JPH01165316A - 培養細胞からのワタの再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は１体細胞胚形成の方法により、培養細胞からワ
タ植物を再生する方法に関する。

本発明の方法は、従来技術に記載された方法よりも優れ
ている。

胚形成は、器官形成として知られているもう一つの植物
再生方法とは区別されるべきである０両方の技術におい
て、根、葉、または茎のような原料から得られる外植体
が培養される。

新しい分化組織は、外植体から直接生成するか、または
外植体から発達した分化していないカルス組織から生成
する。器官形成においては、新しく分化した組織は根及
び／または吸枝である。一方、体細胞胚形成においては
、新しく分化した組織は結合した根と吸枝の分裂中心、
即ち胚を含む二極構造である。胚の発生の間に種々の段
階を確認することができる。これらの段階には、当該技
術分野において、球形期（ｇｌｏｂｕｌａｒ　　ｓｔａ
ｇｅ　　）、ハート形期（ｈｅａｒｔ３ｔａｇｅ　）　
、魚雷形期（ｔｏｒｐｅｄｏ　ｓｔａｇｅ　）及び成熟
期（ｍａｔｕｒｅｓｔａｇｅ　）として知られている段
階が含まれる。

適当な条件下で、胚は発芽し、苗木に成長し、そして次
に完全な植物体に成長する０体細胞胚は大量に生産され
うる。大量生産の増殖及びクローニングに適している。

いくつかの場合においては、体細胞胚形成により生産さ
れた完全な植物体の細胞が胚形成のカルスを製造するた
めに使用される細胞と遺伝的に異なることが見出されて
いる。この方法により変異させた植物細胞は、ツマクロ
ーナルバリエーション（ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ　　ｖａ
ｒｉａｔｉｏ　ｎ　）として知られている遺伝的変異を
受けたと言われる。いくつかの場合においては、新しい
遺伝子型は望ましい特徴を示す、植物細胞の培養液を介
しての変異した遺伝子型の導入は、体細胞胚形成のもラ
一つの用途を構成する。

体細胞胚形成は、特別な性質のために選択された培養細
胞から植物を再生するためにも使用しうる０例えば、許
容性が望まれる植物毒性に培養細胞を暴露する。その後
、該植物毒性を最も許容することのできた細胞から植物
を再生させるために体細胞胚形成を使用することができ
る。この方法において培養細胞及び組織を用いてのイン
　ヴイトロ（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　）での選択はチャレ
フ（ｃｈａｌｅｆｆ　）等によりサイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）　２２３　、１１４８〜１１５１　（１９８４
−）に記載されている。

従来技術においては、体細胞胚形成により組織からワタ
植物を再生させことに関する報告がある０例えば、ラン
ガン（Ｒａｎｇａｎ　）等　（ＩｎＶｉｔｒｏ　、２０
．　２５８　（１９８４）　）は、１８８４年のヒユー
ストンにおける組織培養学会の第３５回記念会合におい
て、体細胞胚形成によるワタ（ゴシビウム　ヒルスツム
）の再生の成功を報告している。ダビドニス（Ｄａｖｉ
ｄｏｎｉｓ　）等は、２年齢のカルス組織から得られた
ゴシピウム　ヒルスツムの体細胞前胚（ｐｒｏｅｍｂｒ
ｙｏｉｄｓ）から、いくつかの植物を生産した（Ｐｌａ
ｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

３２．８９　（＋９８３）　）　、　７４ナー（Ｆｉｎ
ｅｒ）等は、ゴシビウム　りロッシアヌム（Ｇ　、　ｋ
ｌｏｔｚｓｃｈｉａｎｕ−）の体細胞前胚から植物を再
生した（ＴＣＡＲｅｐｏｒｔ　、　１７．８　　（１９
８３））　、　　スミス（Ｓ＋５ｉｔｈ）等は、ゴシビ
ウム、アルポレウム（Ｇ　、ａｒｂｏｒｅｕｍ）からの
子葉のカルスから一つの苗木を再生した（■１　　Ｖｉ
ｔｒｏ、腺、　３２９　（１９７７））　。

従来技術に開示されている方法は、固体の培地上に胚を
生産しており、該方法は市販するのに必要なように、大
量に植物を生産するには不充分である。培養した細胞か
ら植物を再生する能力は、増殖体の形成及び増殖体から
の植物の再生が催事的に行なわれる場合にのみ、実用性
を有する。従って、体細胞胚形成によりワタ植物を再生
するには、さらに能率的な方法が必要とされる。

本発明の目的は、培養されたワタ細胞から体細胞胚を生
産するための、並びに該胚から植物を再生するための従
来技術の方法よりも能率的な方法にある０本発明の他の
目的は、細胞懸濁培養系を利用した体細胞胚形成の方法
にある。

本発明の種々の目的は、下記の工程： （ａ）ワタ植物の組織を、約２０℃ないし４０℃で、褐
色化を防止するために充分な副次培養液と共に、適当な
カルス誘導培地上に置くことにより、ワタのカルスの形
成を誘導する工程；（ｂ）該カルスを、少なくとも１種
類のオーキシンを比較的低い濃度で含む適当な前胚細胞
塊誘導液体培地に、前胚細胞塊の塊状集合体が形成され
、そして迅速に増殖し始めるまで、４０ｍｇ／１以下の
濃度で懸濁する工程ン並びに （ｃ）迅速に増殖している前胚細胞塊の塊状集合体を、
より小さく、より均一に分散された前胚細胞塊を生産す
ることができ、少なくとも１種類のオーキシンを比較的
高い濃度で含む液体栄養培地に移す工程からなる液体懸
濁液中の前胚ワタ細胞塊の製造方法を提供することによ
り達成された。

前胚細胞塊は、成熟した胚、苗木及び完全な植物体に再
生することができる。

第１図ないし第８図は本発明の種々の工程を示す。

第１図は、工程（ａ）に記載された方法により、原料と
して体細胞胚を用いて製造されたカルスの写真である。

写真は６．２倍に拡大されているｅ　１−２　ｃｍの横
棒は２１を表わす。

第２図は、工程（ａ）に記載された方法により、原料と
してし子葉を用いて製造されたカルスの写真である。写
真は２２．７倍に拡大されている＊　１．２　ｃｍの横
棒は０．５１を表わす。

第３図は、工程（ｂ）に記載された方法により製造され
た前胚細胞塊の塊状集合体の写真である。写真は４４．
４倍に拡大されている。　１．１　ｃｍの横棒は０．′
２５層朧を表わす。

第４図は、工程（ｃ）に記載された方法により製造され
た、微細に分散された前胚細胞塊の写真である。写真は
４４．４倍に拡大されている。

１．１０膳の横棒は０　、２５ｍｍを表わす。

第５図ないし第８図は、各々本発明の工程（ｄ）の方法
により製造された球形、ハート形。

魚雷形及び成熟胚の写真である。写真は２．７倍に拡大
されている。各写真において、１．８　ｃ＠の横棒は０
．５量諺を表わす。

驚くべきことに、発芽及び再生の可能なワタ（ゴシビウ
ム種）の胚が、体細胞胚形成を用いて、細胞懸濁培養系
中で前胚細胞塊を発生させ、そしてそこから胚を発生さ
せることにより有効に製造されうることが見出された。

本発明の方法においては、例えば標準的な２５０１のプ
ロング（ＤｅＬｏｎｇ）　７ラスコ中で、約１０　、０
００個の球形胚の生産が可能になり、該球形胚から約１
０００個の成熟細胞及び約５０個の植物体が得られる。

従来技術の方法ではそのように能率のよい生産はできな
い。

本発明により生産されるワタ植物は、栽培種でも野生種
でも良い。栽培されたワタ植物が好ましい。

栽培された綿植物の例には、ゴシビウム　ヒルレスツム
（Ｇｏｓｓ７ｐｉｕｍ　　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）　、ゴシ
ビウム　アルポレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　　ａｒｂ
ｏｒｅｕｍ　）及びゴシビウム　バルバデンス（Ｇｏｓ
ｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）が含まれる。ゴシ
ピウム　ヒルスツムが好ましい０本発明の方法により再
生されるゴシピウム　ヒルスツムの種には、コーカー（
ｃｏｋｅｒ　）３１０　、　コーカー３１２、アカラ　
（Ａｃａｌａ　）　Ｓ　Ｊ２　、アカラＳＪ４　、アカ
ラＳＪ５　、７ンク（Ｆｕｎｋ）　５１９−２及び７７
り５２２−１が含まれる。好ましい種はコーカー３１０
である。

、Ｌ！Ｌ！　　：　ＩＩＩＬノ　　　ワタカルス第１工
程は、ワタ外植組織からワタカルス形成を誘導すること
である。適当なワタ外植組織のいくつかの例は、体細胞
胚、成熟および未成熟接合胚、実生からの子葉または胚
軸、および成熟植物体からの幼若組織を含む０体細胞胚
および実生の子葉または胚軸が好ましい。

接合胚は、例えば胚珠からの摘出により入手しても良い
、胚珠は好ましくは受粉後約７ないし３０日後、好まし
くは約ＩＯないし２１日後、そして最も好ましくは約１
２ないし１８日後摘出される。

子葉および胚軸は、幼若な実生から入手しても良い、実
生は好ましくは約３と２１１日齢間、より好ましくは約
４と９日齢の間、そして最も好ましくは約７日齢のもの
である。胚軸は、長袖方向に薄片に切り、そして例えば
１と２０ｍｍ好ましくは約２ｍｍの都合の良い切片に切
る。

子葉組織は１と　４００ｍｍ’、好ましくは５と１００
ｍｒｒｆ、そして最も好ましくは約１０ｍｒｎ’の切片
に切る。

この操作から誘導される体細胞胚は、木方法による胚形
成性カルスを得るための最も好ましい源である。

体細胞胚は、例えば移植片の源として子葉および胚軸組
織のための上記の方法を用いることにより入手され得る
。第１葉期以前に取ったあらゆる体細胞胚が適当である
６体細胞胚の大きさは決定的ではない、好ましくは体細
胞胚は長さが約５ｍｎｒより短い。

成熟ワタ植物体からの幼若組織は茎端の先端１０ｃｍ、
好ましくは約５ｃｍを摘出することにより慣用的に入手
されても良い、茎および葉柄組織は長袖方向に薄片に切
り、そして胚軸の場合と同じ大きさの切片に切る（上記
参照）。

葉組織は子葉組織の場合と同じ大きさの切片に切る（上
記参照）。

ワタ植物組織を、約２０ないし４０℃、好ましくは２３
ないし３５℃、より好ましくは約３１℃で適当なカルス
誘導培地上に置く０組織からカルスを誘導することがで
きるあらゆる培地を本再生方法において使用しても良い
。

培地は、固体培地がより慣用的であるから好ましいけれ
ども、液体であっても固体であっても良い。

本発明の条件下でカルスを誘導することができる一つの
培地は、無機塩、ビタミン、炭素源、オーキシンおよび
サイトカイニンを含有する。培地は、ＰＨを３．５と７
．５の間、好ましくは約４．５と８．５の間、そして最
も好ましくは約５．７に調整する。

カルス誘導に寄与し得るあらゆる無機塩およびビタミン
が適当である。適当な無機塩およびビタミンのいくつか
の例は、ムラシゲおよびスクラブ（１９８２年）　（Ｍ
Ｓ）およびガムポルク等（１９８８年）　　（Ｂ−５）
により記載されたものを包含する。もう一つの例は、チ
ェング（ｃｈｅｎｇ）等（１９８０年）により記載され
たＭＳまたはゲムポルクのＢ−５培地の改良物である。

好ましい無機塩はＭＳ無機塩である。好ましいビタミン
は、ゲムポルクのＢ−５ビタミンである。

炭素源はカルスを生長させ得るあらゆる炭素源であって
良い、好ましい炭素源は糖および糖の誘導体を包含する
。好ましい糖はグルコースとショ糖である０組織の褐色
化を減らすためにグルコースを含有するカルス誘導培地
中でカルスを創始させ、そして次にショ糖を含有するカ
ルス誘導培地に該カルスを移すことは特に望ましい。

炭素源の濃度は５ないし８０ｇ／ｌ、好ましくは約３０
ｇ／交である。

カルス誘導培地中に存在するオーキシンはカルスを誘導
し得るあらゆるオーキシンであり得る。いくつかの適当
なオーキシンは、α−ナフタレン酢酸、ビクロラム、２
，４．５−１リクー３−ピルビン酸、インドール−３−
酢酸、およびｐ−クロロフェノキシ酢酸を含む、好まし
いオーキシンはα−ナフタレン酢酸である。

カルス形成を誘導することができるオーキシンのあらゆ
る濃度が本発明の方法において使用し得る。適当な濃度
は０．１ないしＩＤｔａｇ／ｉＬである。特にオーキシ
ンがα−ナフタレン＃酸である場合、好ましい濃度は、
約２ｍｇ／ｉである。

カルス誘導培地中に存在するサイトカイニンは、カルス
を誘導することができるあらゆるサイトカイニンであり
得る。いくつかの適当なサイトカイニンは、カイネチン
、６−ベンジルアデニン、２−インペンテニルアデニン
およびゼアチンを含む、好ましいサイトカイニンはカイ
ネチンである。

カルス形成を誘導することができるサイトカイニンのあ
らゆる濃度が本発明の方法において使用し得る。適当な
濃度は０．１ないし１０ｍｇ／４１である。特にサイト
カイニンがカイネチンである場合、好ましい濃度はｌａ
ｇ／ｕである。

培地が固体である場合、それは固化を引き起こす成分、
例えば約０．８　Ｘアガー、例えばアガー　ノープル（
Ａｇａｒ　　Ｎｏｂｌｅ）　　（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ
））または約０．８％７ガロースを含有する（本明細書
において全ての％は重量に基づいている）。

カルス誘導培地上でカルスを形成するのに十分な期間組
織を培養する０例えば、炭素源としてグルコースを含有
するカルス誘導培地上で組織を培養し得る。５週間の誘
導期間が典型的である。副次培養は褐色化を防止するた
めに必要な時折なわれる０週毎の副次培養が好ましい。

形成するカルスは組織化されていなくても、また前胚細
胞塊、胚形成性カルスおよび／または胚を含有しても良
い０通常、胚軸または子葉を外植源として用いる場合、
カルスは組織化されていないように見える０体細胞胚を
外植源として用いる場合、少なくとも一部のカルスは、
淡黄色および結節により特色づけられる胚形成性カルス
からなるように見える。

生成するカルスを次いで５ケ月までの期間の間に、炭素
源としてショ糖を含有すること以外はカルス誘導培地と
同様であるカルス副次培養地に移すことは有利であり得
る。ショ糖含有カルス誘導培地上、１ケ月後の新鮮培地
中での１ケ月または２ケ月の副次培養が好ましい。

カルスは暗所で誘導され得るが、しかし好ましくは明所
で誘導される。光線は例えば０．５ないし　１５０ＩＬ
Ｅｍ　　ｓ　　（＝４１．７５ないし１２５２５　ルタ
ス）の強度を有する。

二丘］：〒　　　１　土　イ 前胚のまたは増殖胚の細胞塊の生長を促進する液体培地
中に、工程（ａ）からのカルスを懸濁する。細胞密度が
低いことは重要である。それ故に、培地１ｍＪｌ当たり
４０ｍｇ以下、好ましくは１５ｍｇ以下、そしてより好
ましくは５ｍｇ以下のカルスが懸濁される。

工程（ｂ）における有用な培地は、前胚細胞塊を誘導す
ることができるあらゆる培地であり得る。培地は無機塩
、ビタミン、炭素源およびオーキシンからなる。培地は
また有機窒素源、サイトカイニン、アミノ酸およびその
他の追加物例えばカゼイン氷解物またはココナツツ水を
含有しても良い。

無４ｊ９．塩およびビタミンは、工程（ａ）（上記）と
同じであって良い、　ＭＳ無機塩およびＢ−５ビタミン
が好ましい。

炭素源は、工程（ａ）（上記）と同じであって良い。炭
素源の濃度は０．１ないし１００ｇ／文である。特に炭
素源がショ糖である場合には約２０ｇ／文が好ましい。

オーキシンは、工程（ａ）において使用されたオーキシ
ンから選択され得る。好ましいオーキシンは、２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸およびビクロラムである。ビク
ロラムが最も好ましい。

工程（ｂ）においてオーキシンの濃度は比較的低い。正
確な濃度は使用される特定のオーキシンに依存する。比
較的低いオーキシン濃度は、懸濁培養培地において通常
使用されるものに一般に類似しており、そして工程（ｃ
）において使用される相当するオーキシン濃度はより十
分に低い。ビクロラムが工程（ｂ）において使用される
オーキシンである場合、濃度は０．０１ないし５ｍｇ／
交、好ましくは０．１ないし１ｍｇ／文。

そして最も好ましくは約０．５ｍ　ｇ　７文である。

２．４−ジクロロフェノキシ酢酸が工程（ｂ）において
使用されるオーキシンである場合、濃度は０．Ｏｌない
し０．５ｍｇ／文、好ましくは０．０５ないし０．２５
ｍ　ｇ　／　ｌ、そして最も好ましくは約０．１ｍ　ｇ
　７文である。

前胚細胞塊の誘導は、空気を通した培地中、２０ないし
３５℃、好ましくは２２ないし３３℃１そして最も好ま
しくは２５ないし３１”Ｃの温度で好ましくは行なわれ
る。当該技術分野において公知の方法、例えば振ｉによ
り培地に空気を通しても良イ、工程（ｂ）は暗所または
約７５　ｇ　ＴＬ　ｔｓ−２ｓ−’（＝　６２Ｇ２．５
ルクス）まで、好ましくは５と１０ｇ　Ｅ　ｖａ−２ｓ
−’　（＝　４１７．５と８３５ルクス）の間の明所で
行なわれ得る。

前胚細胞塊の塊状集合体が形成され、そして迅速に増殖
し始めるまで好ましくは副次培養することなしに、カル
スを培地中に維持する。

迅速な増殖の開始は通常３ないし８週の間、より典型的
には５ないし７週の間に起こる。誘導期間の間、この期
間は培地を乱さないことが好ましいけれども、培地を新
鮮培地に置き換えても良い。

カルスから前胚細胞塊の塊状集合体への変化は、植物組
織培養の分野における通常の熟練者にとっては容易にわ
かるであろう、それは淡黄色および前胚細胞塊の塊状集
合体により特色づけられている。

１ｒｉ胚細胞魂の塊状集合体が一旦迅速に増殖し始める
と、それらは工程（ｃ）に記載の培地に直接導かれ得る
か、またはそれらは褐色化を防止するために副次培養さ
れても良い。３ないし７日毎、好ましくは５ないし７日
毎の副次培養が慣用的である。細胞塊は副次培養なしで
約１４日間生存する。

皿互工０　：細かくノ　させた「　細　ｌ工程（ｂ）か
らの前胚細胞塊の塊状集合体は。

該集合体を細かく分散させ得る液体培地に移される。そ
の培地は、工程（ｃ）の培地が比較的高濃度のオーキシ
ンからなること以外、工程（ｂ）に記載のものと同じで
あって良い、オーキシンは工程（ａ）において使用され
たあらゆるオーキシンであり得る。好ましいオーキシン
は２゜４．５−トリクロロフェノキシ酢酸および２゜４
−ジクロロフェノキシ酢酸である。

オーキシンの濃度は使用される特定のオーキシンに依存
している。工程（ｃ）の培地中のオーキシン濃度は、懸
濁培養培地に通常用いられる濃度よりも一般に高いか、
または少なくともその範囲の最高値であり、そしてあら
ゆる場合において、工程（ｂ）において用いられる相当
するオーキシン濃度より十分高い。

例えば、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸が工程（ｃ）
の培地中のオーキシンである場合、濃度は約０．５ない
しｔｏｏｍｇ／Ｍ、好ましくは１ないしｌｏｍｇ／ＪＬ
、そして最も好ましくは約２．５ないし７．５ｍｇ／文
であり得る。

オーキシンの濃度および可使性のある同一性を除いて、
工程（ｃ）における培地、温度および光量は工程（ｂ）
に記載のものと同一であって良い。

前胚細胞塊の塊状集合体がより小さくなり、より細かく
分散された前胚細胞塊になるまで工程（ｃ）の条件を維
持する。より小さい、より細かく分散された前胚細胞塊
の出現は、当該技術分野の熟練者には容易にわかるであ
ろう、これらの細胞塊は、それらの黄色、平滑表面、中
間の濃度および小さい大きさを特徴とする。より小さい
、より細かく分散された細胞塊への変化は、６週間、典
型的には２週間以内に通常起こる。

小さい細かく分散された前胚細胞塊の培養物は無期限に
維持されても、そして活性な増殖を維持するように副次
培養しても良い０例えば３ないし２８日毎、好ましくは
５ないし１０日毎に副次培養することは慣用的である。

１皿」二藍ハ上 より小さい、より細かく分散された前胚細胞塊を、成熟
層の生長を誘導する培地に添加する。培地は好ましくは
液体である。

胚は成熟し、そして発芽することができる前に、多くの
生長段階を通過する。これらの段階は、球形の、ハート
形の、魚雷形の、そして成熟した段階を包含する。段階
の名称は、胚のおおよその形に基づいている。

工程（ｄ）において有用な培地は、成熟層の生長を誘導
するあらゆる培地であり得る。一つの有用な培地は、無
機塩、ビタミン、炭素源および還元窒素を含有する有機
化合物からなる。

塩およびビタミン並びにそれらの濃度は、工程（ａ）に
記載のものと同じであって良い。炭素源はまた工程（ａ
）に記載の一つであって良い。

炭素源の濃度は約１ないし１０ｇ／４１、好ましくは約
２ないし６　ｇ　／　ｌである。好ましい炭素源はショ
糖である。

還元された窒素原子を有する有機化合物は、工程（ｄ）
の培地に添加した場合、成熟層の生長を誘導するような
あらゆる化合物であり得る。

好ましい化合物はアミノ酸である。

好ましいアミノ酸はグルタミンである。

有機窒素源の濃度は、使用される特定の化合物に依存し
ている。有機窒素源としてのグルタミンの効果的濃度は
２ないし２８０ｍ　Ｍ、好ましくは５ないし　ｌｏｏｍ
Ｍ、そして最も好ましくは５０ｍＭである。

工程（ｄ）の培地はオーキシンを含有し得る。

オーキシンは胚生長の初期の段階の間望ましいが、しか
し後期の段階の間は望ましくない、それ故に、オーキシ
ンが存在するならば、それらは生長ノハート形段階まで
にだけ存在することが望ましい、従って、胚はオーキシ
ンを含有しない培地に移される。

オーキシンが存在するならば、その濃度は０．０１ない
しＱ、１ｍｇ／文であッテ良い。

オーキシンは工程（ａ）において有用なオーキシンの一
つであって良い、好ましいオーキシンはピクロラムおよ
び２．４−ジクロロフェノキシ酢酸である。

工程（ｄ）の培地中、暗所または明所で２０ないし３５
℃の温度で胚を培養しても良い、光線の強度は、例えば
５ないし７５ルＥ　１１−”ｓ−”（＝８２８２．５ル
クス）であって良い。

胚が魚雷形または成熟段階に成熟するまで、該胚を工程
（ｄ）の培地中に維持する。植物組織培養の分野におけ
る熟練者は、胚が形成するような球形の、ハート形の、
魚雷形のそして成熟した胚を識別することができるであ
ろう、胚は典型的には２ないし５週で、通常３ないし４
週で成熟する。ハート形段階にオーキシン含有培地から
非含有培地に移すことを除いて、胚を副次培養すること
、または胚を新鮮な培地に移すことは通常不要である。

二且」：良１ 発芽を誘導し得る固体培地上に成熟胚を置く、培地は無
機塩、ビタミンおよび炭素源からなる。培地を適当な固
化剤例えばゲルライト（Ｇｅ１ｒｉｔｅ）　　Ｃケル−
１（ｋｅｌｋｏ　）、カリ７ｆルニア、サンジエゴ〕、
アガロースまたはアガーで固化させる。

硝酸塩で高濃度で存在し、アンモニウムが存在しないか
、または非常に低濃度で存在するかのいずれかであると
いう変更をした工程（ａ）に記載の無機塩を使用し得る
。硝酸塩の濃度は２０ないし１３０ｍＭ、好ましくは３
０ないし８０ｍＭ、より好ましくは３５ないし４５ｍＭ
であって良い。

アンモニウムイオンの濃度が５ｍＭ以下であるべきであ
る。

炭素源は好ましくは糖である。好ましい糖はショ糖であ
る。炭素源の濃度は使用される特定の炭素源に依存する
０例えば、ショ糖が炭素源である場合、濃度は０．１な
いし６重量％、好ましくは０．５ないし４重量％、より
好ましくは工ないし３重量％である。

無機窒素源は所望により工程（ｅ）の培地中に存在する
。有機化合物は、好ましくは発芽を支持し得るアミノ酸
またはアミノ酸の混合物である。好ましいアミノ酸また
はその混合物はグルタミンまたはカゼイン氷解物である
。

無機窒素源の濃度は、使用される特定の化合物に依存す
る０例えば、化合物がグルタミンである場合、濃度は２
ないし５０ｍＭ、好ましくは５ないし３０ｍＭ、より好
ましくはｉｏないし２０ｍＭであり得る。化合物がカゼ
イン氷解物または変性カゼイン氷解物である場合、濃度
は１００ないし３０００ｍ　ｇ　／　ｌ　、好ましくは
１０００ないし２８００ｍｇ／ｉ、より好ましくは１５
００ないし２５００ｍ　ｇＺ見である。

好ましくは、発芽は有機窒素源を含有する培地上で若葉
が生長するまで起こる。根の伸長のための有機窒素源を
含有しない培地に、次いで胚を移す。

培地中の胚の密度は、生長に自己阻害を引き起こすもの
より低い密度に限られる。適当な密度は、約１０ないし
７５＋：ｎ！；Ｌ、好ましくは２５ないし５０ｍ１、そ
して最も好ましくは約３５ｍＭの培地を含有する９ｃｍ
のペトリ皿中に１ないし１００個の胚を含む。

工程（ｅ）の培地は、２０ないし３０℃に維持される。

好ましくは、温度は約２５℃である。

ある光線は工程（ｅ）において必要である。５ないし１
５０７ｔ　Ｅ　ｒａ−”５−１（＝　４１７．５と　１
２５２５ルクス）の間、好ましくは１０ないし７５ｐ　
Ｅ　ｍ−”５−１Ｃ＝　８３５と　６２ｆ１２．５ルク
ス）の間の光線の強度が適当である。

胚が発芽するまで、典型的には工ないし２０日、通常２
ないし４日、工程（ｅ）の培地上に胚を維持する。当業
者は胚が発芽した時を知るであろう。

工」！」：髭糎淋 発芽に続いて、小植物体を植物体への生長のための土壌
に移す。移された植物体をガラスで覆い、高湿度に維持
する。ガラス下で１週間後、小植物体または植物体の特
別な処置は必要ない。

有」月１＝」１舅 成熟胚は大量繁殖およびクローニングのために使用し得
る。これは、胚を発芽させ、そして小植物体を土壌に、
その他の生長基質またはその他の植物生長環境のいづれ
かに移植することを必要とする。成熟胚はまた人工種子
皮膜に包まれ、そして「体細胞種子」として植えられて
も良い、雑種の親または雑種自体を大量製造する必要が
ある場合に、大量繁殖およびクローニングは有益である
。

新規な特徴が遺伝的変更の結果として存在するかどうか
を決定するために、上記の段階の間のあらゆる時に、細
胞、前胚、胚、小植物体および植物体を分析し得る。特
徴は試験管内または植物の特徴において有用であって良
い、有用な特徴のいくつかの例は、植物毒素耐性、乾繰
耐性、冷寒耐性、疾病耐性、その他を包含する。

工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の細胞はまた、望まし
い特性１例えば除草剤耐性を有する細胞または植物体を
産生ずることができる組織培養法を行っても良い、その
ような方法のいくつかの例は、例えばシャレッフおよび
レイ（ｃ：ｈａｌｅｆｆａｎｄ　　Ｒａｙ）　　（１９
８４年）を包含する。

支崖１ 第工表−培養液 全ての培養液はムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）及びス
クーグ（Ｓｋａｏｇ　）の無機塩及びガンポーグ（Ｇａ
ｍｂｏｒｇ　’ｓ）のＢ−５ビタミンを含み、　　ｐＨ
５，７に調整され、下記の組成（ｍｇ／ｆＬ）を有する
： 多量養素 １’ｖ１ｇＳ０４−７１１，０　　　　　３７０ＫＨ２
１’（Ｊ、、　　　　　　　　１７０倣量養素 ＋１３１３０，６．２ Ｍｎ５Ｏ，、−１１２０］　５．６ １ＩＴＳＯ４・７ｉｔ、ｏ　　　　　　８．６ＮａＭｏ
Ｏ４−２１１２００，２５ Ｃｕ　Ｓｏ　４　ｍ　５１１２０　　　　　　　　　　
　　　　　０．０２５ＣａＣ１２−６１１２００，０２
５ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｏ，８：３１’ｃｓ０４．７ｎ　、ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２７
．８Ｎａ２Ｅｌ）ＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３７．３ビ゛タミン チアミン　　　　　　　　　　１０ ピリドキシン　　　　　　　　　１ ニコチン酸　　　　　　　　　１ ミオ−イノシトール　　　　１００ さらに、下記の組成を有する種々の培養液が調整される
。

諧喪属考　　　添加成分 １　２０ｇ／Ｌ；Ｌ（７）スクＯ−ス、０．６＄（７）
７ガーノーブル（Ｎｏｂｌｅ　）　（デイフコ（Ｄｉｒ
ｃｏ　）　）２　３０ｇ／文のグルコース、２ｍｇ／文
のα−ナフタレン酢酸、１ｍｇ／Ｊｌのカイネチン（Ｋ
ｉｎｅｔｉｎ）　、　０．８％のアガーノープル３　３
０ｇ／文のスクロース＋　２　ｍ　ｇ　／交のα−ナフ
タレン酢酸、１ｍｇ／ｉのカイネチン、　０．８％のア
ガーノープル ４　２０ｇ／ｆＬのスクロース及び０．５ｍｇ／Ｊｌの
ピクロラム ５　２０ｇ／ｌのスクロース及び５　ｍ　ｇ　／　ｆＬ
の２．４−ジクロロフェノキシ酢酸 ６　２０ｇ／ｌのスクロース及び１５ｍＭのグルタミン 培養液の温度は２５℃、２８℃及び３１℃であり、温度
以外の条件として、照光時間は１６時間、照光して８時
間暗くし、光度は２０終Ｅｍ　　ｓ（＝　１６７０ルク
ス）である。

種）の種子を、１Ｍ硫酸内に２分間置くことにより、綿
花を除去する（ｄｅｌｉｎｔ）　、その後、種子を消毒
薬及び蒸留水で４回洗浄し、９５％のエタノールに浸漬
し、火焔殺菌しくｆｌａｍｅ　）　、　その後培養液＃
１に３１”Ｃで植え付ける。

支ム上」：Ｌ工区Ａ」 植え付けの７日後、芽の胚軸を採取し縦に薄く切り、２
ｍｍに区切って切断し、３１”Ｏの培養液＃２に置く０
区分した胚軸（２ｍｍ）は週毎に新しい培養液＃２に移
し、この培養液も３１℃に保つ。培養液＃２への４回の
週毎の移植後、胚軸上に増殖したカルス組織をもとの外
植片から除去して、３１”Ｏの培養液＃３に置く。１ケ
月後にカルスを新しい培養液＃３に移し、さらに１ない
し２ケ月間保持する。

支ムＭＥ　：　１１至五皿訓Ｉ 懸濁培養の開始のために、カルス組織１００ｇを１２５
ｍ１のプロングフラスコ中の３５ｍＪＬの培養液＃４に
入れる。懸濁液を、２８℃、１４０　ｒｐｍ（１分間の
回転数）で６週間回転すると、急速に増殖し始める。

シＩ巳：ｊの　−び　の′ 培養液＃４中で生成する胚は、培養液＃４を培養液＃５
に換えると、さらに急速に増殖する。この胚形成懸濁液
は分割され、それぞれ新しい培養液＃５中で３ないし７
日回車代培養する。培養液＃５中で増殖する胚を発達さ
せるために、胚を培養液＃６で洗浄した後、培養液＃６
中に入れる。培養液＃６中にＸ移してから３ないし４週
間目に成熟した胚を２５℃の固体培地」二に置く。固体
培地は、ＫＮＯ３及びＮＨ４Ｎ０．の代わりに４０ｍ　
ＭのＫＮＯｌで変性されたＭＳｔｌｌを含む変性ＭＳ培
地、Ｂ−５ビタミン、２％のスクロース、１５ｍＭのグ
ルタミンからなり、０．２ｚのゲルトライト（Ｇｅｌｔ
ｒｉｔｅ）で固化されている。

胚を２５℃のベトリ皿に置く。この培地上では吸枝の発
育はまばらであり、胚を上記の変性されたＭＳ培地でグ
ルタミンを含まないものに移すと、根の伸長が強化され
る。その後、発芽した胚を体中のバーミキュライトに植
え、ビーカーで覆う（２５℃）、バーミキュライト中で
苗木が育ったら、ビーカーを除去する。２８℃で１週間
経過した後、苗木を温室中に置き、さらに植物体を発生
させる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の方法の工程（ａ）で形成さ
れた生物（カルス）の形態を示す写真、第３図は本発明
の方法の工程（ｂ）で形成された生物（前胚細胞塊の塊
状集合体）の形態を示す写真、第４図は本発明の一工程
において形成された生物（分散された前胚細胞塊）の形
態を示す写真、第５図ないし第８図は本発明の方法の工
程（ｄ）で形成された生物（それぞれ球形胚、ハート形
胚、魚雷形胚及び成熟胚）の形態を示す写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）ワタ植物の組織を、約２０℃ないし４０℃
   で、褐色化を防止するために充分な副次培養液と共に、
   適当なカルス誘導培地上に置くことにより、ワタのカル
   スの形成を誘導する工程；（ｂ）該カルスを、少なくと
   も１種類のオーキシンを比較的低い濃度で含む適当な前
   胚細胞塊誘導液体培地に、前胚細胞塊の塊状集合体が形
   成され、そして迅速に増殖し始めるまで、４０ｍｇ／ｍ
   ｌ以下の濃度で懸濁する工程：並びに （ｃ）迅速に増殖している前胚細胞塊の塊状集合体を、
   より小さく、より均一に分散された前胚細胞塊を生産す
   ることができ、少なくとも１種類のオーキシンを比較的
   高い濃度で含む液体栄養培地に移す工程からなる液体懸
   濁液中の前胚ワタ細胞塊の製造方法。 （２）（ａ）ワタ植物の組織を、約２０℃ないし４０℃
   で、褐色化を防止するために充分な副次培養液と共に、
   適当なカルス誘導培地上に置くことにより、ワタのカル
   スの形成を誘導する工程；（ｂ）該カルスを、少なくと
   も１種類のオーキシンを比較的低い濃度で含む適当な前
   胚細胞塊誘導液体培地に、前胚細胞塊の塊状集合体が形
   成され、そして迅速に増殖し始めるまで、４０ｍｇ／ｍ
   ｌ以下の濃度で懸濁する工程； （ｃ）迅速に増殖している前胚細胞塊の塊状集合体を、
   より小さく、より均一に分散された前胚細胞塊を生産す
   ることができ、少なくとも１種類のオーキシンを比較的
   高い濃度で含む液体栄養培地に移す工程；並びに （ｄ）前胚細胞塊を適当な魚雷形または子葉形胚誘導液
   体栄養培地に置くことにより、工程（ｂ）または工程（
   ｃ）の前胚細胞塊から魚雷形または子葉形胚を発生させ
   る工程からなる、液体懸濁液中の成熟胚の製造方法。 （３）（ａ）ワタ植物の組織を、約２０℃ないし４０℃
   で、褐色化を防止するために充分な副次培養液と共に、
   適当なカルス誘導培地上に置くことにより、ワタのカル
   スの形成を誘導する工程；（ｂ）該カルスを、少なくと
   も１種類のオーキシンを比較的低い濃度で含む適当な前
   胚細胞塊誘導液体培地に、前胚細胞塊の塊状集合体が形
   成され、そして迅速に増殖し始めるまで、４０ｍｇ／ｍ
   ｌ以下の濃度で懸濁する工程； （ｃ）迅速に増殖している前胚細胞塊の塊状集合体を、
   より小さく、より均一に分散された前胚細胞塊を生産す
   ることができ、少なくとも１種類のオーキシンを比較的
   高い濃度で含む液体栄養培地に移す工程； （ｄ）前胚細胞塊を適当な魚雷形または子葉形胚誘導液
   体栄養培地に置くことにより、工程（ｂ）または工程（
   ｃ）の前胚細胞塊から魚雷形または子葉形胚を発生させ
   る工程；並びに （ｅ）適当な胚発芽栄養培体上で胚を発生させる工程か
   らなるワタの苗木の製造方法。 （４）（ａ）ワタ植物の組織を、約２０℃ないし４０℃
   で、褐色化を防止するために充分な副次培養液と共に、
   適当なカルス誘導培地上に置くことにより、ワタのカル
   スの形成を誘導する工程；（ｂ）該カルスを、少なくと
   も１種類のオーキシンを比較的低い濃度で含む適当な前
   胚細胞塊誘導液体培地に、前胚細胞塊の塊状集合体が形
   成され、そして迅速に増殖し始めるまで、４０ｍｇ／ｍ
   ｌ以下の濃度で懸濁する工程； （ｃ）迅速に増殖している前胚細胞塊の塊状集合体を、
   より小さく、より均一に分散された前胚細胞塊を生産す
   ることができ、少なくとも１種類のオーキシンを比較的
   高い濃度で含む液体栄養培地に移す工程； （ｄ）前胚細胞塊を適当な魚雷形または子葉形胚誘導液
   体栄養培地に置くことにより、工程（ｂ）または工程（
   ｃ）の前胚細胞塊から魚雷形または子葉形胚を発生させ
   る工程； （ｅ）適当な胚発芽栄養培体上で胚を発芽させる工程；
   並びに （ｆ）発芽した胚から植物を生長させる工程からなるワ
   タの植物体の製造方法。 （５）ワタがゴシピウムヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕ
   ｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）である請求項１、２、３もしくは
   ４記載の方法。 （８）工程（ａ）におけるワタ植物の組織が子葉組織ま
   たは胚軸組織である請求項１、２、３または４記載の方
   法。 （７）工程（ｂ）におけるオーキシンが０．１ないし５
   ｇ／ｌの濃度で存在するピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ
   ）である請求項１、２、３または４記載の方法。 （８）工程（ｂ）におけるオーキシンが０．０１ないし
   ０．５ｍｇ／ｌの濃度の２，４−ジクロロフェノキシ酢
   酸である請求項１、２、３または４記載の方法。 （９）工程（ｂ）が３ないし８週間行なわれる請求項１
   、２、３または４記載の方法。 （１０）１５ｍｇ／ｍｌ以下のカルスを工程（ｂ）の培
   地に懸濁する請求項１、２、３または４記載の方法。 （１１）工程（ｃ）のオーキシンが０．５ないし１００
   ｍｇ／ｌの濃度の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であ
   る請求項１、２、３または４記載の方法。 （１２）工程（ｄ）の培地が無機塩、ビタミン、炭素源
   及び還元された窒素原子を含む有機化合物からなる請求
   項１、２、３または４記載の方法。 （１３）還元された窒素原子を含む化合物が、２ないし
   ２５０ｍＭの濃度のグルタンミンである請求項１２記載
   の方法。 （１４）ワタの植物体に生長しうる魚雷形または子葉形
   胚の液体懸濁液。