DE69422205T3

DE69422205T3 - Verbesserungen in der somatischen Embryogenese

Info

Publication number: DE69422205T3
Application number: DE69422205T
Authority: DE
Inventors: Gerrit Jan Van Holst; Marc Kreuger; Wiert Van Der Meer; Erik Postma; Rob Abbestee
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2014-01-14
Also published as: US5587312A; EP0608716B1; DE69422205D1; ZA94289B; EP0608716B2; JP4121160B2; IL108330A0; DK0608716T4; CA2113374A1; AU5314294A; ATE187865T1; CN1092107A; EP0934691A2; TR28634A; AU675094B2; DE69422205T2; CA2113374C; KR100314969B1; EP0608716A2; ES2140471T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur somatischen Embryogenese, das zur Regeneration ganzer Pflanzen aus Gewebskultur geeignet ist und insbesondere verbesserte Verfahren zum Erhalt somatischer Embryos über somatische Embryogenese unter Verwendung von Flüssigmedien per se.
Hintergrund
Der kommerzielle Vertrieb eines Verfahrens, das effektiv die somatische Embryogenese verwendet, gilt wegen des Potentials für höhere Ausbeuten an Pflanzen über vergleichsweise kurze Zeitintervalle als wünschenswert gegenüber dem und ökonomisch attraktiver als beispielsweise das organogene Clonen.
Es ist bekannt, daß bestimmte Pflanzenzellen das Potential besitzen, sich in ganze Pflanzen bei Züchtung in geeigneten Pflanzengewebskulturmedien zu differenzieren. Solche Medien umfassen typischerweise anorganische Salze, eine Kohlenstoffquelle wie Saccharose, Inosit, Thiamin und dgl. Beispiele für üblicherweise verwendete Pflanzengewebskulturmedien sind diejenigen von Murashige und Skoog (MS-Medium), Lindsmaier und Skoog, Gamborg (B5-Medium) und dgl.
Die Zusammensetzung solcher Pflanzengewebskulturmedien kann modifiziert werden, um das Wachstum der verwendeten speziellen Pflanzenzellen zu optimieren. Fast alle Pflanzenzellen benötigen Pflanzenhormone, z. B. Auxine oder auxinartige Verbindungen, wie Indolessigsäure, Indolbuttersäure, Naphthalinessigsäure oder 2,4-D und/oder ein Cytokinin, wie Benzyladenin, Zeatin, Kinetin oder dgl. Um optimales Wachstum zu gewährleisten, kann es auch vorteilhaft sein, Vitamine, wie Nicotinsäure, Pyridoxin oder andere Komponenten, wie Kokosnußmilch, Caseinhydrolysate und dgl., zuzusetzen.
In der Vergangenheit benötigte die Bildung von echten somatischen Embryos die Verwendung von Kallusmaterial, das undifferenzierte Konglomerate von Zellen mit sehr großen Vakuolen und kleineren runden Zellen mit sehr kleinen Vakuolen als Material für die primäre Wachstumsphase umfaßt, aus dem somatische Embryos dann abgeleitet werden können. Jedoch besitzt die Verwendung eines solchen Materials als Ausgangsmaterial bei der somatischen Embryogenese viele Nachteile und erwies sich als von begrenztem Nutzen beim Erhalt großen Zahlen von Pflanzen mit im wesentlichen ähnlichem Phänotyp und/oder mit im wesentlichen Gleichförmigkeit bezüglich des Grads der Ploidie. Pflanzen mit Ursprung aus Kallus haben eine Tendenz, somaclonale Variationen und/oder Nichtgleichförmigkeit bezüglich des Grads der Ploidie zu zeigen (Chaleff R. S. (1983) Science 219: 676–682; Larkin P. J. (1987) Iowa State Journal of Research 61(4): 393–434; De Klerk G-J (1990) Acta Bot. Neerl. 39(2): 129–144; Karp A. & Bright S. W. J. (1985) Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 2: 199–234; Custers J. B. M. et al. (1990) Acta Bot. Neerl. 39(2): 153–161 (cucumis sativus L.); Kysely W. et al. (1987) Plant cell Reports 6: 305–308 (pisum sativum L.); Ezura H. (1992) Plant Science 85: 209–213 (cucumis melo); und Kiviharju E. et al. (1992) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28: 187–194 (Cyclamen persicum Mill)].
In bekannten Beispielen von Patentanmeldungen wird Kallusmaterial bei der somatischen Embryogenese verwendet. Ein Beispiel, die WO 90/01058 von Plant Genetics Inc., beschreibt die Verwendung von Kallusmaterial, um somatische Embryos zu erwerben, während die Wirkung der Verwendung einer größeren Reihe von synthetischen Auxinen untersucht wird. Kallusmaterial wird aus geeignetem Explantatmaterial über viele Wochen Züchtung und/oder Subkultivierung auf festen Medien gebildet oder gezüchtet. Die somatische Embryogenese wird dann durch Überführen des Kallusgewebes in ein Medium, das ein Pflanzenhormon, wie 2,4-D oder ein Analogon davon, enthält, in Gang gesetzt. Der Ploidiegrad der somatischen Embryos oder der Ploidiegrad der erhaltenen Pflanzen wird nicht erwähnt. Während die Verwendung von Kallusmaterial bei der somatischen Embryogenese zum Erhalt von Pflanzen nützlich sein kann, bei denen der Erhalt somaclonaler Varianten zur Anreicherung eines verfügbaren Gen-Pools interessant sein kann, ist dies von geringem Nutzen für Samenhändler oder Züchter, die einfach handelsübliche Anzahlen von Pflanzen erhalten möchten, die im wesentlichen alle den gleichen Genotyp besitzen.
Durzan und Gupta (in: "Biotechnology in agriculture", Hrsg. A Mizrahi, 1988, Alan R. Lies Inc., New York, S. 53– 81) beschreiben die somatische Embryogenese und Polyembryogenese bei Koniferen unter Verwendung embryonaler Suspensormassen (ESMs).
Es wird anerkannt, daß Karottenzellinien aus Mikroclustern aus meristematischen Zellen cloniert wurden und bezüglich ihrer Fähigkeit, Embryos zu produzieren, untersucht wurden. (P. Coutos – Thevenot et al., Plant Cell Reports (1990) 8: 605–608).
Die Autoren beschreiben die Verwendung einer anfänglichen Zellsuspension aus Hypocotylen heimischer Karotte (S1-Stämme) in einem Pflanzengewebskulturmedium, das das Auxin 2,4-D umfaßt, die Isolierung von Zellclustern durch Filtration, die Resuspension der Zellcluster in einem Pflanzengewebskulturmedium, das 2,4-D umfaßt, um die Populationsdichte der Cluster zu erhöhen, den Transfer von Zellkolonien aus den isolierten Clustern in eine Petri-Schale, die festes Pflanzengewebskulturmedium, das 2,4-D und 1% Bactoagar ent hält, enthält, um die Zellkoloniebildung zu induzieren, und ihre Abscheidung auf einem zweiten festen Medium, das 2,4-D und 1% Bactoagar um einen Nährkallus aus einem S1-Stamm enthält, die Disoziierung jeder Zellkolonie in einem Pflanzengewebskulturmedium, das 2,4-D enthält, und die Subkultivierung der so erhaltenen Kulturen in einem Pflanzengewebskulturmedium, das 2,4-D enthält. Die anschließende Analyse der gemäß diesem Verfahren erhaltenen Zellinien zeigte, daß 13 von 40 Zellinien embryogen waren, aber die meisten dieser Zellinien ihr embryogenes Potential im Verlauf der Zeit verloren. Nur eine Zellinie hatte ein ziemlich konstantes embryogenes Potential über eine größere Zeitspanne. Gemäß der durchflußcytometrischen Analyse war die zuletzt genannte Zellinie diploid.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt von somatischen Embryos in Suspensionskultur, das technisch einfach ist. Es benötigt im allgemeinen nicht die Niederschlagung von Zellinien um einen Nährkallus. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt folglich die Produktion von somatischen Embryos in einem kommerziellen Maßstab. Die erfindungsgemäßen somatischen Embryos können verwendet werden, um kommerzielle Mengen von Pflanzen mit im wesentlichen dem gleichen Genotyp bereitzustellen.
Bisher wurde die somatische Embryogenese als potentiell starkes Mittel zum Erhalt von Pflanzen bezeichnet, jedoch verhinderten die Impraktikabilitäten der Verwendung somatischer Embryogenese, ausgehend von Kallusmaterial, die erfolgreiche Ausnutzung der Technologie.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß handelsübliche Mengen echter somatischer Embryos durch die Verwendung von Flüssigkulturtechniken per se und ohne Notwendigkeit, feste Medien und/oder ein Kallusgewebe zu verwenden, erhalten werden können. Es wurde auch gefunden, daß es möglich ist, die Biomasse von PEMs in Flüssigmedien und daher die Fähigkeit, somatische Embryos in kommerziellen Mengen daraus zu produzieren, zu erhöhen. Die Verwendung solcher Flüssigkulturtechniken enthebt von der Notwendigkeit, Stufen der Kaluszüchtung/Kalussubkultivierung zu verwenden, und stellt zum ersten Mal ein Mittel zum Erhalt von Populationen somatischer Embryos bereit, die bezüglich des Grads der Ploidie gleichförmig sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt somatischer Embryos über somatische Embryogenese, das im wesentlichen das Risiko des Erhalts somaclonaler Varianten verringert oder beseitigt.
Die Erfindung betrifft ein zuverlässigeres Mittel zum Erhalt echter somatischer Embryos in handelsüblichen Mengen aus Explantatmaterial, das nicht die Verwendung von Kallusgewebe benötigt und/oder die Verwendung von festen Medien als wesentliche Elemente der Mittel benötigt.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung gehen aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und Beispiele hervor.
Ausführliche Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt somatischer Embryos in Suspensionskultur gemäß Anspruch 1.
Das verwendete Explantatmaterial kann eine dicotyle oder monocotyle Pflanzenart sein. Bevorzugt leitet sich das Explantatmaterial von einer dicotylen Pflanzenart ab. Typischerweise leiten sich die somatischen Embryos von proembryogenen Massen (PEMs), Strukturen, die sich morphologisch von Kallusmaterial unterscheiden und auch als meristematische Cluster bekannt sind, ab. Die PEMs besitzen den gleichen Ploidiegrad oder Ploidiegrade, wie das Explantatmaterial, aus dem sie abgeleitet sind. So können, wenn Explantatmaterial, das diploide und tetraploide Zellen umfaßt, einer diploiden Pflanze entnommen wird, diploide und tetraploide PEMs, die daraus hervorgehen, über Sieben, Zellsortieren und dgl., vor der Weiterzüchtung in Flüssigmedium getrennt werden müssen.
PEMs umfassen im wesentlichen differenziertes wachsendes Pflanzengewebe und können als Vorläufer echter somatischer Embryos angesehen werden. Unter dem Lichtmikroskop (40fache bis 100fache Vergrößerung) erscheinen PEMs als Konglomerate aus kleinen runden, cytoplasmareichen Zellen, die kleine Vacuolen umfassen. Als solche können die erfindungsgemäßen PEMs als im wesentlichen in genetischer Hinsicht identisch mit den Elternzellen der Pflanzen, aus denen sie abgeleitet sind, betrachtet werden und führen schließlich zu echten somatischen Embryos, die als bipolar erkennbar sind, d. h. die Fähigkeit besitzen, zu Wurzeln und Schößlingen aus den meristematischen Wurzel- und Schößlingeweben zu führen. So ist ein lebensfähiger echter somatischer Embryo also einer, der zu mindestens einem Schößling führen kann, der genetisch ausgedrückt, im wesentlichen mit dem zellulären Material, aus dem das Explantat hervorging und von dem es abgeleitet ist, identisch ist, wenn es weiteren geeigneten Behandlungen, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendet werden, unterworfen wird.
Pflanzengewebsmaterial, das zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist Explantatmaterial, das aus jedem Pflanzenorgan oder Teil davon oder einem anderen in geeigneter Weise differenzierten Pflanzengewebe, z. B. Protoplasten, erhalten werden kann. Ein solches Gewebe kann aus der Gruppe, umfassend Stamm, Blatt, Blütenblatt, Hypocotylabschnitt, Apicalmeristem, Ovarien, zygotischer Embryo per se, Knolle bzw. Keimling, Gefäßbündel, Pericytele, Antherenfilamente und dgl., ausgewählt werden. Alternativ kann ein geeignetes Explantatmaterial ein somatischer Embryo per se sein. Das Pflanzengewebe kann aus jeder Pflanzenart von Interesse entnommen werden und umfaßt Pflanzengewebe, ausgewählt aus monocotylen oder dicotylen Pflanzen. Eine Auswahl von Pflanzentypen von Interesse findet sich in dem Handbook for Seedling Evaluation, J. Bekendam und R. Grob, ISTR, Zürich, Schweiz, 1979, S. 28 bis 29 und ist weiter im Index auf den S. 122 bis 126 beispielhaft ausgeführt, worauf hiermit Bezug genommen wird. Bevorzugte Pflanzentypen umfassen diejenigen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Cyclamen, Cucurbita, Lycopersicon, bevorzugt Lycopersicon, für Tafel oder zum Essen, Allium, Begonia, Beta, Primula, Brassica, Capsicum, Cichorium, Gerbera, Impatien, Lactuca, Oryza, Pelargonium, Petunia, Viola und Zea. Am meisten bevorzugt sind Pflanzentypen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Cyclamen, Cucurbita, Beta, wie Beta vulgaris (Zuckerrübe), Brassica, wie B. oleracea oder B. napus, Viola, Pelargonium und Capsicum.
Das flüssige Pflanzengewebskulturmedium, das zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, kann jedes flüssige Pflanzengewebskulturmedium, das sich zur Induktion und/oder Förderung der Embryogenese eignet, sein. Beispiele für üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendete Grundmedien umfassen Gaborgs B5-Medium (B5), Murashige-Skoog-Medium (MS) und Varianten davon.
Die vorliegende Erfindung zieht in Betracht, daß eine ausreichende Menge an Auxin mit der Fähigkeit, die PEM-Bildung zu induzieren, einem geeigneten Flüssigkulturmedium, das das Explantat oder ein anderes geeignetes Ausgangsmaterial in einer ersten Induktionsphase enthält, zugesetzt wird, und daß nach einer solchen ersten Induktionsphase ein weiteres geeignetes flüssiges Kulturmedium, das das PEM- Wachstum und die Multiplikation fördern kann, verwendet wird, in dem die Auxinkonzentration in geeigneten Intervallen ergänzt wird. Es ist folglich vorteilhaft, die Auxinkonzentration im Verlauf der Zeit zu überwachen, beispielsweise unter Verwendung von HPLC-Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, um sicherzustellen, daß die Entwicklungsstufe der Suspension auf der Stufe der PEM fixiert wird. Es ist auch wichtig, dem Pflanzengewebskulturmedium nicht zu viel Auxin hinzuzufügen, um mögliche toxische Nebenwirkungen der Auxine zu vermeiden und um dennoch die PEMs in einem lebensfähigen Zustand zu erhalten.
Das flüssige Pflanzengewebskulturmedium für PEM-Wachstum und -Multiplikation kann das Pflanzengewebskulturmedium für die anfängliche Induktionsphase sein, in dem die Konzentration an Auxin und/oder an anderen wesentlichen Komponenten einfach in geeigneten Intervallen ergänzt wird, so daß die Induktions- und Promotionsphasen der somatischen Embryogenese stattfinden können. Das anfängliche Medium für die Induktionsphase kann auch durch frisches Pflanzengewebskulturmedium, das geeignete Auxinkonzentrationen enthält, in geeigneten Intervallen ersetzt werden, wobei das flüssige Pflanzengewebskulturmedium das gleiche sein kann, wie das geeignete, aber andere flüssige Pflanzengewebskulturmedium, das anfänglich verwendet wurde, oder sich davon unterscheiden kann. So ist klar, daß das tatsächliche Pflanzengewebskulturmedium oder -medientypen, die verwendet werden, für die Erfindung nicht kritisch sind, vorausgesetzt, daß sie flüssig sind und zur Induktion und/oder Förderung der PEM-Bildung in Gegenwart geeigneter Auxinkonzentrationen verwendet werden können.
Es ist auch leicht klar, daß die notwendige Auxinkonzentration von Pflanzenart zu Pflanzenart variiert und von Pflanzensorte zu Pflanzensorte variieren kann. Der Typ und die Konzentration des Auxins, das für eine gegebene Sorte das optimale Ergebnis ergibt, kann mit Standardtests bestimmt werden. In Abhängigkeit von der Pflanzensorte kann es vorteilhaft sein, ein Gemisch von Auxinen zu verwenden. Beispiele für Auxine und auxinartige Verbindungen, die zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen Indolessigsäure, Indolbuttersäure, Naphthalinessigsäure und Gemische davon. Der Auxingehalt wird bei einer solchen Konzentration gehalten, das das Wachstum und die Bildung von PEMs fördert.
Die Auxinkonzentration wird bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 30 mg/l in Abhängigkeit von den PEM-Zahlen oder der Biomasse und der Pflanzenart von Interesse gehalten. Ein geeignetes Gemisch von Auxinen kann NAA und 2,4-D in geeigneten Konzentrationen umfassen. Die wirksame Auxinkonzentration an Naphthalinessigsäure (NAA) liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0 bis 20 mg/l und die von 2,4-D im Bereich von etwa 0, 1 mg/l bis zu etwa 10 mg/l in Abhängigkeit von der Pflanzenart von Interesse. Beispielsweise benötigen Cyclamen-PEMs nicht die Anwesenheit von NAA, aber benötigen die Anwesenheit von 2,4-D in einer Anfangskonzentration von etwa 5 bis 10 mg/l; es wurde gefunden, daß Lycopersicon-PEMs NAA in einer Anfangskonzentration von 20 mg/l und 2,4-D in einer Anfangskonzentration von 1 mg/l benötigen.
In Abhängigkeit von der Pflanzensorte und dem verwendeten Pflanzengewebskulturmedium kann es vorteilhaft sein, eine nicht-phytotoxische Menge Cytokinin dem auxinhaltigen Medium zuzusetzen, um die Auxinaufnahme zu erleichtern.
Die Stufen i) und ii) des Anspruchs 1 können beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Das Explantatmaterial wird in ein geeignetes Flüssigmedium, wie B5-Medium oder MS-Medium, gegeben, das ein Auxin oder ein Gemisch von Auxinen in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 30 mg/l in Abhängigkeit von der Art von Interesse enthält und die bezüglich der Induktion der PEM-Bildung effektiv ist, gegeben. Das Explantatmaterial wird in einer geeigneten Dichte von etwa 0,01 g Frischgewicht/l bis etwa 100 g Frischgewicht/l Kultur, bevorzugt von etwa 1,0 g Frischgewicht/l bis etwa 10 g Frischgewicht/l für eine Zeitspanne, die in Wochen gemessen wird, während der PEMs erscheinen, gezüchtet. Die Zeitspanne kann zwischen etwa zwei Wochen bis zu etwa 14 Wochen oder mehr, typischerweise von etwa vier Wochen bis etwa acht Wochen, in Abhängigkeit von der interessierenden Pflanzenart betragen. Typischerweise werden die erhaltenen PEMs aus der anfänglichen Explantatmaterialkultur, beispielsweise durch Verdünnung des Mediums oder Ersatz des Mediums, herausgetrennt und weiter auf den gleichen oder einem ähnlichen frischen Flüssigmedium gezüchtet.
Die erhaltenen PEMs können in eine Wachstums- oder Multiplikatorphase unmittelbar unter den gleichen oder ähnlichen Umgebungsbedingungen wie denjenigen, die zur Induktion von PEM-Bildung benötigt werden, eintreten. Der Einfachheit halber wird diese Phase hier als Multiplikatorphase bezeichnet, da Zunahmen der PEM-Zahlen oder der PEM-Biomasse überwacht werden und wachsen gesehen werden.
Nachdem die Induktion der PEM-Bildung beobachtet wird, wird das flüssige Pflanzengewebskulturmedium so überwacht, daß die Auxinkonzentration in einer Höhe aufrechterhalten wird, die ausreicht, das PEM-Wachstum und -multiplikation ohne signifikante PEM-Entwicklung zu fördern. Die Multipli kationsphase kann die Subkultivierung des flüssigen Pflanzengewebskulturmediums der Wahl in regelmäßigen Verdünnungen umfassen, so daß die Auxingehalte auf Gehalte kontrolliert werden, die ausreichende PEM-Multiplikation für ein geeignetes Zeitintervall zu fördern. Alternativ können die PEMs von der anfänglichen Explantatmaterialkultur abgetrennt werden und in ein auxinhaltiges Pflanzengewebskulturmedium gegeben werden und einfach bis zu der gewünschten PEM-Biomasse unter Verwendung eines diskontinuierlichen oder eines kontinuierlichen Kultursystems multiplizieren gelassen werden. Typischerweise ist dies mit der Aufrechthaltung einer Auxinkonzentration über einem Gehalt von etwa 0,1 mg/l für eine Zeitspanne verbunden. Die Zeitspanne für die Multiplikationsphase kann in Jahren gemessen werden, abhängig davon, wie viele PEMs zur Umwandlung in echte somatische Embryos benötigt werden, jedoch wird üblicherweise die Multiplikationsphase in Monaten oder Wochen, wie zwischen etwa zwei bis etwa 30 Wochen, in Abhängigkeit von der Menge an benötigter PEM-Biomasse gemessen. Einmal können in der Multiplikationsphase PEMs zu einem beliebigen Zeitpunkt gewonnen werden, um sie in im wesentlichen auxinfreies Pflanzengewebskulturmedium zu geben, in dem sie sich dann weiter zu echten somatischen Embryos entwickeln können. Dies kann mit dem Aussieben, wie hier beschrieben, d. h. der Selektion der PEM-Fraktionen einer bestimmten Größe, verbunden sein, die durch Siebe mit geeigneter Größe (z. B. ein Sieb mit einer Porengröße von 150 μm) passieren können, aber auf Sieben kleinerer Größe, z. B. einem Sieb mit einer Porengröße von 100 mm, zurückgehalten werden.
Die PEM-Bildung und -Multiplikation wird vorteilhafterweise durch Supplementieren einer geeigneten Kohlenstoffenergiequelle, zweckdienlicherweise eines löslichen Kohlenhydrats, wie Saccharose, Glukose oder Raffinose, in das flüssige Pflanzengewebskulturmedium beeinflußt.
Typische Kohlenhydratkonzentrationen liegen im Bereich von 15 g/l bis 90 g/l, bevorzugt von 20 g/l bis 60 g/l, Pflanzengewebskulturmedium.
Die Multiplikationsphase kann in Kolben oder in einem Bioreaktor durchgeführt werden. Bioreaktoren sind auf dem Fachgebiet zur Züchtung von Zellsuspensionen zur Handhabung von sekundären Zellmetaboliten bekannt, jedoch wurde die Verwendung von Bioreaktoren zur Züchtung von PEM bisher nicht beschrieben. Es wurde gefunden, daß Bioreaktoren nützlich zur Produktion sehr großer Mengen von PEMs in relativ kurzen Zeitintervallen sind.
Zweckdienlicherweise werden gepackte Zellvolumina aus PEM-Suspensionskulturen in ein geeignetes Medium, das eine ausreichende Menge einer geeigneten Kohlenstoffenergiequelle, wie beispielsweise Saccharose, Glukose und Raffinose, in einer Konzentration zwischen etwa 15 g/l bis zu etwa 90 g/l oder bevorzugter zwischen etwa 20 g/l bis etwa 60 g/l, in Abhängigkeit von der interessierenden PEM-Spezies enthält, in einem geeigneten Bioreaktor inokuliert. Preil W und Beck A. [(1991) Acta Horticulturae 289, Plant Technology: 179–192] beschreiben die somatische Embryogenese in Bioreaktoren unter Verwendung von Vibromischern, jedoch wird in dieser Untersuchung nicht angegeben, daß PEM-Bildung und -Multiplikation vor der Entwicklung von PEMs in somatische Embryos durchgeführt wird. Es wurde gefunden, daß die Verwendung von Vibromischern in Bioreaktoren an PEM-Suspensionskulturen signifikant die Lebensspanne der PEMs im Verlauf der Zeit erhöht, die PEM-Biomasse zu erhöhen hilft, PEM-Biomasseverluste verringert und Verklumpen der PEMs verhindert. Ein mit einer perforierten Mischplatte oder einer Rührscheibe ausgestatteter Vibromischer (erhältlich von Applikon BV, Niederlande und Chemap, AG, Schweiz), der an einer fixierten Ebene in einem Bioreaktor positioniert wurde und im wesentlichen in der fixierten Ebene vibrieren konnte, führte dazu, daß PEM-Suspensionskulturen ohne signifikanten Verlust der PEM-Biomasse vermischt oder gerührt wurden.
Bevorzugt wird der Vibromischer in im wesentlichen der vertikalen Ebene vibriert. Eine typische Arbeitsbetriebsfrequenz eines Vibromischers zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt 50 Hz; die Amplitude liegt zweckdienlicherweise in der Größenordnung von + 6 mm oder weniger. Sobald eine PEM-Biomasse erhalten wird, die zu einer gewünschten Anzahl somatischer Embryos führen kann, können die PEMs in Kontakt mit einem im wesentlichen auxinfreien flüssigen Pflanzengewebskulturmedium gebracht werden, in dem sie sich in somatische Embryos entwickeln können.
Die PEM-Suspension wird vorteilhafterweise belüftet. Dies kann in an sich bekannter Weise geschehen. Wenn ein Vibromischer verwendet wird, kann die Luft beispielsweise in dem Vibromischerreaktor unter Verwendung einer porösen Perlvorrichtung perlförmig eingeleitet werden.
Aus den vorstehenden Ausführungen und den Beispielen folgt, daß die optimalen Bedingungen für die verschiedenen Parameter, wie Typ und Konzentration der Auxine, die Anwesenheit eines Cytokinins, die Energie-(Kohlenhydrat)-Quelle, die Rühr- oder Vibrationsfrequenz, die Sauerstoffzufuhr, die Lichtintensität und die Wellenlänge, in Abhängigkeit von dem verwendeten Pflanzenmaterial variieren werden. Solche optimalen Bedingungen können unter Verwendung von Standardtests (wie in den Beispielen erläutert) bestimmt werden.
Die anschließenden Stufen iii) und iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Erhalt somatischer Embryos können wie folgt durchgeführt werden:
Die Förderung der PEM-Entwicklung in somatische Embryos kann dadurch erzielt werden, daß die PEMs in ein auxinfreien Pflanzengewebskulturmedium gegeben werden. Die lebensfähigen PEMs können sich zu somatischen Embryos entwickeln. Vor dem Transfer in auxinfreies Medium werden die PEMs vorteilhafterweise gesiebt, z. B. durch ein Nylonsieb, um die PEM-Größenfraktion auszuwählen, die äußerst effizient die gewünschten somatischen Embryos ergibt. Ein zu hoher Gehalt an nichtlebensfähigen PEMs hemmt die Bildung somatischer Embryos. Im allgemeinen ist es wünschenswert, PEMs zu verwenden, die mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugter mindestens 15% lebensfähige PEMs enthalten. Die optimale Größenfraktion kann nach Standard-Screening-Tests bestimmt werden.
Die PEMs einer ausgewählten Größe können beispielsweise durch Sieben oder jedes andere Verfahren zur Sortierung nach Größe auf dem Fachgebiet gewonnen werden. Der Fachmann wird erkennen, daß die Größe von PEMs mit gewünschter Größe (d.h. die PEM-Fraktion mit einem hohen Gehalt an lebensfähigen PEMs) von Art zu Art variiert, wie hier näher ausgeführt.
Eine gesiebte Fraktion der PEMs ist eine, die dadurch erhalten wird, daß PEMs durch ein Filtermittel, wie ein Maschennetz bekannter Porengröße, z. B. ein Nylonnetz, geleitet werden, um PEMs innerhalb eines gegebenen Größenbereiches zu erhalten. PEMs können von jeder beliebigen Größe bis zu etwa 1 mm Durchmesser in Abhängigkeit von der Pflanzenart sein, jedoch können Aggregate von PEMs bis zu 5 mm Durchmesser besitzen. Im allgemeinen liegt die gewünschte Größe der einzelnen PEMs im Bereich von μm. Es wurde gefunden, daß die Größe der PEMs für den Erhalt einzelner davon abgeleiteter somatischer Embryos kritisch ist. Bevorzugt ist eine gewonnene PEM-Fraktion eine, bei der jede PEM darin zu einem somatischen Embryo unter geeigneten Bedingungen führen kann. Natürlicherweise variiert die Größe der speziellen lebensfähigen gesiebten PEM-Fraktion von Pflanzenart zu Pflanzenart. Beispielsweise ist die nützlichste PEM-Fraktion für Gurke eine, in der die Größe der PEMs zwischen etwa 100 μm bis etwa 150 μm liegt; die PEM-Fraktion für Cyclamen von etwa 150 μm bis etwa 300 μm. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die PEM-Fraktion eine, in der jede PEM zu mindestens einem somatischen Embryo, bevorzugt zu einem einzelnen somatischen Embryo, führen kann.
Das im wesentlichen auxinfreie flüssige Pflanzengewebskulturmedium ist eines, das PEMs erlauben kann, sich zu somatischen Embryos zu entwickeln. So wird angenommen, daß das im wesentlichen auxinfreie flüssige Pflanzengewebskulturmedium ein auxinentleertes Pflanzengewebskulturmedium sein kann, in dem Restgehalte an Auxin vorhanden sein können, aber wobei diese Auxingehalte, sofern vorhanden, nicht wesentlich die Entwicklung von PEMs in somatische Embryos stören, oder ein auxinfreies Pflanzengewebskulturmedium sein kann. Natürlicherweise ist dem Fachmann klar, daß das im wesentlichen auxinfreie Pflanzengewebskulturmedium entweder in einen Kolben oder in einen Bioreaktor, beispielsweise einen, der mit einem Vibromischer ausgestattet ist, in Abhängigkeit von der Anzahl der erwünschten somatischen Embryos, gegeben wird. Die erhaltenen somatischen Embryos können dann in Pflanzen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden umgewandelt werden. So ist es durch Überwachen der PEM-Biomasse möglich, große Anzahlen somatischer Embryos in kommerziellen Mengen zu erhalten.
Das auxinfreie Medium umfaßt zweckdienlicherweise eine lösliche Kohlenhydratenergiequelle in einer Konzentration von 15 g/l bis 90 g/l, bevorzugt 20 g/l bis 60 g/l. Geeignete Kohlenhydratenergiequellen umfassen Saccharose, Glukose und Raffinose.
Kommerzielle Mengen an einem somatischen Embryo können im Wertebereich von ein paar Hundert (z. B. 500) bis zu mehreren Millionen (z. B. 3.000.000) oder mehr in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Kunden liegen. Wenn beispielsweise ein Erfordernis nach etwa 200.000 Pflanzen besteht, wird die PEM-Multiplikation fortgesetzt, bis eine PEM-Biomasse erreicht wird, die im wesentlichen zu etwa 200.000 somatischen Embryos führen kann. Solche PEMs werden dann in Kontakt mit einem auxinfreien flüssigen Pflanzengewebskulturmedium gebracht, in dem sie sich zu somatischen Embryos entwickeln können.
Sobald sich echte somatische Embryos in dem im wesentlichen auxinfreien Pflanzengewebskulturmedium entwickeln, können sie von dem auxinfreien Pflanzengewebskulturmedium abgetrennt und in Pflanzen unter Verwendung von üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendeten Techniken umgewandelt werden.
Die somatischen Embryos werden dann zweckdienlicherweise von den nichtlebensfähigen PEMs vor der kommerziellen Verwendung abgetrennt. Dies kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Die nichtlebensfähigen PEMs sind im allgemeinen kleiner als die somatischen Embryos. Die somatischen Embryos können beispielsweise manuell, durch Sieben oder Zellsortieren isoliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet Chargen von somatischen Embryos, die somatische Embryos umfassen, die im wesentlichen alle den gleichen Ploidiegrad besitzen. Chargen von somatischen Embryos können zwischen mehreren Hundert bis zu 10.000en oder mehr in Abhängigkeit von den kommerziellen Erfordernissen umfassen. Bevorzugt umfassen die Chargen von somatischen Embryos im wesentlichen diploide somatische Embryos oder im wesentlichen tetraploide somatische Embryos. Eine Charge somatischer Embryos kann einfach eine Suspension somatischer Embryos sein, aus der die flüssigen Medien entzogen wurden, wobei die somatischen Embryos in einen geeigneten Behälter gegeben werden. Die umgebende Umwelt des Be hälters kann eine relativ hohe Feuchtigkeit, z. B. 100%, haben und kann bei einer geeigneten kühlen Temperatur über 0°C bis zu etwa 15°C gehalten werden. So gelagerte somatische Embryos können bis zu etwa 4 Tagen gehalten werden. Alternativ können die somatischen Embryos einem Trocknungsverfahren unterworfen werden, gefroren, pelletiert, in ein Gel verkapselt werden und dgl.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft ferner Suspensionskulturen mit somatischen Embryos, die sich von Daucus unterscheiden, umfassend somatische Embryos, die im wesentlichen alle den gleichen Ploidiegrad besitzen. Bevorzugte somatische Embryos sind diploid oder tetraploid. Die somatischen Embryos leiten sich von dicotylem oder monocotylem Explantatmaterial ab.
Nun folgen Beispiele, die die Erfindung erläutern. Es ist jedoch zu verstehen, daß die Beispiele in keiner Weise den Umfang der Erfindung beschränken sollen.
Beispiel 1: Initiierung von embryogenen Cyclamenzellkulturen und somatische Embryos daraus
Samen der Cyclamensorte "Concerto Scarlet" (Sluis und Groot) werde mit 70% Ethanol (für 2 min) und mit einer 1,5%igen Lösung Natriumhypochlorit (für 45 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser (3 ×) gewaschen. Die Samen werden auf feuchtem Papier für 2 bis 4 Wochen bei 23°C gekeimt, und der daraus hervorgehende Keimling wird als Explantatmaterial verwendet. Drei Keimlinge werden in 10 ml B5-Grundmedium (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 10 mg/l 2,4-D, 100 mg/l Myoinosit, 1,0 mg/l Nicotinsäure, 1,0 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler (G10-Gyrorotationsschüttler, New Brunswick Scientific, Edison, N.J., USA) mit 100 UpM im Dunkeln bei 23°C gezüchtet. Nach 7 Tagen wird das Medium durch frisches Medium ersetzt. Nach weiteren 7 Tagen wird die Kultur 5fach auf ein Volumen von 50 ml mit frischem Medium verdünnt. Nach weitere 7 Tagen werden das zentrale Mark, das die Gefäßbündel und die Pericycle des gekeimten Explantatmaterials aus der verdünnten Kultur umfaßt, von dem gekeimten Explantatmaterial abgetrennt und, abgesehen vom Rest der Keimlinge, in 25 ml B5-Grundmedium, das mit 20 g/l Saccharose, 100 mg/l Myoinosit, 1,0 mg/l Nicotinsäure, 1,0 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl, 5 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, subkultiviert. Die Subkulturen werden wöchentlich zweifach für 4 Wochen verdünnt. Proembryogene Massen erscheinen nach etwa 4 Wochen. Die PEMs werden durch weiteres Subkultivieren, wie vorstehend beschrieben, für eine Zeitspanne von 2 Wochen multipliziert. Die PEMs können sich in lebensfähige echte somatische Embryos durch weiteres Züchten auf auxin- und cytokininfreiem B5-Medium, das mit 20 g/l Saccharose, 100 mg/l Myoinosit, 1,0 mg/l Nicotinsäure, 1,0 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl supplementiert ist, entwickeln.
Beispiel 2: Initiierung von embryogenen Cyclamenzellsuspensionskulturen und somatische Embryos daraus.
Cyclamensamen (cv Conserto Scharlaken Othello, Zaadunie BV) werden mit 70% Ethanol (für 2 min) und 1%iger Natriumhypochloritlösung (für 45 min) oberflächensterilisiert und gründlich mit sterilem Wasser gewaschen (3 ×). Die Samen werden auf feuchtem Papier zwischen zwei bis fünf Wochen im Dunkeln bei 23°C gekeimt. Hervorgehende Keimlinge werden als Explantatmaterial verwendet und in zwei bis acht Stücke erschnitten. Der Ploidiegrad des Explantatmaterials wird gemäß der Lehre von De Laat A. A. M. et al. (1987), Plant Breeding 99: 303–307, gemessen und als diploid befunden.
Das Explantatmaterial aus den drei Keimlingen wird in 10 ml B5-Grundmedium (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, in einem 50 ml Kolben auf einem Rotationsschüttler (100 UpM) im Dunkeln und bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Alle Kolben werden mit einer Aluminiumfolie bedeckt. Nach einer Woche wird die Kultur 5fach mit B5-Grundmedium, das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l Myoinosit, 1,0 mg/l Nicotinsäure, 1,0 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf ein Volumen von 50 ml in einem 250 ml Kolben verdünnt. Nach weiteren zwei Wochen enthält die Kultur PEMs, die vom Rest der Kultur mit einer Pipette mit einer weiten Öffnung abgetrennt werden und separat gezüchtet werden. Die PEMs werden visuell als Zellklumpen, die im wesentlichen aus kleinen runden cytoplasmatischen Zell bestehen, identifiziert. In diesem Stadium werden PEMs entweder als einzelne Zellklumpen oder als eine Anzahl von Zellklumpen, die aneinander haften, identifiziert. Die Kulturen werden alle zwei Wochen durch Inokulieren von 1 ml gepackten Zellen in B5-Grundmedium, das mit 20 g/l Saccharose, 5 mg/l 2,4-D, 100 mg/l Myoinosit, 1,0 mg/l Nicotinsäure, 1,0 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl und 1 mg/l Kinetin auf ein Endvolumen von 50 ml supplementiert ist, in einem 250 ml Kolben unter Verwendung einer Pipette mit einer weiten Öffnung kultiviert. Das Volumen der gepackten Zellen (PCV), d. h. die gesamte Zellmasse nach der Zentrifugation wird für PCV_Anfang und PCV_Ende durch Zentrifugieren der Proben aus Kulturen für 2 min bei 700 × g bestimmt. Die embryogene Zellinie wächst im allgemeinen mit einer Verdopplungszeit zwischen etwa 4 bis 6 Tagen, wie aus Messungen von PCV_Anfang und PCV_Ende unter Verwendung der Formel von Schlegel, H. G. (1981) Allgemeine Microbiologie, Thieme, Stuttgart, S. 190, berechnet wurden. Die so erhaltene embryogene Zellinie wird für mindestens 45 Wochen gehalten und ist genetisch stabil, d. h. der Ploidiegrad ist diploid, ebenso wie der des ursprünglichen Explantatmaterials.
Die PEMs werden durch Sieben der PEM-Kultur durch Nylonsiebe mit einer Porengröße von 250 μm bzw. 100 μm selektiert. Acht Tage nach dem Subkultivieren wird die höchste Anzahl der PEMs/ml erhalten. Diese Fraktion führt zu einer optimalen Embryoentwicklung und der höchsten Anzahl von Embryos pro PCV der PEM-Kultur. Die Anzahl der gesiebten PEMs liegt im allgemeinen im Bereich von 1000 bis 5000 PEMs/ml PCV.
Nach dem Sieben werden die PEMs gewaschen und in Entwicklungsmedium, d. h. MS- oder B5-Medium, das mit Saccharose oder Glukose bis zu einer Konzentration von 174 mM supplementiert ist, inokuliert. 25 bis 50 PEMs/ml werden in einem mit einer Aluminiumfolie und Nescofilm (Bando Chemicals Ind. Ltd., Japan) versiegelten Kolben gezüchtet. Nach drei bis vier Wochen werden torpedoförmige Embryos gebildet, die zygotischen Embryos ähneln. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden 250.000 Embryos produziert. Unter Verwendung der Techniken der durchflußcytometrischen Analyse, wie von De Laat A. M. M. a. a. O. beschrieben, an einer Zufallsprobe der Embryokultur wird der DNA-Gehalt der 500 somatischen Embryos bewertet. Es wird gefunden, daß alle Embryos diploid sind.
Die Umwandlung (d. h. Keimung) der Cyclamenembryos umfaßt die Keimlingbildung, gefolgt von der Bildung von zusätzlichen Wurzeln, und wird durch Züchten der Embryos auf einem Flüssigmedium, d. h. MS- oder B5-Medium, mit einem Glukose- oder Saccharosegehalt von etwa 116 mM bzw. 58 mM induziert. Die Keimlingbildung ist als die Entwicklung einer Knolle oder einer Keimlingstruktur aus dem Hypocotyl definiert. Die weitere Entwicklung des Keimblatts, das das erste Blatt bildet, kann entweder in Flüssigmedium oder auf einem festen Medium, wie Perlite, sterilisiertem Boden und dgl. erfolgen.
Umgewandelte Embryos werden direkt auf Perlite oder in Blumenerde unter sterilen Bedingungen (in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle) oder unter nichtsterilen Bedingungen (kein Zusatz einer Kohlenstoffquelle) gesät und zeigen nach zwei bis vier Wochen im Dunkeln bei 18 bis 20°C eine Keimblattbildung. Eine relativ hohe Feuchtigkeit von etwa 90 wird verwendet. Über 90% der Embryos wandeln sich in das Keimblattstadium unter sterilen Bedingungen um. Sobald das Keimblatt auftritt, werden die so erhaltenen Schößlinge an das Licht gebracht und vor dem Transfer in das Treibhaus abgehärtet.
Beispiel 3: Initiierung von embryogenen Tomatenzellkulturen
Samen der Tomatensorte "Manhattan" (Sluis und Groot) werden mit 70% Ethanol (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung für 15 min oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser gewaschen (3 ×). Die Samen werden auf feuchtem Papier im Verlauf von drei Tagen bei einer Temperatur von 23°C gekeimt. Vollständige Sämlinge werden gewonnen, und jeder Sämling wird in vier Stücke geschnitten, die dann als Explantatmaterial verwendet werden. 10 Sämlinge werden so aufgeschnitten und in 15 ml flüssigem B5-Grundmedium (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 20 mg/l NAA, 1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l Kinetin, 100 mg/l Myoinosit, 1 mg/l Nicotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl und 10 mg/l Thiamin-HCl supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM bei 23°C unter einer cyclisierenden 16stündigen Lichtperiode und 8stündigen Dunkelheitsperiode inkubiert. Das Kulturmedium wird bezüglich der Auxinkonzentration unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten HPLC-Techniken überwacht. Sobald die Auxinkonzentration auf Werte unter 0,1 mg/l, nach etwa 7 Tagen, fällt, werden 15 ml frisches B5-Grundmedium (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 20 mg/l NAA, 1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l Kinetin, 100 mg/l Myoinosit, 1 mg/l Nicotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl und 10 mg/l Thiamin-HCl supplementiert ist, zugesetzt, um das Volumen auf 30 ml Kultur aufzufüllen. Diese Kultur wird alle 4 bis 7 Tage subkultiviert, indem das Explantatmaterial und die Zellen sich 15 min absetzen gelassen werden, und die Kultur wird durch Aufnahme von 15 ml verbrauchtem Medium und Auffüllen mit 15 ml frischem Medium erneut angesetzt. Nach etwa 4 bis 7 Wochen nach dem anfänglichen Züchten des Explantatmaterials werden proembryogene Massen (PEMs) beobachtet. Die PEMs werden durch weiteres Subkultivieren, wie vorstehend beschrieben, für eine Zeitspanne von 2 Wochen multipliziert. Die PEMs werden weiter auf auxinfreiem B5-Grundmedium, das wie vorstehend, jedoch ohne NAA, 2,4-D und Kinetin supplementiert ist, subkultiviert und echte somatische Embryos werden beobachtet.
Beispiel 4: Initiierung von embryogenen Tomatenzellkulturen
Samen der Tomatensorte "Majorca" (Sluis und Groot) werden mit 70% Ethanol (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung für 15 min oberflächensterilisiert und dann gründlich mit sterilen Wasser gewaschen (3 ×). Die Samen werden auf feuchtem Papier 7 Tage bei einer Temperatur von 23°C im Dunkeln gekeimt. Die Keimblätter werden gewonnen und in Stücke geschnitten, die als Explantatmaterial verwendet werden. 6 Cotyledonen von 3 Sämlingen werden so aufgeschnitten und in 15 ml Flüssigmedium A (siehe Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM bei 23°C im Dunkeln inkubiert. Nach 14 Tagen werden 35 ml frisches Medium A (siehe Tabelle 1) einschließlich Hormone, wie vorstehend beschrieben, zugesetzt. Die Kultur wird alle 14 Tage durch 2faches Verdünnen in frischem Medium A (siehe Tabelle 1), das mit Hormonen wie vorstehend supplementiert ist, subkultiviert. Etwa 4 Wochen nach der anfänglichen Züchtung des Explantatmaterials werden PEMs beobachtet. Die PEMs werden durch weiteres Kultivieren, wie vorstehend beschrieben, multipliziert. Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums A Makroelemente

g/l

NH₄NO₃ 1,20

(NH₄)₂SO₄ 0,66

KH₂PO₄ 0,55

KNO₃ 1,01

MgCl₂·6H₂O 0,30

CaCl₂ 0,22

Citronensäure 0,5

Saccharose 20

Mikroelemente 2 ml Stammlösung/l Vitamin-Gamborg-B5 (1 ml/l) 1 ml Stammlösung/l

pH-Wert eingestellt auf 5,8 unter Verwendung von KOH (1 M). Mikroelemente (Stammlösung)

	g/l
FeSO₄·7H₂O	6,9
CuSO₄·5H₂O	0,65
CoCl₂·6H₂O	0,12
MnCl₂·4H₂O	2,97
NaMoO₄·2H₂O	0,24
KI	0,041
HBO₃	1,5
ZnSO₄·7H₂O	4,3
NiSO₄·6H₂O	0,39
Citronensäure	2
pH = 2,3
g24

Vitamin-Gamborg-B5 (Duchefa): Stammlösung supplementiert mit:

Myoinosit	100 g/l
Nicotinsäure	1 g/l
Thiamin-HCl	1 g/l

Beispiel 5: Initiierung von embryogenen Gurkenzellsuspensionskulturen und somatische Embryos daraus.
Samen der Gurkensorte "Pandorex" (Sluis und Groot) werden mit 70%iger Ethanollösung (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (für 45 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser (3 ×) gewaschen. Die Gurkensamen werden auf einem befeuchteten Papier zwei Tage bei 23°C gekeimt. Die aus dem Samen ausgetretenen Keimwurzeln werden als Explantatmaterial verwendet. 15 Keimwurzeln werden in 10 ml flüssigem MS-Grundmedium plus Vitamine (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C inkubiert. Das Kulturmedium wird bezüglich der Auxinkonzentration unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten HPLC-Techniken überwacht. Nachdem die Auxinkonzentration auf < 0,1 mg/l nach etwa 5 Tagen gefallen ist, wird die Kultur 5fach in 50 ml flüssigem MS-Grundmedium plus Vitamine (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kul tur mit flüssigem MS-Grundmedium plus Vitamine (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, subkultiviert. 8 Wochen später erscheinen proembryogene Massen.
Die PEM-Kulturen werden dann durch Inokulieren von 0,4 ml gepacktem Zellvolumen in 50 ml alle zwei Wochen in Medium A (von Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, weiter subkultiviert. Die Verdopplungszeit der Gurkenzellinie beträgt etwa 2,7 Tage, wie unter Verwendung der Formel von Schlegel (a. a. O.) bestimmt wurde. Die PEMs werden durch Sieben der Kultur durch Nylonsiebe mit Porengrößen von 150 μm bzw. 100 μm für PEMs mit einer Größe zwischen 100 und 150 μm ausgewählt. Die Fraktion mit 100 bis 150 μm ergibt die höchste Anzahl einzelner somatischer Embryos pro PCV der PEM-Kultur. Die PEMs aus dieser Zellinie sind entweder diploid oder tetraploid. Das Verhältnis zwischen diploiden und tetraploiden Zellen bleibt im Verlauf der Zeit für über zwei Jahre in flüssigem Medium A, das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, konstant, wie nach dem Verfahren von De Laat, A. A. A. et al., a. a. O., gemessen. Die PEMs ergeben diploide sowie tetraploide Pflanzen. Das gemessene Verhältnis von Diploidie : Tetraploidie spiegelt sich in den PEMs sowie in den Pflanzen wider.
Die PEMs entwickeln sich zu echten somatischen Embryos durch Züchten der PEMs auf auxin- und cytokininfreiem MS-Medium, das mit 20 g Saccharose und 5 μM ABA supplementiert ist.
Beispiel 6: Manipulation der embryogenen Gurkenzellinien, um 100% diploide oder 100% tetraploide Suspensionskulturen zu erhalten.
Die Suspension von Beispiel 5 besteht aus diploiden und tetraploiden PEMs, die zur Entwicklung von Embryos mit den gleichen Ploidiegraden führen.
Einzelne PEMs mit einem Durchmesser von etwa 2 mm werden aus einer 13 Wochen alten Zellsuspension, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 angesetzt worden war, herausgepickt. Die Messung der einzelnen PEMs bezüglich der Ploidiegrade nach dem Verfahren von De Laat et al. (1987) Plant Breeding 99, 303–307, zeigt, daß die PEMs entweder zu 100 diploid oder zu 100% tetraploid sind. Ferner führt die Züchtung einzelner PEMs über eine Zeitspanne von 15 Wochen (d.h. 14tägig durchgeführte Subkulturen) in flüssigem M5-Grundmedium, wie in Beispiel 5 beschrieben, zu Zellinien, die aus 100% diploiden oder 100% tetraploiden Zellen bestehen, wie unter Verwendung des Verfahrens von De Laat et al. a. a. O. bestimmt wurde. Diploide PEMs führten zu diploiden Embryos und diploiden Pflanzen. Tetraploide PEMs ergeben tetraploide Embryos und tetraploide Pflanzen.
Beispiel 7: Manipulation von embryogenen Gurkenzellinien, um 100% diploide oder 100% tetraploide Suspensionskulturen zu erhalten.
Die Pflanzen der Gurkensorte "Pandorex" (Sluis und Groot) werden unter sterilen Bedingungen unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3 gezüchtet. Die Ovarien mit einer Größe von etwa 1 cm werden als Explantat verwendet. Die Messung des Ploidiegrads nach dem Verfahren von De Laat et al. a. a. O. zeigt, daß das Explantat vollständig diploid ist. Etwa die Hälfte der Frucht wird in Scheiben mit einer Dicke von etwa 0,5 mm geschnitten und in 10 ml flüssigem MS-Grundmedium plus Vitamine (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Das Kulturmedium wird unter Verwendung an sich bekannter HPLC-Techniken bezüglich der Auxinkonzentration überwacht. Nachdem die Auxinkonzentration auf < 0,1 mg/l gefallen ist, nach etwa 5 Tagen, wird die Kultur 5 × auf 50 ml mit flüssigem MS-Grundmedium plus Vitamine (im Handel erhältlich von Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Niederlande), das mit 20 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin supplementiert ist, verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kultur mit dem vorstehend supplementierten MS-Medium subkultiviert.
8 Wochen später erscheinen proembryogene Massen. Die PEM-Kulturen werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, in Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, subkultiviert. 0,4 ml des gepackten Zellvolumens wird in 50 ml Medium A, das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, inokuliert. Die Verdopplungszeit der Gurkenzellinie beträgt etwa 2,7 Tage in Medium A (Tabelle 1), wie unter Verwendung der Formel von Schlegel (a. a. O.) bestimmt wurde. Der Ploidiegrad der PEM-Suspension wird nach dem Verfahren von De Laat et al. a. a. O. bestimmt und als diploid befunden. Die PEMs werden durch Sieben der Kultur durch ein Nylonsieb für PEMs mit einer Größe zwischen 100 und 150 μm ausgewählt. Die PEMs werden zu echten somatischen Embryos durch Züchten ausgewählter PEMs auf auxin- und cytokininfreiem MS-Medium, das mit 20 g/l Saccharose supplementiert ist, entwickelt. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden 200.000 Embryos in 4 Wochen aus der PEM-Kultur produziert. Der Ploidiegrad von zufällig ausgewählten 500 somatischen Embryos ist überall diploid, wobei das Verfahren von De Laat et al. a. a. O. verwendet wurde.
Beispiel 8: Erhalt bezüglich des Ploidiegrads stabiler PEM-Suspensionen
Gurken-PEM-Suspensionen werden in Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, gezüchtet. Während der Subkultivierung werden Makroelemente und Mikroelemente im Überschuß in jeder Subkultivierungsstufe entsprechend den PEM-Erfordernissen gehalten, so daß Mängel an diesen Elementen während des Subkultivierungsintervalls (d. h. 2 Wochen) nicht auftreten. Die Auxinspiegel (d. h. 10 mg/l 2,4-D) werden auf gleiche Weise aufrechterhalten. Kinetin (d. h. 0,5 mg/l) wird dem Medium zu Beginn der Subkultivierung zugesetzt und aus dem Medium in vier Tagen entleeren gelassen. Die Überwachung der Auxinkonzentration im Verlauf der Zeit unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten HPLC-Standardtechniken gewährleistet, daß das Entwicklungsstadium der Suspension in dem PEM-Spiegel fixiert wird. Embryogene diploide PEM-Suspensionen werden für bis zu 2 Jahre in Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, aufrechterhalten und zeigen einen stabilen Ploidiegrad. Embryogene tetraploide PEM-Suspensionen werden für 6 Monate aufrechterhalten und zeigen einen stabilen Ploidiegrad. Dieser Ploidiegrad wird aufrechterhalten, bis die embryonale Entwicklung initiiert wird.
Beispiel 9: Initiierung embryogener Zuckerrüben-PEM-Suspensionskulturen und somatische Embryos daraus.
Samen von Zuckerrübe (Hilleshog AB, Schweden) werden mit einer 70%igen Ethanollösung (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (für 45 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser (3 ×) gewaschen. Die Zuckerrübensamen werden auf feuchtem Papier 7 bis 14 Tage bei 23°C gekeimt. Die Keimblätter aus den gekeimten Samen werden als Explantatmaterial verwendet. 6 Cotyledonen werden in 10 ml Flüssigmedium A (Tabelle 1) das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Die Kultur wird 5fach mit Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, in 50 ml nach ein oder zwei Wochen verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kultur mit Medium A (Tabelle 1), das wie vorstehend supplementiert ist, oder Ersetzen des Mediums mit frischem Medium A, das, wie vorstehend beschrieben, supplementiert ist, subkultiviert. Nach 4 bis 6 Wochen erscheinen somatische Embryos auf dem Explantatgewebe. Die Embryos werden aus dem Explantat entnommen und separat gezüchtet. 4 Wochen später produzieren gezüchtete Embryos PEMs. Die PEM-Kulturen werden weiter durch Ergänzen mit Medium A von Tabelle 1, das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, subkultiviert.
Die PEMs werden durch Sieben der PEM-Suspension zuerst auf einem Nylonsieb mit einer Porengröße von 500 um und dann auf einem Nylonsieb mit einer Porengröße von 100 μm gewonnen. Die PEM-Fraktion 100 bis 500 μm ergibt allgemein überwiegend einzelne somatische Embryos. Die PEMs werden auf auxin- und cytokininfreiem Medium A, das wie vorstehend supplementiert ist, gezüchtet und entwickeln sich zu echten somatischen Embryos.
Beispiel 10: Initiierung von embryogenen Paprika-PEM-Suspensionskulturen.
Samen von Paprika (cv Gedeon of Sluis en Groot) werden mit einer 70%igen Ethanollösung (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (für 45 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser gewaschen (3 ×). Die Paprikasamen werden auf feuchtem Papier 7 bis 14 Tage bei 23°C gekeimt. Die Keimblätter aus dem gekeimten Samen werden als Explantatmaterial verwendet. 6 Cotyledonen werden in 10 ml Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D supplementiert ist, auf einen Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Die Kultur wird 5 × auf 50 ml nach zwei Wochen verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kultur wie vorstehend beschrieben oder Ersetzen des Mediums durch frisches flüssiges Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D supplementiert ist, subkultiviert. Nach 2 bis 4 Wochen erscheinen Embryos an den geschnittenen Kanten des Explantats. Die Embryos werden aus dem Explantat entnommen und aus der Kultur entfernt und auf flüssigem Medium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Zeatin supplementiert ist, subkultiviert. 4 Wochen später scheinen proembryogene Massen. Die PEMs werden durch weiteres Subkultivieren, wie vorstehend beschrieben, multipliziert. Die PEMs werden durch Sieben der Suspension, wie in Beispiel 5 beschrieben, gewonnen. Die Fraktion 100 bis 500 μm führt zu überwiegend einzelnen somatischen Embryos. Die PEMs werden auf auxin- und cytokininfreiem Medium A (Tabelle 1) gezüchtet.
Beispiel 11: Initiierung von embryogenen Viola-PEM-Suspensionskulturen und somatische Embryos daraus.
Samen von Viola (cv Delta violet of Sluis en Groot) werden mit einer 70%igen Ethanollösung (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (für 30 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser gewaschen (3 ×). Violasamen werden auf feuchtem Papier 7 bis 14 Tage bei 23°C gekeimt. Die Cotyledonen aus den gekeimten Samen werden als Explantatmaterial verwendet. 6 Cotyledonen werden in 10 ml Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2, 4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Die Kultur wird 5 × mit Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf 50 ml nach zwei Wochen verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kultur oder Ersetzen des Mediums durch frisches flüssiges Me dium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, subkultiviert. Nach 8 bis 10 Wochen erscheinen proembryogene Massen. Die PEMs werden durch weiteres Subkultivieren, wie vorstehend beschrieben, multipliziert. Die PEMs werden durch Sieben der Suspension, wie in Beispiel 5 beschrieben, gewonnen, ausgenommen, daß die Nylonsiebporengrößen, die verwendet werden, 50 μm und 250 μm betragen. Die PEMs werden auf auxin- und cytokininfreiem Medium A (Tabelle 1), das wie vorstehend supplementiert ist, gezüchtet und zu einzelnen somatischen Embryos entwickelt.
Beispiel 12: Initiierung von embryogenen Pelargonium-PEM-Suspensionskulturen
Samen von Pelargonium (cv Pulsar red of Sluis en Groot) werden mit einer 70%igen Ethanollösung (für 2 min) und einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (für 30 min) oberflächensterilisiert, dann gründlich mit sterilem Wasser (3 ×) gewaschen. Pelargoniumsamen werden auf befeuchtetem Papier 7 bis 14 Tage bei 23°C gekeimt. Die Cotyledonen aus den gekeimten Samen werden als Explantatmaterial verwendet. 6 Cotyledonen werden in 10 ml Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf einem Rotationsschüttler mit 100 UpM im Dunkeln bei einer Temperatur von 23°C gezüchtet. Die Kultur wird 5 × mit Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, auf 50 ml nach einer Woche verdünnt. Die Kulturen werden 14tägig durch zweimaliges Verdünnen der Kultur mit Flüssigmedium A (Tabelle 1), das mit 4 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Kinetin supplementiert ist, oder Ersetzen des Medium mit frischem Medium A, das, wie vorstehend beschrieben supplementiert ist, subkultiviert.
Nach 4 bis 6 Wochen erscheinen proembryogene Massen. Die PEMs werden durch weiteres Subkultivieren, wie vorste hend beschrieben, multipliziert. Die PEMs werden durch Sieben der Suspension, wie in Beispiel 5 beschrieben, gewonnen, ausgenommen, daß die Porengröße des verwendeten Nylonsiebs 250 μm und 50 μm beträgt. Die PEM-Fraktion zu 50 bis 250 μm führt zu überwiegend einzelnen somatischen Embryos. Die PEMs werden auf auxin- und cytokininfreiem Medium A (Tabelle 1) gezüchtet und entwickeln sich zu einzelnen somatischen Embryos.
Beispiel 13: Multiplizieren der PEM-Biomasse in Bioreaktoren
4 × 8 ml PCV werden aus Gurken-PEM-Suspensionskulturen, die, wie in Beispiel 5 beschrieben, subkultiviert wurden, gewonnen und in vier Bioreaktoren (Applikon Dependable Instruments B. V.), umfassend zwei herkömmliche 2 1 Bioreaktoren, die mit Schnellrührern ausgestattet sind, und zwei Bioreaktoren, die mit Vibromischern, die im Handel erhältlich sind von Chemap AG, ausgestattet sind, die jeweils 1 1 Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist erhalten, inokuliert. Die Luft wird in die Vibromischerreaktoren über eine poröse 15 μm Perlvorrichtung, die am Ende des Vibratorschafts lokalisiert ist, der gegen den Boden der Reaktorkammer positioniert ist, perlförmig eingebracht. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einem der Vibromischerreaktoren wird zu 40% bestimmt und in dem anderen zu 97%, wobei Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, angewendet werden. Vertikal positionierte Vibromischer werden mit einer Frequenz von 50 Hz und einer maximalen Amplitude von + 6 mm betrieben. Die Vibromischer werden so positioniert, daß die Vibrationsbewegung in der vertikalen Ebene stattfindet, und die horizontale Bewegung wird minimal gehalten. Rührscheiben werden an den Enden des Vibrationsschafts angebracht, so daß die Flüssigkeit in einer Strömungsschleife, die die Zellsuspension von der Peripherie des Reaktorgefäßes nach unten und dann nach oben zieht, geleitet wird.
Luft wird in die herkömmlichen Bioreaktoren am Boden des Bioreaktors über ein Beschickungsrohr, das mit einer porösen 15 μm Beschickungsvorrichtung versehen ist, eingeleitet. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird wie vorstehend zu Konzentrationen von 40% bzw. 97% bestimmt. Die Rührgeschwindigkeit des Rührers wird bei etwa 150 UpM + 50 UpM gehalten.
6 Tage nach der Inokulation wird die Verdopplungszeit bestimmt, werden die PEMs aus der PEM-Suspension abgesiebt und PEMs/ml PCV werden, wie in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt.
Die Verwendung von Vibromischern führt zu größeren Anzahlen von PEMs pro Volumeneinheit (Tabelle 2; 1).
Tabelle 2
Beispiel 14: Multiplikation der PEM-Biomasse in Vibromischerbioreaktoren
2 × 8 ml PCV werden auf Gurken-PEM-Suspensionskulturen, die wie in Beispiel 3 beschrieben subkultiviert wurden, gewonnen und in zwei Vibromischerbioreaktoren (Applikon Dependable Instruments B. V.), die zwei 2 1 Bioreaktoren, die mit im Handel von Chemap AG erhältlichen Vibromischern ausgestattet sind, inokuliert. Ein Bioreaktor enthält 1 1 Medium A (Tabelle 1), das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, der andere enthält auch 1 1 Medium A, das, wie vorstehend supplementiert ist, ausgenommen, daß die Saccharosekonzentration 55 g/l beträgt. Luft wird in die Vibromischerreaktoren über eine poröse 15 μm Beschickungsvorrichtung, die am Ende des Vibratorschafts in der Nähe des Bodens der Reaktorkammer lokalisiert ist, eingeleitet. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird zu 97% nach Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt. Die Vibromischer werden mit einer Frequenz von 50 Hz und einer maximalen Amplitude von + 6 mm betrieben. Die Vibromischer werden so positioniert, daß die Vibrationsbewegung in der vertikalen Ebene stattfindet, während die laterale oder horizontale Bewegung minimal gehalten wird. Rührscheiben werden an dem Ende des Vibrationsschafts angebracht, so daß die Flüssigkeit in einer Strömungsschleife fließt, die die Zellsuspension von der Peripherie des Reaktorgefäßes in Richtung Boden und dann aufwärts zieht.
6 Tage nach der Inokulation wird die Verdopplungszeit bestimmt. Die PEMs werden von der PEM-Suspension abgesiebt, und PEMs/ml PCV werden, wie in Beispiel 5, bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Beispiel 15: Vergleich der Lebensfähigkeit der PEMs im Verlauf der Zeit aus gerührten Bioreaktoren gegenüber Vibromischerbioreaktoren.
3 × 8 ml PVC werden aus Gurken-PEM-Suspensionskulturen, die, wie in Beispiel 5 beschrieben, subkultiviert wurden, gewonnen und in 3 Bioreaktoren (Applikon Dependable Instruments B. V.), umfassend einen herkömmlichen 2 1 Bioreaktor, der mit einem Schnellrührer ausgestattet ist, der 1 1 Medium A (Tabelle 1) enthält, das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist, und zwei Bioreaktoren, die mit Vibromischern, die im Handel von Chemap AG erhältlich sind, ausgestattet sind, wobei einer 1 1 Medium A, das wie vorstehend supplementiert ist, und der andere auch 1 1 Medium A, das wie vorstehend supplementiert ist, ausgenommen, daß die Saccharosekonzentration 55 g/l beträgt, inokuliert.
Luft wird in den Vibromischerreaktor über eine poröse 15 μm-Beschickungsvorrichtung, die am Ende des Vibratorschafts angebracht ist, an den Boden der Reaktorkammer geleitet. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Vibromischerreaktor wird zu 97% nach auf dem Fachgebiet bekannten Standardtechniken bestimmt. Der Vibromischer wird mit einer Frequenz von 50 Hz und einer maximalen Amplitude von + 6 mm betrieben. Der Vibromischer wird so positioniert, daß die Vibrationsbewegung in der vertikalen Ebene erfolgt, und die horizontale Vibrationsbewegung wird minimal gehalten. Die Rührscheibe wird am Ende des Vibrationsschafts so angebracht, daß die Flüssigkeit in einer Strömungsschleife fließt, die die Zellsuspension von der Peripherie des Reaktorgefäßes zum Boden und dann aufwärts zieht.
Luft wird in den herkömmlichen Bioreaktor am Boden des Bioreaktors über ein Beschickungsrohr, das mit einer porösen 15 μm-Perlvorrichtung versehen ist, geleitet. Die Konzentration an aufgelöstem Sauerstoff wird wie vorstehend zu einer Konzentration von 97% bestimmt. Die Rührgeschwindigkeit des Schnellrührers wird bei etwa 150 UpM + 50 UpM gehalten.
PEMs/ml PCV wird zu Beginn der Züchtung bestimmt, und die Verdopplungszeit wird 6 und 14 Tage später, wie in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Anzahl der PEMs in einem gerührten Bioreaktor signifikant im Verlauf der Zeit abnimmt, wohingegen die Anzahl der PEMs in einem Vibromischer im Verlauf der Zeit bei einer Saccharosekonzentration von 20 g/l fast konstant bleibt. Die PEM-Zahlen zeigen eine Zunahme von bis zu 3fach innerhalb von 6 Tagen bei einer Saccharosekonzentration von 55 g/l (Tabelle 4).
Tabelle 4
Beispiel 16: Entwicklung von PEMs zu somatischen Embryos im Torpedostadium in Bioreaktoren
2 × 100.000 gesiebte PEMs werden aus Gurken-PEM-Suspensionskulturen, die, wie in Beispiel 15 beschrieben, (55 g/l Saccharose in vb/97% OD2) subkultiviert wurden, gewonnen und in zwei Bioreaktoren (Applikon Dependable Instruments B. V.), umfassend einen herkömmlichen 2 1 Bioreaktor, der mit einem Schnellrührer ausgestattet ist und einen mit einem Vibromischer ausgestatteten Bioreaktor, der im Handel erhältlich ist von Chemap AG, die jeweils 1 1 MS-Medium, das 20 g/l Saccharose und ABA in einer Konzentration von 5,0 μM enthalten, inokuliert. Sauerstoff wird in den Vibromischerreaktor über eine poröse 15 μm Beschickungsvorrichtung, die am Ende des Vibratorschafts lokalisiert ist, der in der Nähe des Bodens der Reaktorkammer angebracht ist, eingeleitet. Die Sauerstoffkonzentration in dem Vibromischerreaktor wird zu 97% nach auf dem Fachgebiet bekannten Standardtechniken bestimmt. Der Vibromischer wird mit einer Frequenz von 50 Hz und einer Maximalamplitude von + 6 mm betrieben. Der Vibromischer wird so positioniert, daß die Vibrationsbewegung in der vertikalen Ebene erfolgt und die horizontale Bewegung wird minimal gehalten. Die Rührscheibe wird an einem Ende des Vibrationsschafts so angebracht, daß die Flüssigkeit in einer Strömungsschleife fließt, die die PEMs von der Peripherie des Reaktorgefäßes in Richtung Boden und dann nach oben zieht.
Sauerstoff wird in den herkömmlichen Bioreaktor am Boden des Bioreaktors über ein Beschickungsrohr, das mit einer porösen 15 μm Beschickungsvorrichtung ausgestattet ist, eingeleitet. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird wie vorstehend bei einer Ausgangskonzentration von 97% bestimmt und im Verlauf von 7 Tagen auf 30% + 5% absinken gelassen. Am Tag 8 wird die Konzentration an aufgelöstem Sauerstoff auf 97% wieder eingestellt und bei diesem Gehalt gehalten. Die Rührgeschwindigkeit des Rührers wird bei etwa 190 UpM + 5 UpM gehalten.
Der herkömmliche Bioreaktor besitzt eine PEM mit einer Entwickungseffizienz zu einem voll ausgewachsenen, verwendbaren, somatischen Embryo im Torpedostadium zwischen 10 und 15%. Der Vibromischerbioreaktor besitzt eine PEM mit einer Entwicklungseffizienz zu einem voll ausgewachsenen, verwendbaren, somatischen Embryo im Torpedostadium von mehr als 20%. Verwendbare somatische Embryos im Torpedostadium sind diejenigen, die zu normal aussehenden Pflanzen führen.
Beispiel 17: Morphologische Stabilität der von somatischen Embryos abgeleiteten Cyclamenpflanzen
Somatische Cyclamenembryos, die aus dem F1-Hybrid von Beispiel 2 abgeleitet sind, werden in Schößlinge durch Pflanzen der somatischen Embryos in Blumenerde umgewandelt. Nach der Bildung des ersten Blattes werden die Schößlinge in das Treibhaus überführt und bis zur Reife gezüchtet. Die Pflanzen werden bis zum Blütenstadium gezüchtet. Die Morphologische Untersuchung der blühenden Pflanzen zeigt keine Abnormalitäten bei den Pflanzen. Keine somaclonale Variation infolge genetischer Differenzen wird bei den Pflanzen beobachtet.
Beispiel 18: Genetische somaclonale Variation bei von somatischen Embryos abgeleiteten Gurkenpflanzen
Somatische Embryos von Beispiel 6, die von hybriden F1-Pflanzen abgeleitet sind, werden in Pflanzen in Sorbarod-Stutzen (Baumgartner Papier, Schweiz) umgewandelt und zu fruchttragenden Pflanzen gezüchtet. Der Ploidiegrad wird nach dem Verfahren von De Laat A. A. et al. a. a. O. an 80 Pflanzen bestimmt. Alle Pflanzen besitzen den gleichen Ploidiegrad, und Unterschiede infolge der genetischen somaclonalen Variation werden nicht beobachtet.
Beispiel 19: Umwandlung von somatischen Gurkenembryos in Pflanzen
Gurken-PEMs werden in Bioreaktoren, die mit Vibromischern mit niedrigen Intensitäten ausgestattet sind, multipliziert, gesiebt (100 bis 150 μm) und in Erlenmeyer-Kolben in einer Dichte von 5000 PEMs/50 ml MS-Medium, das mit 20 g/l-Saccharose und 5 μM ABA supplementiert ist, inokuliert. Die PEMs werden in zwei (2) Chargen aufgeteilt, die weiter im Licht und im Dunkeln zu somatischen Embryos entwickelt werden.
Somatische Embryos aus beiden Chargen werden im Licht in Pflanzen umgewandelt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Umwandlungseffizienz aus somatischen Embryos in Pflanzen bei somatischen Embryos, die von PEMs, die im Dunkeln gezüchtet wurden, abgeleitet sind, höher ist als bei somatischen Embryos, die im Licht entwickelt wurden (Tabelle 5). Tabelle 5

Lichtbedingung Gesamtumwandlungsrate von Torpedo in Pflanze (%)

Licht 28,6 Dunkel 62,7
Beispiel 20: Die PEM-Aggregatgröße, bezogen auf die Bildung von einzelnen Torpedos, die zur Umwandlung in Pflanzen geeignet sind.
Die 9 Tage alte PEM-Suspension, die gemäß vorstehendem Beispiel 5 unter Verwendung eines Mediums, das mit 10 mg/l 2,4-D und 0,5 mg/l Kinetin supplementiert ist (bei einer PEM-Konzentration von 50 ml PCV/l), erhalten wurde, wird auf Nylonsieben in drei getrennten Ereignissen gesiebt, um PEM-Fraktionen mit drei verschiedenen Größen zu erhalten: 100 bis 150 μm, 150 bis 200 μm und 200 μm bis 250 μm. Die Embryoentwicklung wird bei anfänglichen PEM-Konzentrationen von etwa 25 bis 50 PEMs/ml in MS-Medium, das 3 μM ABA enthält, durchgeführt. Nach 9tägiger Entwicklung der Kultur wird die Anzahl der Embryos im Torpedostadium unter dem Lichtmikroskop bewertet. Die Anzahl der einzelnen Torpedos wird, bezogen auf die Anzahl der Multitorpedos, bewertet.
Das Torpedo/PEM-Verhältnis beträgt 5 bis 15%. Die Fraktion mit einer Größe < 100 μm enthält keine PEMs. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

Größe der Siebfraktion (μm) % einzelner Torpedos als Prozentsatz der gesamten

100–150 85

150–200 20

200–150 5
Die einzelnen Embryos werden aus der Fraktion mit einer Größe von 100 bis 150 μm manuell abgetrennt und in einzelne Pflanzen umgewandelt.

Claims

Verfahren zum Erhalt somatischer Embryos in Suspensionskultur, umfassend i) Züchtung eines Nicht-Daucus-Nicht-Kallus-Explantatmaterials in Kontakt mit einem flüssigen Pflanzengewebskulturmedium, umfassend eine effektive Menge eines Auxins oder eines Gemisches aus Auxinen, die ausreicht, die Induktion der Bildung einer proembryogenen Masse (PEM) zu fördern, ii) Multiplikation der Anzahl der in i) erhaltenen PEMs durch Züchten der PEMs in Kontakt mit einem geeigneten auxinhaltigen flüssigen Medium; iii) Gewinnen der in ii) erhaltenen PEMs und Inkontaktbringen dieser mit einem im wesentlichen auxinfreien flüssigen Medium, um die Bildung eines somatischen Embryos zu induzieren; und iv) Gewinnen der somatischen Embryos, die aus den induduzierten Embryos von Stufe iii) hervorgehen, wobei die somatischen Embryos den gleichen Ploidiegrad wie das Nicht-Kallus-Explantatmaterial in der Suspensionskultur besitzen.
Verfahren nach Anspruch 1 umfassend die Verwendung von PEMs einer Fraktion ausgewählter Größe, die reich an lebensfähigen PEMs sind, in Stufe iii).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Flüssigmedium weiter eine Kohlenhydratenergiequelle in einer Konzentration zwischen etwa 15 g/l und 90 g/l umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration der Kohlenhydratenergiequelle zwischen etwa 20 g/l und 60 g/l liegt.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Kohlenhydratenergiequelle aus der Gruppe Saccharose, Glukose und Raffinose ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Auxin enthaltende PEM-Suspension in einem Vibromischer vibriert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Vibromischer im wesentlichen in der vertikalen Ebene vibriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Nicht-Kallus-Explantatmaterial von Protoplasten, Stamm, Blättern, Blütenblättern, Hypocotylabschnitt, Apicalmeristemen, zygotischem Embryo per se, Keimling, Gefäßbündel, Pericycle, Ovarien und Antherenfilament abgeleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Nicht-Kallus-Explantatmaterial dicotyl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Nicht-Kallus-Explantatmaterial monocotyl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Ploidiegrad diploid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Ploidiegrad tetraploid ist.
Verwendung eines PEMs, produziert nach Anspruch 1, zur Etablierung somatischer Embryosuspensionskulturen, umfassend somatische Embryos, die bezüglich des Ploidiegrads gleichförmig sind, indem die PEMs in ein im wesentlichen auxinfreies Pflanzengewebskulturmedium eingebracht werden.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Suspensionskultur diploide somatische Embryos umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Suspensionskultur tetraploide somatische Embryos umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Suspensionskultur somatische Embryos umfaßt, die von PEMs abgeleitet sind, die von dicotylem oder monocotylem Nicht-Kallus-Explantatmaterial erzeugt wurden.
Verfahren zur Produktion einer Pflanze, umfassend die Züchtung eines somatischen Embryos, der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erhalten wurde, zu einer Pflanze, die genetisch ausgedrückt, mit dem zellulären Explantatprogenitormaterial, aus dem er abgeleitet ist, identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die somatischen Embryos aus der Gruppe, umfassend Cyclamen, Cucurbita, Lycopersicon, Allium, Begonia, Beta, Primula, Brassica, Capsicum, Cichorium, Gerbera, Impatiens, Lactuca, Oryza, Pelagonium, Petunia, Viola und Zea, ausgewählt werden.