 이루어졌으며(실시예 28,32,33), 배양온도 4-20℃에서 배양하였을 때의 배의 정상적인 발아가 이루어졌다(실시예 28,34,35 ).

Claims (13)

  1. 오옥신과 사이토카이닌을 첨가한 MS고체배양기에 구형의 체세포배를 접종하여 4-25℃에서 4-6주간 배양시켜 자엽형배로 발육시키는 공정, 오옥신과 사이토카이닌이 첨가된 MS고체배양기에 전기한 자엽형배를 접종하여 4-25℃에서 2-6주간 배양시켜 배의 성숙을 도모하는 공정, 및 지베렐린이 첨가된 MS고체배양기에 전기한 성숙된 배를 접종하여 4-25℃에서 3-6주간 배양시켜 배의 발아를 도모하는 공정을 포괄하는 체세포배배양을 통한 인삼식물체의 생산방법.
  2. 청구범위 1항에서, 자엽형배로의 발육 공정이 (MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3:10-60 mM, NH4NO3:0-40 mM, 오옥신류의 농도범위:0.001-10㎎/ℓ, 사이토카이닌의 농도범위:0-1.0㎎/ℓ, 당류의 농도범위:1-10중량%, 배양온도의 범위:4-25℃) 조건하에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구범위 2항에서, MS고체배양기가 질소원으로서 KNO3:10-40 mM, NH4NO3:0-20 mM을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구범위 2항에서, 오옥신류가 2,4-D, NAA, IAA 중에서 선택된 것이고 0.01 -1㎎/ℓ의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구범위 2항에서, 사이토카이닌류가 비에이피, 카이네틴, 제아틴 중에서 선택된 것이고 0-0.1㎎/ℓ의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구범위 1항에서, 배의 성숙 공정이 (MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3: 10-60 mM, NH4NO3:0-10 mM, 오옥신류의 농도범위:0-1.0㎎/ℓ, 사이토카이닌류의 농도범위:0.01-10㎎/ℓ, 당류의 농도범위:1-10중량%, 배양온도의 범위:4-25℃) 조건하에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구범위 6항에서, MS고체배양기가 질소원으로서 KNO3:10-40 mM, NH4NO3:0-10 mM을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구범위 6항에서, 오옥신류가 2,4-D, NAA, IAA 중에서 선택된 것이고 0.00 1-0.1㎎/ℓ의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구범위 6항에서, 사이토카이닌류가 비에이피, 카이네틴, 제아틴 중에서 선택된 것이고 0.01-0.1㎎/ℓ의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구범위 6항에서 배양온도가 4-20℃임을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구범위 1항에서, 배의 발아 공정이 (MS배지의 질소원의 농도범위: KNO3:10 -40 mM, NH4NO3:0-20 mM, 지베렐린류의 농도범위:0.001-10㎎/ℓ, 당류의 농도범위:1-10중량%, 배양온도의 범위:4-25℃) 조건하에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구범위 10항에서, MS고체배양기가 질소원으로서 KNO3:10-40 mM, NH4NO3:0-10 mM을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구범위 10항에서, 지베렐린류가 0.01-1.0㎎/ℓ의 농도로 사용되고 배양온도가 4-20℃임을 특징으로 하는 방법.
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