HU203933B

HU203933B - Method for regenerating cotton from cell culture

Info

Publication number: HU203933B
Application number: HU885946A
Authority: HU
Inventors: John Finer
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-11-17
Publication date: 1991-11-28
Also published as: EP0317512A3; DE3873489D1; ZA888599B; AU2568088A; AU617135B2; EP0317512A2; IL88391A0; JPH01165316A; BR8806020A; ATE78972T1; ES2043884T3; KR890008314A; HUT52811A; EP0317512B1; CA1309367C; GR3006133T3

Description

A jelen találmány gyapot növények reagálására szolgáló eljárásra irányul tenyésztett sejtekből szomatikus embriogenezis segítségével. Az eljárás hatékonyabb, mint a szakterületen eddig leírt eljárások.

A szomatikus embriogenezist meg kell különböztetnünk egy másik regenerálási eljárástól, amely organogenezisként ismeretes. Mindkét eljárásban az olyan fonásokból, mint pl. gyökerek, levelek vagy szárak, kapott explantátumokat tenyésztjük. Új, differenciált szövetek képződnek vagy közvetlenül az explantátumból, vagy az explantátnmból kifejlődő nem differenciált kallusz szövetből. Az oiganogenezisben az új differenciált szövetek gyökerek és/vagy hajtások. A szomatikus embriogenezisben viszont az új differenciált szövetek bipoláris szerkezetek, amelyek összekapcsolt gyökér- és hajtás merisztémás gócokat, vagyis embriókat tartalmaznak. Különböző stádiumok ismerhetők fel az embrió fejlődése során. Ezek a stádiumok magukban foglalják az alábbi, a szakterületen ismert globuláris, szív, torpedó és érett stádiumokat

Megfelelő körülmények között az embriók csíráznak és csíranövényekké fejlődnek, amelyek viszont teljes növényekké fejlődnek. A szomatikus embriókat nagy mennyiségben lehet termelni és ezért alkalmasak tömeges szaporításra és klónozásra.

Bizonyos esetekben úgy találjuk, hogy a szomatikus embriogenezissel termelt teljes növények sejtjei genetikailag különböznek azoktól a sejtektől, amelyeket az embriogén kallusz előállításához alkalmaztunk. Az ilyen úton módosított növényi sejtekről azt mondják, hogy a szomaklonális változásként ismert genetikai változáson mentek keresztül. Bizonyos esetekben az új genotípus kedvező változásokat alakít ki. A módosított genotípus bevezetése növényi sejttenyészet segítségével a szomatikus embriogenezis egy másik alkalmazását jelenti.

A szomatikus embriogenezist lehet alkalmazni tenyésztett sejtekből olyan növények regenerálására, amelyek egy adott vonásra vannak szelektálva. így pl. a tenyészeteket ki lehet tenni valamely fitotoxin hatásának, amelyre toleranciát kívánunk elérni. A szomatikus embriogenezist lehet azután alkalmazni az olyan növények regenerálására a sejtekből, amelyek a leginkább képesek tolerálni a fitotoxint. Az ilyen módon végzett, tenyésztett sejteket és szöveteket alkalmazó in vitro szelekciót Chaleff és munkatársai írják le [Science, 223,1148-1151 (1984)].

Olvashatók a szakterületen beszámolók gyapot növények regenerálásáról szövetekből szomatikus embriogenezis segítségével. így pl. Rangan és munkatársai [In Vitro, 20, 256 (1984)]. beszámolnak a gyapot (G. birsutum) sikeres regenerálásáról szomatikus embriogenezissel [35^Λ Annual Meeting of the Tissue Culture Association, Houston (1984)]. Davidonis és munkatársai [Plánt Science Letters, 32, 89 (1983)] néhány növényt állítottak elő G. hirsutum szomatikus pro-embrioidjaiból, amelyet kétéves kallusz szövetekből kaptak. Finer és munkatársai [TCA Report, 17, 8 (1983)] növényt regeneráltak G. klotzschianum szomatikus embrióiból. Smith és munkatársai [In Vitro, 13, 329 (1977)] egy csíranövényt regeneráltak G. arboreumból származó sziklevél kalluszából.

A technika állásában ismertetett módszerekben az embriókat sziláid tápközegeken alakítják ki, és ezek hiányosak annyiban, hogy nem alkotnak növényeket olyan nagy számban, amely a nagyüzemi alkalmazáshoz szükséges lenne. Az a képesség, hogy növényeket regenerálunk tenyésztett sejtekből, csak akkor bír gyakorlati jelentőséggel, ha a növény-kezdemény (propagúla) képződése, valamint a növények regenerálása a propagulából elég hatékony. Ennek megfelelően hatékonyabb módszerekre van szükség a gyapot növények regenerálására szomatikus embriogenezissel.

A jelen találmány tárgyai közé tartoznak azok a technika állásából ismert eljárásoknál hatékonyabb eljárások, amelyek tenyésztett gyapotsejtekből szomatikus embriókat állítanak elő, és az ilyen embriókból növényeket regenerálnak. A jelen találmány további tárgyai eljárások szomatikus embriogenezisbez, sejtszuszpenziós tenyésztő rendszert alkalmazva.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A jelen találmány fent ismertetett és további tárgyait úgy hajtjuk végre, hogy eljárást nyújtunk pro-embrionális gyapotsejttömeg előállítására folyékony szuszpenzióban; az eljárás az alábbi lépésekből áll:

(a) gyapot kallusz képződés redukálása gyapot növény szövet ráhelyezésével megfelelő kallusz indukciós tápközegre 20-40 °C hőmérséklet között, megfelelő altenyészettel, hogy megakadályozzuk a bámulást;

(b) a kallusz felszuszpendálása 40 mg/l-re megfelelő folyékony pro-embrionális sejttömeg indukáló tápközegben, amely viszonylag kis koncentrációban legalább egy auxint tartalmaz, egészen addig, amíg a pro-embrionális sejttömegek csomós aggregátumai keletkeznek és elkezdenek gyorsan burjánzani; és (c) a pro-embrionális sejttömegek gyorsan burjánzó, csomós aggregátumainak átvitele olyan folyékony tápközegbe, amely képes kisebb, finomabban diszpeigált pro-embrionális sejtmasszákat termelni, ahol az említett tápközeg viszonylag nagy koncentrációban legalább egy auxint tartalmaz.

A pro-embrionális sejttömegek képesek regenerálódni érett embriókká, sarjnövényekké, és teljes növényekké.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. Az 1-8. ábrák a jelen találmány különböző stádiumait mutatják be.

Az 1. ábra az alábbi (a) lépésben leírt módszerrel előállított kallusz fényképe, forrásként szomatikus embriókat alkalmazva. A fénykép 6,2szeres nagyítású. Az 1,2 cm-es vonalszakasz 2 mm-t képvisel.

A 2. ábra az alábbi (a) lépésben leírt módszerrel előállított kallusz fényképe, forrásként szikleveleket alkalmazva. A fénykép 22,7-szeres nagyítású. Az 1,2 cm-es vonalszakasz 0,5 mmt képvisel.

A 3. ábra a (b) lépésben leírt eljárással előállított proembrionális sejttömegek csomós aggregátu-21

HU 203 933 Β mainak fényképe. A fénykép 44,4-szeres nagyítású. Az 1,1 cm-es vonalszakasz 0,25 mm-t képvisel.

A 4. ábra a (c) lépésben leírt eljárással termeik finoman diszpergált pro-embrionális sejttömeg fényképe. A fénykép 44,4-szeres nagyítású. Az 1,1 cm-es vonalszakasz 0,25 mm-t képvisel.

Az 5-8.

ábrák globuláiis, illetve szív-alakú, illetve torpedó-alakú, illetve érett embriók fényképe, amelyet a jelen találmány szerinti (d) lépésben állítottunk elő. A fénykép 2,7-szeres nagyítású. Az 1,8 cm-es vonalszakasz 0,5 mmt képvisel.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt Meglepő módon arra jöttünk rá, hogy olyan gyapot (Gossypium spp.) embriókat tudunk hatékonyan előállítani szomatikus embriogenezis segítségével, amelyek képesek a csírázásra és regenerálódásra; úgy járunk el, hogy pro-embrionális sejttömeget, és ezekből embriókat fejlesztünk ki sejtszuszpenziós tenyésztő rendszerben.

A jelen eljárás lehetővé teszi mintegy 10 000 globuláris embrió termelését pl. standard, 250 ml-es DeLong lombikban; ezekből a globuláris embriókból mintegy 1000 érett embriót és mintegy 50 növényt kaphatunk. A technika állásában eddig ismert eljárások nem tettek lehetővé ilyen hatékonyságot

A jelen találmány szerint előállított gyapot növények lehetnek tenyésztett vagy vad típusúak. A tenyésztett típusúak az előnyösek.

A tenyésztett gyapotra példák lehetnek a Gossypíum hirsutum, Gossypium arboreum és Gossypium barbadense. A Gossypium hirsutum az előnyös. A G. hirsutum változatai közül, amelyek képesek regenerálódni a jelen találmány eljárása szerint, találhatók a Coker 310, Coker 312, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Fűnk 519-2 és Fűnk 522-1. Az előnyös változat a Coker 310.

(a) lépés. Embriogén gyapot kallusz

A jelen találmány eljárásának első lépése gyapot kalluszképződés indukálása gyapot explantátum szövetből. A megfelelő gyapot explantátum szövetekre példák lehetnek a szomatikus embriók, érett és éretlen zigótás embriók, csíranövényekből származó sziklevelek vagy hipokotilok és érett csiranövényekből származó fiatal szövetek. Az előnyösek a szomatikus embriók és a csfranövény sziklevelek vagy hipokotilok.

A zigótás embriókat pl. magkezdeményből vagy kimetszéssel kaphatjuk meg. A magkezdeményeket előnyösen 7-30 nappal vágjuk el a beporzás után, előnyösen 4-9 napos korban, és legelőnyösebben 7 napos korban. A hipokotilokat hosszirányban hasítjuk fel és megfelelő részekre vágjuk, pl. 1-20 mm közti méretre, előnyösen 2 mm méretre. A sziklevél szövetet 1-400 mm² közti darabokra, előnyösen 5-100 mm²közti darabokra, legelőnyösebben mintegy 10 mm²-es darabokra vágjuk.

Az ebből a munkamenetből származó embriók a legelőnyösebb források ahhoz, hogy a jelen eljárás szerinti embriogén kalluszhoz jussunk.

Szomatikus embriókat kaphatunk pl. az azokat a fentebb leírt módszereket alkalmazva, amelyek hipokotilhoz és sziklevél-szövethez, mint explantátum forráshoz használhatók. Bármilyen szomatikus embrió, amelyet a primer levél kiterjesztés előtt kivettek, alkalmas. A szomatikus embrió mérete nem kritikus. A szomatikus embrió előnyösen azonban kisebb, mint 5 mm hosszúságú.

Egy érett növényből származó fiatal szövetet kényelmesen megkaphatunk olyan módon, hogy kimetsszük a hajtás csúcsának 10 cm-ét, előnyösen mintegy 5 cm-ét A nyél- és szárszővetet hosszában felmetsszük és azonos mérető darabokra vágjuk, mint a hipokotiloknál tettük (lásd korábban). A levélszövetet azonos méretű darabokra vágjuk, mint a sziklevél szövetet 0ásd korábban).

A gyapot növényi szövetet megfelelő kalluszt indukáló tápközegre helyezzük 20-40 °C közti, előnyösen 23 °C és 35 °C közti, legelőnyösebben 31 °C hőmérsékletre. Bármely olyan tápközeget, amely képes kalluszt indukálni a szövetből, alkalmazhatunk a jelen találmány szerinti eljárásban. A tápközeg lehet folyékony vagy szilárd, bár a szilárd tápközeg előnyösebb azért, mert kényelmesebb.

Az egyik tápközeg, amely képes kalluszt indukálni a találmány szerinti körülmények között, szervetlen sókat, vitaminokat, valamilyen szénforrást, valamilyen auxint és valamilyen citokinint tartalmaz. A tápközeg pH-ját 3,5 és 7,5, előnyösen 4,5 és 6,5 közé és legelőnyösebben 5,7-re állítjuk be.

Bármilyen szervetlen só és vitamin, amely képes elősegíteni a kallusz-indukciót, alkalmas. Megfelelő szervetlen sókra és vitaminokra példák lehetnek azok, amelyeket Murashige és Skoog [Physiol. Plánt 15, 473-497 (1962)] (MS), illetve Gamborg és munkatársai [Exp. Cell. Rés. 50,151-158 (1968)] (B-5) írtak le. Egy másik példa az MS vagy Gamborg-féle B-5 tápközeg módosítása, amelyet Cheng és munkatársai írtak le [Plánt Sci. Lett 19.91-99 (1980)]. Az előnyös szervetlen sók az MS szervetlen sók. Az előnyös vitaminok a. Gamborg-féle B-5 vitaminok.

A szénforrás lehet bármilyen szénforrás, amelyen a kallusz növekedni tud. Az előnyös szénfonások között találjuk a cukrokat és cukor-származékokat. Az előnyös cukrok a glükóz és a szacharóz. Különösen kívánatos, hogy a kallusz beindítása olyan kallusz-indukciós tápközegben történjék, amely glükózt tartalmaz, abból a célból, hogy csökkentsük a szövet bámulását, majd a kalluszt átvisszük olyan kallusz-indukciós tápközegbe, amely szacharózt tartalmaz.

A szénforrás koncentrációja 5-60 g/liter, előnyösen mintegy 30 g/liter.

A kallusz-indukciós tápközegben levő auxin bármilyen olyan auxin lehet, amely képes kalluszt indukálni. A megfelelő auxinok között találjuk az a-nafdil-ecetsavat, picloramot, 2,4,5-triklór-fenoxi-ecetsavat, 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, indol-3-vajsavat, indol-3-tejsavat,

HU 203 933 Β indol-3-piroszőlősavat, indol-3-ecetsavat és p-klór-fenoxi-ecetsavat Az előnyös auxin az a-naftil-ecetsav.

Az auxinoknak bármely olyan koncentrációját alkalmazhatjuk a jelen találmány szerinti eljárásban, amely kallusz-képzést indukálhat. A megfelelő koncentráció 0,1 és 10 mg/liter között van. Előnyös koncentráció a 2 mg/liter, főleg ha az auxin a-naftil-ecetsav.

A kallusz indukciós tápközegben levő citokinin bármilyen citokinin lehet, amely képes kallusz redukálására. A megfelelő citokininek között találjuk a kinetint, 6-benzil-adenint, 2-izopentil-adenint és zeatint Az előnyös citokinin a kinetin.

A citokinin bármely koncentrációját, amely képes kallusz-képződést indukálni, alkalmazhatjuk a jelen találmány szerinti módszerhez. A megfelelő koncentráció 0,1 és 10 mg/liter között van. Előnyös koncentráció 1 mg/liter, különösen amikor a citokinin kinetin.

Ha a tápközeg szilárd, ez olyan alkotórészt tartalmaz, amely megszilárdulást okoz, pl. 0,8% agart, pl. Agar Noble (Difco) agart, vagy 0,8% agarózt (minden százalék ebben a leírásban tömeg szerint van megadva).

A szövetet kallusz indukciós tápközegen tenyésztjük annyi ideig, amely elegendő a kallusz keletkezéséhez, így pl. szövetet lehet tenyészteni olyan kallusz indukciós tápközegen, amely szénfonásként glükózt tartalmaz. Öt hét indukciós periódus a tipikus. Altenyésztéseket hajtunk végre, ha szükséges, hogy megakadályozzuk a bámulást Előnyösek az egyhetes altenyésztések.

A keletkező kallusz lehet szervetlen, vagy tartalmazhat pro-embrionális sejttömeget, embriogén kalluszt és/vagy embriókat. Normális esetben, amikor hipokotilokat vagy szikleveleket alkalmazunk az explantátum forrásaként, a kallusz szervezetlennek tűnik. Amikor szomatikus embriókat alkalmazunk explantátum-forrásként, a kallusz legalább egy része, úgy tűnik, embriogén kalluszból áll, amelyet halványsárga szín és csomósodás jellemez. A kallusz fényképe, amelyet az (a) lépés szerint szomatikus embriókból és sziklevelekből kapunk, az 1. illetve 2. ábrákban látható.

Az így létrejött kalluszt azután előnyösen át lehet vinni olyan kallusz altenyésztő tápközegbe, amely hasonló a kallusz indukciós tápközeghez, azzal a kivétellel, hogy ez szénfomásként szacharózt tartalmaz, az altenyésztést akár 5 hónap időtartamon át folytatva. Előnyös, ha az altenyészetbe egy vagy két hónap múlva friss tápközeget juttatunk havonta, előnyösen szacharóz-tartalmú kallusz indukciós tápközeget.

A kalluszt lehet sötétben is indukálni, de az indukciót előnyösen világosban végezzük. A fény lehet pl. 0,5-150 μ Enr’S^-1 intenzitású (-41,75-12525 lux).

(b) lépés. Pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai

Az (a) lépésből kapott kalluszt olyan folyékony tápközegben szuszpendáljuk, amely elősegíti a pro-embrionális vagy burjánzó embrionális sejttömeg kifejlődését Fontos, hogy a sejtsűrűség alacsony legyen. Ennek megfelelően 40 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet előnyösen 15 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet még előnyösebben 5 mg kallusz/ml tenyésztő tápközegnél kevesebbet szuszpendálunk.

A (b) lépésben alkalmazható tápközeg bármilyen tápközeg lehet amely képes pro-embrionális sejttömeget indukálni. A tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat valamilyen szénforrást és valamilyen auxint tartalmaz. A tápközeg tartalmazhat még szerves nitrogénforrásokat, citokinineket aminosavakatés más adalékokat is, pl. kazein-hidrolizátumot vagy kókusz-vizet.

A szervetlen sók és vitaminok lehetnek ugyanazok, mint a fenti (a) lépésben. Előnyösek az MS szervetlen sók és a B-5 vitaminok.

A szénforrás lehet ugyanaz, mint a fenti (a) lépésben. Előnyös a szacharóz alkalmazása. A szénforrás koncentrációja 0,1-100 g/liter. Mintegy 20 g/liter az előnyös, különösen ha a szénforrás szacharóz.

Az auxint azok közül az auxinok közül lehet kiválasztani, amelyeket az (a) lépésben alkalmazunk. Az előnyös auxinok a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav és a picloram. A legelőnyösebb a 4-amino-3,6,6-triklór-pikolinsav, továbbiakban picloram.

Az auxin koncentrációja a (b) lépésben alacsony. A pontos koncentráció függ az adott, alkalmazott auxintól. A viszonylag kis auxinkoncentráció általában hasonló ahhoz, amelyet szuszpenziós tenyésztő tápközegben alkalmaznak, és jelentősen kisebb, mint a (c) lépésben alkalmazott megfelelő auxinkoncentráció. Amikor a picloram az alkalmazott auxin a (b) lépésben, a koncentráció 0,01-5 mg/liter, előnyösen 0,11 mg/liter és legelőnyösebben 0,5 mg/liter. Amikor 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav az alkalmazott auxin a (b) lépésben, a koncentráció 0,01-0,5 mg/liter, előnyösen 0,05-0,25 mg/liter, legelőnyösebben mintegy 0,1 mg/liter.

A pro-embrionális sejttömeg indukcióját előnyösen levegőztetett tápközegben hajtjuk végre 20 °C és 35 °C, előnyösen 22 °C és 33 °C, legelőnyösebben 25 °C és 31 °C közti hőmérsékleten. A levegőztetést bármely olyan eljárással lehet végezni, amely a szakterületen ismert, pl. rúzatással. A (b) lépés végrehajtható sötétben is, de fénynél is legföljebb 75 μ Enr²S^_1-nél (= 6262,5 lux), előnyösen 5 és 10 μ Enr²S^-1 között (417,5-835 lux).

A kalluszt a tápközegben előuyösen altenyésztés nélkül tartjuk fenn, amíg a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai képződnek és elkezdődik a gyors buijánzás. A gyors buijánzás beindulása általában 3 és 8 hét között, tipikusabban 5 és 7 között tart. Az indukciós periódus során a tápközeget helyettesíthetjük friss tápközeggel, bár előnyös, ha nem zavaruk a tápközeget ebben a periódusban.

A pro-embrionális sejttömeg átváltozása kalluszból csomós aggregátummá nyilvánvaló azok számára, akik a növényi szöveltenyésztés szakterületén jártasak. Ez a pro-embrionális sejttömeg halványsárga színével és csomós természetével különböztethető meg. Az ilyen sejttömeg fényképe a 3. ábrában látható.

HU 203 933 Β

Amikor a pro-embriogén sejttömegek csomós aggregátumai gyorsan burjánzani kezdenek, ezeket közvetlenül be lebet vezetni a (c) lépésben leírt tápközegbe, vagy altenyésztést (átoltást) lehet végezni abból a célból, hogy megakadályozzuk a bámulást Az altenyésztés 3-7 naponként, előnyösen 5-7 naponként célszerű. A sejttömeg altenyésztés nélkül mintegy 14 napon át képes túlélni.

(c) lépés. Finoman diszpergáll pro-embrionális sejttömeg

A pro-embrionális sejttömeg (b) lépésben kapott csomós aggregátumait olyan folyékony tápközegbe visszük át, amely képes előidézni azt, hogy a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai finoman diszpeigálttá váljanak. A tápközeg lebet hasonló ahhoz, amelyet a (b) lépésben leírtunk, azzal a kivétellel, hogy a (c) lépés tápközege viszonylag nagy koncentrációban tartalmaz valamely auxint Az auxin lehet bármely auxin, amelyet az (a) lépésben alkalmazunk. Az előnyös auxinok a 2,4,5-triklór-fenoxi-ecetsav és 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav. A legelőnyösebb auxin a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav.

Az auxin koncentrációja függ az adott auxin mibenlététől. Az auxin koncentrációja a (c) lépésben általában nagyobb, vagy legalábbis annak a tartománynak a felsó határán van, mint amelyet a szuszpenziós tenyésztő tápközegekben általában alkalmazunk, és minden esetben jelentősen nagyobb annál, mint az a megfelelő auxin-koncentráció, amelyet a (b) lépésben alkalmazunk.

így pl. amikor a (c) lépésben az auxin 2,4-diklórfenoxi-ecetsav, a koncentráció 0,5—100 mg/liter, előnyösen 1-10 mg/liter, legelőnyösebben 2,57,5 mg/liter lehet.

Az auxin koncentrációja és esetleg mibenléte kivételével a tápközeg, a hőmérséklet és a fényellátottság mértéke ugyanaz lehet, mint amelyet a (b) lépésben leírtunk.

A (c) lépés körülményeit addig tartjuk fenn, amíg a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai kisebb, Finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeggé nem válnak. A kisebb, finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeg megjelenése nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ezt a sejttömeget sárga szín, sima felszín, közepes sűrűség és kis méret jellemzi. A sejttömeg fényképét a 4. ábrában mutatjuk be. Az átváltozás kisebb, finomabban diszpergált sejttömeggé általában 6 héten belül, tipikusabban 2 héten belül megy végbe.

A kisebb finoman diszpergált pro-embrionális sejttömeg tenyészetét határozatlan ideig fenntarthatjuk, ésaltenyésztéseknek (átoltásoknak) is alávethetjük, hogy fenntartsuk az aktív növekedést. Célszerű altenyésztést végezni minden 3-28, előnyösen minden 5-10 napon.

(d) lépés. Érett embriók

A kisebb, Finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeget hozzáadjuk ahhoz a tápközeghez, amely az érett embriók kifejlődését indukálja. A tápközeg előnyösen folyadék.

Az embriók egy sor fejlődési stádiumon haladnak keresztül, mielőtt megérnek és képesek lesznek csírázni. Ezek a stádiumok magukban foglalják a globuláris, szív-alakú, torpedó-alakú és érett stádiumokat. A stádiumok nevei az embriók hozzávetőleges alakján alapulnak.

A (d) lépésben használatos tápközeg bármely olyan tápközeg lehet, amely érett embriók kifejlődését indukálja. Egy használható tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat, valamely szénforrást és valamely redukált nitrogént tartalmazó szerves vegyületet tartalmaz.

A sók és vitaminok és koncentrációik ugyanazok lehetnek, mint amelyeket az (a) lépésben leírtunk. A szénforrás szintén egyike lehet azoknak a szénforrásoknak, amelyeket az (a) lépésben leírtunk. A szénforrás koncentrációja 1-10 g/liter, előnyösen 2-6 g/liter. Az előnyös szénforrás a szacharóz.

A redukált nitrogént tartalmazó szerves vegyület lehet az olyan vegyületek bármelyike, amely, amikor a (d) lépés tápközegéhez adjuk, érett embriók kifejlődését indukálja. Az előnyös vegyületek az aminosavak. Előnyős aminosav a glutamin.

A szabad nitrogén szerves forrásának koncentrációja függ az alkalmazott anyag mibenlététől. Amennyiben a redukált nitrogén szerves forrásaként giutamint alkalmazunk, a hatékony koncentráció 2-260 mmól/liter, előnyösen 5-100 mmól/liter, legelőnyösebben 10-50 mmól/liter között van.

A (d) lépés tápközege tartalmazhat valamely auxint is. Az auxinok az embriókifejlődés korai stádiumában kívánatosak, míg a későbbi stádiumok során nem. Ennek megfelelően, ha egyáltalán vannak jelen auxinok, ezek előnyösen csak addig vannak jelen, amíg a kifejlődés szív-alakú stádiumában van. Ezután az embriókat olyan tápközegbe visszük át, amely nem tartalmaz auxint

Ha van jelen auxin a tápközegben, ennek koncentrációja 0,01-0,1 mg/liter között lehet.

Az auxin azoknak az auxinoknak egyike lehet, amelyeket az (a) lépésben használunk. Az előnyös auxinok a picloram és a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav.

Az embriókat a (d) lépésben tenyészthetjük a 20 *C35 °C közti hőmérsékleten, sötétben vagy világosban. A fényintenzitás lehet pl. 5-75 μ Enr²S^_I között («· 6262,5 lux).

Az embriókat a (d) lépés tápközegében addig tartjuk fenn, amíg az embriók torpedó-alakúvá vagy érett állapotúvá nem érnek. Azok, akik a növényi szövettenyésztés szakterületén jártasak, képesek felismerni a globuláris, szív-alakú, torpedó-alakú és érett embriókat, amint keletkeznek. Ezeknek az embrióknak a fényképeit az 5-8. ábrában mutatjuk be. Az embriók tipikusan 2-5 hét, általában 3-4 hét alatt érnek meg. Általában nem szükséges az embriókat altenyésztésnek alávetni, vagy az embriókat friss tápközegbe átvinni, kivétel az az eset, amely akkor szükséges, amikor a szív-alakú stádiumnál az auxint tartalmazó tápközeget olyan tápközegre kell átcserélni, amely nem tartalmaz auxint

HU 203 933 Β (e) lépés. Csírázás

Az érett embriókat olyan sziláid tápközegre helyezzük. amely képes a csírázás indukálására. A tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat és valamely szénforrást tartalmaz. A tápközeg megfelelő szilárdító anyaggal van szilárdítva, pl. Gelrite-vel (Kelko, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), agarózzal vagy agaira],

A szervetlen sók lehetnek azok, amelyeket az (a) lépésben leírtunk, úgy módosítva, hogy a nitrát nagy koncentrációban legyen jelen, míg az ammónium-ion vagy teljesen hiányozzék, vagy csak igen kis koncentrációban legyen jelen. A nitrát koncentrációja 20-60 mmól/liter, előnyösen 30-60 mmól/liter, előnyösebben 35-45 mmól/liter. Az ammónium-ion koncentrációja ne legyen nagyobb, mint 5 mmól/liter.

Az előnyös szénforrás valamely cukor. Az előnyös cukor a szacharóz. A szénforrás koncentrációja függ az alkalmazott szénforrás mibenlététől. így pl. amikor a szénforrás szacharóz, a koncentráció 0,1-6 tömeg%, előnyösen 0,5-4 tömeg%, előnyösebben 1-3 tömeg% között van.

Az (e) lépés tápközegében adott esetben valamely redukált nitrogén tartalmú szerves vegyület is jelen lehet Ez a szerves vegyület előnyösen valamely aminosav, vagy aminosavak keveréke, amelyek képesek elősegíteni a csírázást Az előnyös aminosav vagy aminosav-keverék a glutamin, illetve a kazein-hidrolizátum.

A csökkentett nitrogén-tartalmú szerves fonás koncentrációja függ az alkalmazott vegyület mibenlététől, így pl. ha a vegyület glutamin, a koncentráció 2-50 mmól/liter, előnyösen 5-30 mmól/liter, előnyösebben 10-20 mmól/liter lehet. Amikor az anyag kazein-hidrolizátum vagy módosított kazein-hidrolizátum, a koncentráció 100-3000 mg/liter, előnyösen 10002800 mg/liter, előnyösebben 1500-2500 mg/liter.

A csírázás előnyösen olyan tápközegen megy végbe, amely szerves nitrogénforrást tartalmaz, egészen addig, amíg hajtások keletkeznek. Az embriókat azután olyan tápközegbe visszük át, amely nem tartalmaz szerves nitrogénforrást, hogy a gyökerek megnyúljanak.

Az embriók sűrűsége a tápközegben korlátozott olyan sűrűségig, hogy kevesebb legyen, mint az a sűrűség, amely a fejlődés öngátlását idézi elő. A megfelelő sűrűségek 1-100 embrió között vannak egy 9 cm-es petricsészén, amely mintegy 10-75 ml, előnyösen 2550 ml, és legelőnyösebben 35 ml tápközeget tartalmaz.

Az (e) lépés szerinti tápközeget 20-30 °C hőmérsékletek között tartjuk fenn. Az előnyös hőmérséklet mintegy 25 °C.

Az (e) lépésben valamennyi fény szükséges. Az 5 és 150 μ Em^-2S^_1 közti fényintenzitás (= 417,5-12525 lux), előnyösen a 10 és 75 μ Em^S'¹ közti fényintenzitás (= 835-6262,5 lux) a megfelelő.

Az embriókat az (e) lépés tápközegén vagy tápközegein addig tartjuk fenn, amíg az embriók kicsíráznak, tipikusan 1-20 napig, általában 2-4 napig. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy az embriók mikor csíráznak ki.

(f) lépés. Növények

A csírázást követően a csíranövénykét földbe viszszük át, hogy növénnyé növekedjen. Az átvitt növényeket kezdetben üveggel fedjük, hogy megmaradjon a nagy nedvességtartalom. Egy hét üveg alatt tartás után a csíranövényeknek vagy növényeknek nem szükséges speciális kezelés.

Felhasználás - Szaporítás

Az érett embriókat tömeges szaporításhoz és klónozáshoz alkalmazhatjuk. Ez együtt jár az embriók csírázásával és a csíranövénykék földbe átültetésével, más növekedési szubsztrátumokba átvitelével vagy más növényi növekedési körülmények közé vitelével. Az érett embriókat be lehet zárni egy mesterséges magburkolatba és „szomatikus mag”-ként elültetni. A tömeges szaporítás és klónozás akkor előnyös, ha a hibrid szülőket vagy egy hibridet magát kell tömegtermelésbe fogni.

A sejteket, pro-embriókat, embriókat, csíranövényeket és növényeket bármikor lehet elemezni a fentebb leírt stádiumok során abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon van-e jelen valamiféle új jellemvonás, amely genetikai változás eredménye. A jellemvonás lehet hasznos in vitro vagy in planta jellemvonás. A hasznos jellemvonások között találjuk a fitotoxintűrést, száiazságtűiést, hidegtűrést, betegségtűrést stb.

Az (a), (b) és (c) lépések sejtjeit is alá lehet vetni szövettenyésztési eljárásoknak, amelyek képesek olyan sejteket vagy növényeket termelni, amelyek kívánatos tulajdonságokkal bírnak, pl. herbicid tűrőképességgel. Az ilyen módszerekre példák találhatók az alábbi irodalmi helyen: Chaleff és Ray: Science, 223,1148-1151 (1984).

Példák

1. Táblázat - Tápközegek

Az összes tápközeg tartalmaz Murashige és Skoog szervetlen sókat és Gamborg-féle B-5 vitaminokat, pH 5,7-re vannak beállítva, és összetételük az alábbi (a számértékek mg/l-t jelentenek):

Makro-tápanyagok

MgSO₄x7H₂O	370
KHjPO₄	170
kno₃	1900
nh₄no₃	1650
CuC1₂x2H₂O	440
Mikm-tápanyagok
H₃BO₃	6,2
MnSO₄xH₂O	15,6
ZNSO₄X7H₂O	8,6
NaMoO₄x2H₂O	0,25
CuSO₄x5H₂O	0,025
CuC1₂x6H₂O	0,025
KI	0,83
FeSO₄x7H₂O	27,8
Na₂EDTA	37,3
Vitaminok
TiaminxHCl	10
PiridoxinxHCl	1
Nikotinsav	1
Mio-inozit	100

HU 203 933 Β

A fentieken kívül a különböző tápközegek az alábbi komponenseket tartalmazzák

A tápkőzeg száma	további komponensek
1	20 g/liter szacharóz, 0,6% agar (Noble
2	30 g/liter glükóz, 2 mg/1 a-naftil-ecetsav, 1 mg/liter kinetin, 0,8% agar (Noble)
3	30 g/liter szacharóz, 2 mg/1 a-naftil-ecetsav, 1 mg/liter kinetin, 0,8% agar (Noble)
4	20 g/liter szacharóz, 0,S% picloram
5	20 g/liter szacharóz, 5 mg/12,4-diklór-fenoxi-ecetsav
6	20 g/liter szacharóz, 15 mmól/1 glutamin

A tápközegeket 25 ’C, 28 ’C és 31 ’C hőmérsékleten alkalmazzuk, és 16 óra fény/8 óra sötétség fotoperiódussal, 20 pEm^_2S^_1 fényintenzitással (-1670 lux).

1. példa. Magsterilezés és -ültetés

Gyapotmagokat (Gossypium hirsutum var. Coker

310) béjtalanítunk, a magot 2 percre koncentrált H₂SO₄-be helyezve. A magokat azután négyszer mossuk steril desztillált vízben, 96%-os etanolba bemártjuk, lángoljuk és az 1. tápközegbe ültetjük 31 ’C hőmérsékleten.

2. példa. Kallusz indukció

Az ültetéstől számított hetedik napon a csiranövény hipokotiljait kimetsszük, hosszanti irányban felvágjuk, 2 mm-es darabokra vágjuk és a 2. tápközegre helyezzük 31 ’C hőmérsékleten. Hipokotildarabokat (2 mm) viszünk át hetenként friss 2. tápközegre és ezeket a tenyészeteket 31 ’C hőmérsékleten tartjuk fenn. A 4. heti 2. tápközegre történő átvitelt követően a hipokotildarabokon burjánzó kallusz szövetet eltávolítjuk az eredeti explantátumról és 3. tápközegre helyezzük 31 ’C hőmérsékleten. A kalluszt friss 3. tápközegre visszük át egy hónap múlva, és további 1-2 hónapon át tartjuk fenn.

3. példa. Szuszpenziós tenyészet beindítása

A szuszpenziós tenyészet beindításához 100 g kallusz tenyészetet helyezünk 35 ml 4. tápközegre 125 ml DeLong lombikban. A szuszpenziókat 6 héten át rázatjuk 140 fordulat/perccel, 28 ’C hőmérsékleten, ekkor ezek gyorsan burjánzani kezdenek.

4. példa. Embriókifejlődés és növényregenerálás

Az embriók, amelyek a 4. tápközegen képződnek, még gyorsabban butjánzanak a 4. tápközegről 5. tápközegre helyezéssel. Ezt az embriogén szuszpenziót elosztjuk és altenyésztésnek (átoltásnak) vetjük alá minden 3-7. napon friss 5. tápközegbe. Az 5. tápközegben burjánzó embriók kifejlesztéséhez az embriókat mossuk 6. tápközeggel, majd 6. tápközegre helyezzük. 3-4 héttel a 6. tápközegre történt átvitel után az érett embriókat szilárd tápközegre helyezzük 25 ’C hőmérsékleten. A sziláid tápközeg módosított MS tápközeget tartalmaz, amely olyan MS sókat tartalmaz, amelyben 40 mmól/1 KNO₃ van KNOj és NH4NO3 helyett, valamint tartalmaz B-5 vitaminokaL 2% szacharózt, 15 mmól/liter glutamint, és

0,2% Gelrite-vel (pH 5,7) van megszilárdítva. Az embriókat petricsészére helyezzük 25 ’C hőmérsékleten. A hajtások kifejlődése szórványos ezen a tápközegen, és a gyökér megnyúlást megnöveljük olyan módon, hogy az embriókat a fenti módosított MS tápközegre visszük át, amely nem tartalmaz glutamint A csírázó embriókat azután cserépben levő Vermiculite talajba ültetjük és főzőpohárral befedjük (25 ’C). Miután a csíranövények a Vermiculite talajban kialakultak, a főzőpoharat eltávolítjuk. Egy hét múlva, 28 °C fokon végzett növesztés után, a csíranövényeket üvegházba kiültetjük, hogy tovább fejlődjenek növényekké.

Claims

20 1. Eljárás pro-embrionális gyapot sejttömeg előállítására folyékony szuszpenzióban, melynek során gyapot kalluszt folyékony, pro-embrionális sejttömeg képződést indukáló, legalább egy auxint tartalmazó közegben szuszpendálunk, amíg pro-embrionális sejttömeg csomós

25 aggregátumai képződnek és gyorsan burjánzani kezdenek; azzal jellemezve, hogy a pro-embrionális sejttömeg gyorsan buijánzó csomós aggregátumait átvisszük finomabb diszpeigált pro-embrionális sejttömeg képzésére alkalmas, legalább egy auxint a szuszpenziós tenyészkö30 zegek által szokásosan tartalmazó mennyiségőél nagyobb mennyiségben tartalmazó, továbbá szervetlen sókat, vitaminokat, 0,1-100 g/1 koncentrációban szénforrást, szerves nitrogén-forrást, citokinineket, aminosavakat és egyéb adalékokat tartalmazó tápközegre.

35
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy auxinként 0,5-100 mg/liter koncentrációban 2,4diklór-fenoxi-ecetsavat alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk.

40
4. Eljárás érett gyapot embrió előállítására folyékony szuszpenzióban, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított pro-embrionális gyapot sejttömegből torpedó-alakú vagy sziklevél-embriókat fejlesztünk ki úgy, hogy a pro-embrionális gyapot sejt45 tömeget torpedó-alakú, vagy sziklevél-embriók képződését indukáló, szervetlen sókat, vitaminokat, 1—10 g/1 szénforrást, csökkentett nitrogén-tartalmú szerves vegyületet és adott esetben 0,01-0,1 mg/1 auxint tartalmazó tápközegre helyezzük.

50
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk.
6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a csökkentett nitrogéntartalmú vegyűletként glutamint alkalmazunk, 2-250 mmól/liter koncentrációban.

55
7. Eljárás gyapot csíranövények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított érett embriókat 20 ®C-30 ’C hőmérsékleten 5 μ Em^-2S^_1 és 150 μ Enr²S^_1 közötti fényintenzitással embrió csíráztató tápközegben, mely szervetlen sókat, vitaminokat,

60 szénforrást, adott esetben csökkentett nitrogén-tartal7

HU 203 933 Β mú szerves vegyületet és szilárdító anyagot tartalmaz, csíráztatjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk.
9. Eljárás gyapot növények előállítására, azzal jelle- 5 mezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított kicsirázott embriókból növényeket növesztünk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk.