CN105104183B - 一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物原生质体培养领域，具体涉及一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导。该方法将二倍体菊苣培养材料进行酶解、纯化、诱导、细胞团和小愈伤组织培养、愈伤组织繁殖和胚状体诱导、分化，得到再生芽。本发明利用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导处理，且每个步骤、各个参数之间协同作用，四倍体植株再生率较高；远高于采用原生质体融合方法诱导。
Description
技术领域
本发明属于植物原生质体培养领域，具体涉及一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。
背景技术
菊苣(Cichorium intybus L.)属于菊科，是多年生草本植物，为食、药及饲料三用作物，其根部含有丰富的菊粉、低聚及超高果糖，对人体健康十分有益,亦可深加工成为低热量的保健食品和咖啡替代品；软化菊苣可作鲜食用高档蔬菜；此外，菊苣还是一种高产优质牧草。
菊苣原产欧洲，于20世纪80年代初引进中国，开始了大面积试种和快速推广，具有良好的发展潜力。但是，菊苣的育种在国内基本处于空白，现用的品种几乎全部从国外引进，而这些国外品种在适应性和抗性等重要农艺性状上表现较差，必须加以改良。所以，我们迫切需要开展自己的育种工作，培育出更适合中国种植条件的，具有知识产权的菊苣新品种。
原生质体融合(即体细胞杂交)是比较实用的生物技术之一，可以用于常规育种方法无法完成的种间或属间远源杂交，获取更大的杂种优势，引进优秀的农艺性状(例如：适应性，抗病性，抗逆性等)，培育菊苣新品种或育种材料，丰富种质资源。原生质体培育是实施体细胞杂交的前提和基础，而菊苣的原生质体培育技术体系在国内尚未建立；虽然国外已有菊苣原生质体培育及融合等方面的报道(Rambaud 1996)，但无论在培养效率上，还是在技术内容及方法的实用性上，都需要加以改进和提高，才能加快我国的菊苣育种，尽快地培养出具有中国特色的新品种。
多倍体的离体诱导技术对菊苣的育种及改良十分有益，四倍体或三倍体等植株具有营养体“巨型性”的特点，可以大幅度提高其收获器官——块根的产量(增产30-50％)，同时还可提高菊苣有效成分的含量(如菊粉糖等)，以及改善抗病性、抗逆性和适应性。国内常规的菊苣多倍体诱导方法，通常是运用秋水仙素等化学药剂处理菊苣的器官，组织，愈伤组织或多细胞团，得到的多倍体植株往往伴有混倍体和嵌合体，需要反复多次的继代，分离培养，才能筛选出纯合的多倍体植株，其过程不但费工费时，而且纯合多倍体的诱导频率不高。国外利用原生质体融合技术，诱导出了菊苣四倍体，但是其四倍体的诱导频率低(Rambaud等，1996)。
因此，植物外植体培养领域的科研和实践中，需要一种利用菊苣原生质体培养，结合秋水仙素处理，能够一次性获得高效的纯合四倍体的诱导方法。
发明内容
本发明提供一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，包括如下步骤：
酶解步骤：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液；
纯化步骤：将所述原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得到纯化后的原生质体；
诱导步骤：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得到加倍后的原生质体；
细胞团和小愈伤组织培养步骤：将所述加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1进行清洗处理，再用原生质体培养基JY2进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织；
愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将所述细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3培养基进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；
分化步骤：将所述愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生芽。
上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液包括：质量百分比浓度为0.1-1.0％、优选为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.1-1.0％、优选为0.2％的果胶酶。
上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液中还包括：10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇，质量百分比浓度为0.05-0.2％的2-(N-吗啉)乙磺酸。
上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解处理的时间为5-6小时，优选为5.5小时。
上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，含有质量浓度百分比为0.1-1％，优选为0.1-0.5％，更优选为0.3％的秋水仙素。
上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，还含有10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4和质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇。
上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述诱导处理的时间为1-12小时，优选为1-5小时，更优选为3小时。
上述方法的优选的实施方式中，所述细胞团和小愈伤组织培养步骤中，所述包埋培养中，将固化后的原生质体薄层于24-28℃，优选为26℃，无光照培养2-3周。
上述方法的优选的实施方式中，所述愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤中，所述诱导培养中，温度为24-28℃，优选为24℃，光周期为10小时光照/天，光照强度为800-1200LUX，优选为1000LUX。
上述方法的优选的实施方式中，所述分化步骤中，所述分化培养中，温度为24-28℃，优选为24℃，光周期为16小时光照/天，光照强度为2000-3000LUX，优选为2500LUX。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导处理，且每个步骤、各个参数之间协同作用，四倍体植株再生率较高；远高于采用原生质体融合方法诱导。
2、本发明采用的是单细胞加倍法，菊苣纯合四倍体是利用秋水仙素短时间处理单个原生质体，最后形成的再生植株由加倍的原生质体起源的，经过离体培养，一次性形成的多倍体植株。
3、本发明相比原生质体融合加倍法，具有的优点为：诱导多倍体植株的倍性可控性高，排除了原生质体融合加倍法产生6倍体及8倍体植株的可能性；由二倍体菊苣原生质体再生的混倍体植株率和嵌合体植株率均为零，排除了组织加倍法所必需的多期继代，筛选和纯化四倍体植株的繁琐培养过程。
附图说明
图1为试验例3中，采用2种不同的诱导方法对菊苣原生质体加倍处理后，四倍体植株再生率柱状图。
具体实施方式
一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，包括如下步骤：
步骤一、酶解：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液。
具体的操作为：
(1)酶解处理：取7-14日龄、二倍体菊苣种子的无菌苗的叶片、或生长健壮的组培苗的叶片，纵切成为2-3毫米的细条，除去叶片的中央主脉及边缘，放入酶解液中，叶片与酶解液的质量体积比为1克：10毫升，置于黑暗条件下于30-34℃，优选为32℃，酶解5-6小时，优选为5.5小时，得到酶解产物；
示例性地，上述酶解处理的温度可以为30℃、31℃、33℃、34℃中的任意值或任意二者之间的范围；上述酶解处理的时间可以为5.1h、5.5h、5.6h、5.8h、6h中的任意值或任意二者之间的范围；
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.1-1.0％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.1-1.0％的果胶酶，10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇，质量百分比浓度为0.05-0.2％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)；该酶解液以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌；
示例性地，上述酶解液中的纤维素酶R-10的质量百分比浓度可以为0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％中的任意值或任意二者之间的范围；果胶酶的质量百分比浓度可以为0.1、0.3％、0.5％、0.8％、1％中的任意值或任意二者之间的范围。
(2)收集处理：将酶解产物经过200目和400目的不锈钢筛的过滤，再加入CPW洗液，洗出残留在培养皿中的酶解产物，再用400目的不锈钢筛过滤；再收集全部过滤后的原生质体及CPW洗液，在500-1000rpm下离心8分钟，弃上清，收集原生质体，得到原生质体悬液。
步骤二、纯化：将原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得到纯化后的原生质体。
具体的操作为：
(1)清洗处理：向原生质体悬液中缓慢加入CPW洗液，在750rpm下离心8分钟，保留沉淀；此过程重复2次，即离心清洗2次，得到清洗后的原生质体；
上述的每次离心处理中，转速为750rpm，时间为8分钟，再使用玻璃吸管弃除上清液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液；
(2)纯化处理：取相等体积的22％的蔗糖溶液和清洗后的原生质体，在1500rpm下离心15分钟；于离心管中部的分层部位，收集原生质体带；再向收集到的原生质体中添加CPW液重新悬浮，在750rpm下离心8分钟，洗除蔗糖残液，得到纯化后的原生质体。
步骤三、诱导：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得到加倍后的原生质体。
具体的操作为：
(1)将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液；每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.1-1％，优选为0.1-0.5％，更优选为0.3％的秋水仙素之外，还含有10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4和质量百分比浓度为8-12％的甘露醇；该加倍液的pH值为5.8，以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌；
示例性地，上述秋水仙素的质量百分比浓度可以为0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％中的任意值或任意二者之间的范围。
(2)加倍处理：将密封在容器中的混合悬液置于转速为20-25rpm摇床上，振荡培养原生质体1-12小时(优选为1-5小时，更优选为3小时)，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照；
示例性地，上述加倍处理时间可以为1h、4h、6h、7h、8h、10h、12h中的任意值或任意二者之间的范围。
(3)向加倍混合悬液中添加CPW洗液，进行3次离心处理，得到加倍后的原生质体；
上述的每次离心处理中，转速为750rpm，时间为8分钟，再使用玻璃吸管弃除上清液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液。
本步骤利用秋水仙素短时间处理单个原生质体，最后形成的植株是由加倍的原生质体起源的，经过离体培养，一次性形成的多倍体植株。
步骤四、细胞团和小愈伤组织培养：将加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1进行清洗处理，再用JY2液体培养基进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织。
具体的操作为：
(1)清洗处理：向加倍后的原生质体中加入等体积的原生质体培养基YJ1，于转速750rpm离心8分钟，保留沉淀，再向沉淀中加入原生质体培养基YJ1，得到原生质体YJ1悬液；再将该悬液中的原生质体的培养密度调整为60000个/ml。
(2)包埋处理：在35℃预加热融化原生质体培养基JY2，再于30℃吸取密度为60000个/ml的原生质体YJ1悬液，按照1：1的体积比与原生质体培养基JY2混合，摇匀后迅速转入培养皿，在其中央平摊成为圆状的原生质体薄层。
(4)培养：将原生质体薄层在4℃下冷处理2小时，待原生质体在低熔点琼脂糖的薄层中完全固化后，再添加原生质体培养基YJ1，环绕于原生质体薄层的四周，最后用密封培养皿，置于24-28℃，优选为26℃，无光照培养2-3周，每周更换环绕的原生质体培养基YJ1，得到细胞团和小愈伤组织；
示例性地，上述密封培养皿的培养温度为24℃、25℃、27℃、28℃中的任意值或任意二者之间的范围。
步骤五、愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；
上述诱导培养的条件为：温度为24-28℃，优选为24℃，光周期为10小时光照/天，光照强度为800-1200LUX，优选为1000LUX，时间为3-5周；
示例性地，上述诱导培养温度为25℃、26℃、27℃、28℃中的任意值或任意二者之间的范围，上述光照强度为800LUX、900LUX、1050LUX、1100LUX、1200LUX中的任意值或任意二者之间的范围。
步骤六、分化：将愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生芽。
具体的操作为：
挑选直径大于或等于0.5cm的愈伤组织和胚状体，移至分化培养基JY4上进行器官分化和植株再生培养，培养条件为：温度为24-28℃，优选为24℃，光周期为16小时光照/天，光照强度为2000-3000LUX，优选为2500LUX；
待分化出的再生芽长至2-3cm高后，剪取1-2cm新叶片段，利用流细胞分析仪鉴定其倍性水平；
示例性地，上述诱导培养温度为25℃、26℃、27℃、28℃中的任意值或任意二者之间的范围，上述光照强度为2000LUX、2200LUX、2400LUX、2600LUX、2800LUX、3000LUX中的任意值或任意二者之间的范围。
步骤七、生根：将再生芽于生根培养基进行生根培养，得到带有根的再生芽，继续培养得到再生植株。
具体的操作为：
将鉴定为四倍体的再生芽转移到生根培养基上诱导形成根系，生根培养的条件为：温度为22℃，光周期为16小时光照/天，光照强度3000LUX。
上述CPW洗液包括：
1480mg/L CaCl2-2H2O，27.2mg/L KH2PO4，101.0mg/L KNO3，246mg/L MgSO4-7H20，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4-5H20和10％甘露醇，pH5.8；CPW洗液可以用高压灭菌，也可以过滤灭菌，以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌为优选。
上述原生质体培养基YJ1包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：168mg/L,MgSO4-7H2O：185mg/L,CaCl2-2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4-7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4-H2O：0.0758mg/L,CuSO4-5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2-6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4-7H2O：27.8mg/L；肌醇：150mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：10000g/L,甘露醇：90000g/L；萘乙酸：0.5mg/L,TDZ：1mg/L；
原生质体培养基YJ1的pH为5.6，采用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。
上述原生质体培养基JY2包括：
KNO3：1900mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4-7H2O：370mg/L,CaCl2-2H2O：880mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4-7H2O：2mg/L,H3BO3：2mg/L,MnSO4-H2O：0.1516mg/L,CuSO4-5H2O：0.06mg/L,AlCl3：0.06mg/L,NiCl2-6H2O：0.06mg/L,KI：0.02mg/L；Na-EDTA：74.6mg/L,FeSO4-7H2O：55.6mg/L；肌醇：300mg/L,VB1：20mg/L,VB6：2mg/L,VB5：2mg/L,烟酸：2mg/L,生物素：0.02mg/L,蔗糖：20000g/L,甘露醇：180000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：2mg/L；另外添加0.8％低熔点琼脂糖；
原生质体培养基JY2的pH值为5.6；其中，除低熔点琼脂糖采用高压灭菌外，全部成分采用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌；0.8％低熔点琼脂糖在高压灭菌锅内，121℃下，灭菌20分钟后，冷却至60℃，与JY2的其他成分混合，待用。
上述原生质体培养基YJ3包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4-7H2O：185mg/L,CaCl2-2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4-7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4-H2O：0.0758mg/L,CuSO4-5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2-6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4-7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：5000g/L,甘露醇：50000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：1.5mg/L；Gelrite：4000mg/L；
原生质体培养基YJ3的pH值为5.6，采用0.45μm微孔滤膜过滤灭菌或高压灭菌，过滤灭菌为优先。
上述分化培养基JY4包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：504mg/L,MgSO4-7H2O：185mg/L,CaCl2-2H2O：440mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4-7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4-H2O：0.0758mg/L,CuSO4-5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2-6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4-7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：1mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：0.5mg/L,蔗糖：20000g/L,TDZ：0.15mg/L；Gelrite：4000mg/L；
分化培养基JY4的pH值为5.8，采用0.45μm微孔滤膜过滤灭菌或高压灭菌，过滤灭菌为优先。
上述生根培养基为1/2MS+0.3毫克/升IBA+0.2％活性碳，在高压灭菌锅内，121℃下，灭菌20分钟后备用。
上述方法利用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导处理，且每个步骤、各个参数之间协同作用，四倍体植株再生率较高；远高于采用原生质体融合方法诱导。上述方法相比原生质体融合加倍法，具有的优点为：诱导多倍体植株的倍性可控性高，排除了原生质体融合加倍法产生6倍体及8倍体植株的可能性；
由二倍体菊苣原生质体再生的混倍体植株率和嵌合体植株率均为零，排除了组织加倍法所必需的多期继代，筛选和纯化四倍体植株的繁琐培养过程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取材：取7-14日龄、二倍体菊苣种子的无菌苗叶片、或生长健壮的组培苗叶片，纵切成为2-3毫米的细条，除去叶片的中央主脉及边缘，作为培养材料。
(2)酶解：将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：酶解反应结束后，在倒置显微镜下，利用“血球计数板”统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)收集：将酶解产物经过200目和400目的不锈钢筛的过滤，再加入2毫升CPW洗液，洗出残留在培养皿中的酶解产物，再用400目的不锈钢筛过滤；再用玻璃吸管收集全部过滤的原生质体及CPW洗液，并移至15毫升的无菌离心管中，密封离心管，在500-1000rpm下离心8分钟，收集原生质体，得到原生质体悬液。
(5)清洗：采用吸管沿离心管壁，向原生质体悬液中缓慢加入10毫升无菌CPW洗液，在750rpm下离心8分钟，用玻璃吸管弃除上清液及细胞碎片；此过程重复2次，即离心清洗2次，得到清洗后的原生质体。
(6)纯化：取5毫升22％的蔗糖溶液和5毫升的清洗后的原生质体，在1500rpm下离心15分钟；于离心管中部的分层部位，收集原生质体带；再向收集到的原生质体中添加10毫升的无菌CPW液重新悬浮，在750rpm下离心8分钟，洗除蔗糖残液，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.3％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，振荡培养原生质体3小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)清洗：将加倍混合悬液重新装入15毫升无菌离心管，添加5毫升CPW洗液，进行3次离心处理，得到加倍后的原生质体。
(10)悬液制备：向加倍后的原生质体中加入10毫升的原生质体培养基YJ1，于转速750rpm离心8分钟，保留沉淀，再向沉淀中加入3ml的原生质体培养基YJ1，得到原生质体YJ1悬液。
(11)调整密度：换用无菌玻璃吸管，吸取0.1毫升的原生质体YJ1悬液，在放大400倍的倒置显微镜下，利用“血球计数板”统计原生质体数量，以5次重复的平均数为依据计算原生质体的密度；根据统计结果，用原生质体培养基YJ1将原生质体的培养密度调整为60000个/ml。
(12)包埋：在35℃水浴锅中预加热融化原生质体培养基JY2；再将水浴锅温度调至30℃，用玻璃吸管吸取2ml的密度为60000个/ml的原生质体YJ1悬液与2ml的原生质体培养基JY2混合，摇匀后迅速转入直径10厘米的玻璃培养皿，在其中央平摊成为圆状的原生质体薄层。
(13)培养：将原生质体薄层在4℃下冷处理2小时，待原生质体在低熔点琼脂糖的薄层中完全固化后，再添加6-8毫升的原生质体培养基YJ1，环绕于原生质体薄层的四周，最后用Parafilm封口膜密封培养皿，置于26℃，无光照培养2-3周，每周更换环绕的原生质体培养基YJ1，得到细胞团和小愈伤组织。
(14)愈伤组织繁殖和胚状体诱导：将细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；培养条件为：温度为24℃，光周期为10小时光照/天，光照强度为1000LUX，时间为3-5周。
(15)分化：挑选直径大于或等于0.5cm的愈伤组织和胚状体，移至分化培养基JY4上进行器官分化和植株再生培养，得到再生芽；培养条件为：温度为24℃，光周期为16小时光照/天，光照强度2500LUX。
(16)鉴定倍性：待分化出的再生芽长至2-3cm高后，剪取1-2cm新叶片段，利用流细胞分析仪鉴定其倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到67.2％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为50.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为47.7％，破损率为24.4％。
(17)生根：将鉴定为四倍体的再生芽转移到生根培养基上诱导形成根系，生根培养的条件为：温度为22℃，光周期为16小时光照/天，光照强度3000LUX。
实施例2
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.3％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体2小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到62.9％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为52.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为49.9％，破损率为22.6％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例3
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.25％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.3％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体4小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到50.4％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为48.6％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为44.8％，破损率为27.9％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例4
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.5％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体2小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到60.3％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为58.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为48.2％，破损率为25.1％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例5
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.5％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体3小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到54.5％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为50.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为46％，破损率为31％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例6
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.5％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体4小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到46.2％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为44.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为31％，破损率为15％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例7
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.4％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体2小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到57.6％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为52.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为45.8％，破损率为26.3％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例8
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.4％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体3小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到55.1％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为50.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为43％，破损率为32％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例9
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.4％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体4小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到48％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为45.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为46％，破损率为30％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例10
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.45％的秋水仙素之外，还含有10mM CaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体2小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到59.6％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为55.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为48％，破损率为25.5％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例11
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.45％的秋水仙素之外，还含有10mM CaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体3小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到53.8％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为50.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为47％，破损率为36％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例12
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解5.5小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.2％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.2％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体4小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到33.9％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为31.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为52.8％，破损率为19.7％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例13
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解6小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.2％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.3％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.2％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体8小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到41.4％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为37.5％；
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为42.7％，破损率为30.5％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
实施例14
(1)取材：参照实施例1中步骤(1)的方法操作，得到培养材料；
(2)酶解：再将培养材料放入装有酶解液的培养皿中，叶片与酶处理液的质量体积比为1克：10毫升，培养皿用Parafilm膜密封；将该培养皿置于黑暗条件下于32℃，酶解6小时，得到酶解产物。
上述酶解液包括：质量百分比浓度为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.3％的果胶酶，10mM的CaCl2.2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为10％的甘露醇，质量百分比浓度为0.1％的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，以0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
在酶解过程中，每隔20分钟，手动轻轻摇晃培养皿10秒钟，以加快酶解反应；每隔60分钟，将培养皿移至倒置显微镜下，观察原生质体的酶解进度。
(3)统计：参照实施例1中步骤(3)的方法操作，统计原生质体的产量，破损率及生存率。
(4)-(6)：参照实施例1中步骤(4)-(6)的方法操作，得到纯化后的原生质体。
(7)加入加倍液：将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液，每毫升该混合悬液中包含60000个原生质体；再用玻璃吸管将混合移入无菌培养皿中，密封。
秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0.2％的秋水仙素之外，还含有10mMCaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH5.8；以0.45μm微孔滤膜过滤灭菌。
(8)加倍：将培养皿置于转速为20-25rpm摇床上，加倍处理原生质体12小时，诱导染色体加倍，得到加倍混合悬液；加倍处理的外界条件为温度25℃，无光照。
(9)-(15)：参照实施例1中步骤(9)-(15)的方法操作，得到再生芽。
(16)鉴定倍性：参照实施例1中步骤(16)的方法操作，鉴定再生芽的倍性水平。
重复操作步骤(1)-(16)共5次，四倍体植株再生率最高可达到49.9％；5次的平均结果为，四倍体植株再生率为46.5％。
5次操作中，步骤(3)达到的平均结果为：生存率为35.1％，破损率为32.9％。
(17)生根：参照实施例1中步骤(17)的方法操作，将再生芽诱导形成根系，得到再生植株。
试验例1：
本试验例是酶解步骤中，比较酶解液中不同酶配比、不同加酶解时间，对菊苣叶片原生质体分离的影响。
一、4种不同酶解液的成分及酶解结果。
参照实施例1中步骤(1)-(3)的操作方法，将表1中的成分配比的酶解液用于酶解培养材料。
表1：
注：4种酶解液均附加10mM CaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇，pH为5.4，均用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌；得到的酶解产物用FDA(荧光素双醋酸酯)处理后，统计原生质体的生存率及破损率；每个酶解处理设置5次重复。
从表1的实验结果可以看出，采用0.25％纤维素酶+0.20％果胶酶和0.30％纤维素酶+0.30％果胶酶等2种酶液组合，获得的原生质体产量最高，尤其是前者的原生质体生存率亦高，破损率较低，从这三项实验结果综合考虑，以0.25％纤维素酶+0.20％果胶酶为最佳酶解液成分，得到的原生质体分离效果最好；0.30％纤维素酶+0.30％果胶酶分离出的原生质体产量虽高，但原生质体破损率亦高，而且原生质体的生存率最低；其余二组酶解液获得的原生质体产量、生存率及破损率均不甚理想，应予淘汰。
二、5种不同酶解时间对原生质体分离效果的影响。
参照实施例1中步骤(1)-(3)的操作方法，比较表2中不同酶解时间对于原生质体分离效果的影响。
表2：
注：酶解液成分为：0.25％纤维素酶，0.20％果胶酶，10mM CaCl2.2H2O，0.7mMKH2PO4，0.1％MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)和10％甘露醇，pH为5.4，以0.22μm微孔滤膜过滤灭菌；用“血球计数板”统计原生质体产量，重复5次；酶解产物用FDA处理后，统计原生质体的生存率及破损率。
上述生存率的计算方式为：
生存率％＝(生存的原生质体数÷酶解得到的原生质体总数)×100％；
上述破损率的计算方式为：
破损率％＝(破损的原生质体数÷酶解得到的原生质体总数)×100％。
表2的实验结果显示：采用0.25％纤维素酶，0.20％果胶酶，10mM CaCl2.2H2O，0.7mM KH2PO4和10％甘露醇的酶解液，处理菊苣叶片5.5小时，可以获得最佳的原生质体分离效果，原生质体的酶解产量高、生存率高、破损率低；1-5小时和6小时等酶解处理，所得到的原生质体的综合酶解效果均比5.5小时差。
试验例2：
本试验例是诱导步骤中，比较秋水仙素加倍液中不同的秋水仙素浓度、不同加倍处理时间，对二倍体菊苣原生质体加倍和四倍体植株的再生频率(即四倍体植株再生率)的影响。
具有高重复性的实验结果表明，参照实施例1中步骤(4)-(12)的操作方法，经过加倍处理后的菊苣原生质体，在步骤(13)中，培养4-5天即开始第一次分裂，5-7天进行连续分裂，8-10天即形成含8-15个细胞的小细胞团，培养12天统计的原生质体分裂率达到12％-34％，平均23％；14-20天形成含30-50个细胞的大细胞团，21-28天即形成肉眼可见的小愈伤组织，植板率％达到3.9％-7.0％，平均5.5％；步骤(14)中，小愈伤组织在原生质体培养基JY3上繁殖和生长很快，经过21-28天培养后，50-60％愈伤组织长成0.5cm或以上的大愈伤组织和胚性愈伤，其中，胚性愈伤或胚状体的频率为47-69％，具有较高的芽分化潜力。
上述原生质体分裂率的计算方式为：
原生质体分裂率％＝(已分裂的原生质体数÷培养的原生质体总数)×100％；
上述植板率的计算方式为：
植板率％＝(已形成的小愈伤组织数÷培养的原生质体总数)×100％。
将这些0.5cm或以上的大愈伤组织和胚状体，转至原生质体培养基JY4上培养14-28天，即再生出小植株，5次重复的实验结果显示，愈伤组织分化率(％＝)为41-62％，平均50.1％。
上述愈伤组织分化率的计算方式为：
愈伤组织分化率％＝(已形成的小植株数÷培养的愈伤组织总数)×100％。
参照实施例1中步骤(4)-(15)的操作方法，比较表3中加倍液中不同秋水仙素浓度、不同加倍处理时间对菊苣原生质体加倍的影响。
二倍体菊苣原生质体加倍的实验结果如表3所示，秋水仙素的使用浓度对菊苣原生质体加倍的影响最大，秋水仙素处理时间的影响次之。
在0.1-0.3％的秋水仙素浓度范围内，四倍体的诱导频率随秋水仙素浓度的提高而增加，当秋水仙素浓度继续提升到0.5％，四倍体植株的再生频率不但没有增加，反而呈小幅度下降趋势，说明浓度过高的秋水仙素对菊苣原生质体的生长和发育有一定的副作用；表3的结果表明，秋水仙素的作用浓度以0.3％为最佳，0.1-0.2％的加倍效果较低，而0.2％的加倍效果优于0.1％；秋水仙素对菊苣原生质体加倍的有效浓度顺序依次为0.3％，0.5％，0.2％，0.1％。
表3的实验结果表明：在较低的浓度范围内(0.1-0.2％)，较长的秋水仙素处理时间有利于四倍体的诱导；在较高的浓度范围内(0.3-0.5％)，2小时的秋水仙素处理时间有利于四倍体的诱导、3小时次之、4小时不太利于四倍体植株的诱导，导致四倍体的再生频率下降、1小时的处理强度不足，加倍效果最低；秋水仙素对菊苣原生质体加倍的有效时间顺序依次为2小时，3小时，4小时，1小时。
综合分析秋水仙素的作用浓度和处理时间对菊苣原生质体加倍的效果，有效的秋水仙素作用浓度和处理时间分别为：0.3％、0.5％、3小时、4小时，首选的组合为秋水仙素作用浓度0.3％+处理时间2小时，由二倍体菊苣原生质体产生的纯合四倍体频率(即四倍体植株再生率)高达67.2％，5次实验的平均加倍率为58.8％；第二可选用的组合为秋水仙素作用浓度0.3％+处理时间3小时。
表3：
表3为5次重复实验的平均结果；上述四倍体植株再生率的计算方式为：
四倍体植株再生率％＝(四倍体植株数÷原生质体再生植株总数)×100％；该四倍体植株数，是指实施例1步骤(16)中鉴定出的步骤(15)中得到的四倍体再生芽的数量；该原生质体再生植株总数，是指步骤(15)中得到的再生芽的总数。
本试验例中获得的四倍体植株均为纯和四倍体植株。
试验例3：
本试验例是比较采用本实施例1的方法、原生质体融合加倍法对菊苣原生质体的诱导后，对于四倍体植株再生的影响。
一、第一种诱导法(即：秋水仙素处理加倍法，参照实施例1的方法操作)。
二、第二种诱导法(即：原生质体融合加倍法)，具体的操作如下：
(1)在无菌培养皿中，利用30％的PEG溶液处理菊苣原生质体1分钟，然后添加高Ca-pH溶液，后处理3分钟，诱导菊苣原生质体之间粘连及融合；该原生质体为参照实施例1的方法(1)-(6)步骤操作得到的纯化后的原生质体。
(2)在随后的12分钟内，每隔1-2分钟，添加21倍体积的CPW洗液，稀释PEG-原生质体的融合产物。
(3)将步骤(2)所得融合产物移入无菌离心管内，在750rpm下离心漂洗3次，再用液体原生质体培养基JY1离心漂洗1次。
(4)参照实施例1的的(11)-(17)步骤，将原生质体用培养基JY1调节为60000个/ml的种植密度，用培养基JY2进行包埋培养，诱导愈伤组织及植株再生，获得的再生植株采用流细胞分析仪鉴定再生植株的倍性水平。
在菊苣纯合四倍体诱导的比较实验中，采用秋水仙素处理原生质体法方法(实施例1中的方法)获得了菊苣四倍体植株的高效再生(参见图1；注：秋水仙素处理加倍法(colchicine)，第一种诱导法；原生质体融合加倍法(fusion)，第二种诱导法。图1中的数据为5次实验的平均结果)，四倍体植株再生率为50.5％，比原生质体融合加倍法的24.7％高2倍多，而且是国内外已报道的菊苣四倍体离体诱导频率中最高的，比Rambaud(1996)利用原生质体融合法获得的24.2％也高2倍多。
上述四倍体植株再生率的计算方式为：
四倍体植株再生率％＝(四倍体植株数÷原生质体再生植株总数)×100％；该四倍体植株数，是指实施例1步骤(16)中鉴定出的步骤(15)中得到的四倍体再生芽的数量；该原生质体再生植株总数，是指步骤(15)中得到的再生芽的总数。
秋水仙素处理原生质体法具有独特的优点，是从单细胞起源的，一次性形成的纯合四倍体，即无嵌合体产生，也无混倍体出现，这是其他方法，例如：种子加倍法、分生组织加倍法(茎尖、根尖、芽尖等)，愈伤组织加倍法、二倍体组织加倍法等，所无法比拟的；
利用秋水仙素处理单一的原生质体，然后从单个加倍的原生质体起源的，经过离体培养，一次性形成的菊苣四倍体植株，其诱导倍性的可控性高，大大降低了原生质体融合加倍法产生6倍体及8倍体植株的可能性；
与原生质体融合加倍法相比，秋水仙素处理原生质体法诱导菊苣四倍体的效率高，实验简单易行，时间短，对菊苣原生质体培养的负作用较小，而且具有进一步提高菊苣四倍体诱导频率的潜力，例如，在试验例2的表3中，0.3％秋水仙素处理3小时，得到的菊苣四倍体诱导率高达67.2％。
综合各种实验参数及技术指标，秋水仙素处理原生质体加倍法是离体诱导菊苣四倍体植株的优选方法。
Claims (17)
1.一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
酶解步骤：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液；
纯化步骤：将所述原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得到纯化后的原生质体；
诱导步骤：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得到加倍后的原生质体；
细胞团和小愈伤组织培养步骤：将所述加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1进行清洗处理，再用原生质体培养基JY2进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织；
愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将所述细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3培养基进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；
分化步骤：将所述愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生芽；
所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，含有质量浓度百分比为0.1-1％的秋水仙素；
所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，还含有10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4和质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇。
所述原生质体培养基YJ1包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：168mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：150mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：10000g/L,甘露醇：90000g/L；萘乙酸：0.5mg/L,TDZ：1mg/L；
所述原生质体培养基JY2包括：
KNO3：1900mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4·7H2O：370mg/L,CaCl2·2H2O：880mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4·7H2O：2mg/L,H3BO3：2mg/L,MnSO4·H2O：0.1516mg/L,CuSO4·5H2O：0.06mg/L,AlCl3：0.06mg/L,NiCl2·6H2O：0.06mg/L,KI：0.02mg/L；Na-EDTA：74.6mg/L,FeSO4·7H2O：55.6mg/L；肌醇：300mg/L,VB1：20mg/L,VB6：2mg/L,VB5：2mg/L,烟酸：2mg/L,生物素：0.02mg/L,蔗糖：20000g/L,甘露醇：180000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：2mg/L；另外添加0.8％低熔点琼脂糖；
所述原生质体培养基YJ3包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：336mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：85mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：10mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：1mg/L,生物素：0.01mg/L,蔗糖：5000g/L,甘露醇：50000g/L；萘乙酸：1mg/L,TDZ：1.5mg/L；Gelrite：4000mg/L；
所述分化培养基JY4包括：
KNO3：950mg/L,NH4NO3：504mg/L,MgSO4·7H2O：185mg/L,CaCl2·2H2O：440mg/L,KH2PO4：170mg/L；ZnSO4·7H2O：1mg/L,H3BO3：1mg/L,MnSO4·H2O：0.0758mg/L,CuSO4·5H2O：0.03mg/L,AlCl3：0.03mg/L,NiCl2·6H2O：0.03mg/L,KI：0.01mg/L；Na-EDTA：37.3mg/L,FeSO4·7H2O：27.8mg/L；肌醇：100mg/L,VB1：1mg/L,VB6：1mg/L,VB5：1mg/L,烟酸：0.5mg/L,蔗糖：20000g/L,TDZ：0.15mg/L；Gelrite：4000mg/L。
2.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：所述秋水仙素的质量浓度百分比为0.1-0.5％。
3.根据权利要求2所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：所述秋水仙素的质量浓度百分比为0.3％。
4.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述酶解步骤中，所述酶解液包括：质量百分比浓度为0.1-1.0％纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.1-1.0％的果胶酶。
5.根据权利要求4所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述纤维素酶R-10的质量百分比浓度为0.25％，所述果胶酶的质量百分比浓度为0.2％。
6.根据权利要求4所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述酶解步骤中，所述酶解液中还包括：10mM的CaCl2·2H2O，0.7mM的KH2PO4，质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇，质量百分比浓度为0.05-0.2％的2-(N-吗啉)乙磺酸。
7.根据权利要求1或4或6所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述酶解步骤中，所述酶解处理的时间为5-6小时。
8.根据权利要求1或4或6所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述酶解步骤中，所述酶解处理的时间为5.5小时。
9.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述诱导步骤中，所述诱导处理的时间为1-12小时。
10.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述诱导步骤中，所述诱导处理的时间为1-5小时。
11.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述诱导步骤中，所述诱导处理的时间为3小时。
12.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述细胞团和小愈伤组织培养步骤中，所述包埋培养中，将固化后的原生质体薄层于24-28℃，无光照培养2-3周。
13.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述细胞团和小愈伤组织培养步骤中，所述包埋培养中，将固化后的原生质体薄层于26℃，无光照培养2-3周。
14.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤中，所述诱导培养中，温度为24-28℃，光周期为10小时光照/天，光照强度为800-1200LUX。
15.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤中，所述诱导培养中，温度为24℃，光周期为10小时光照/天，光照强度为1000LUX。
16.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述分化步骤中，所述分化培养中，温度为24-28℃，光周期为16小时光照/天，光照强度为2000-3000LUX。
17.根据权利要求1所述菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，其特征在于：
所述分化步骤中，所述分化培养中，温度为24℃，光周期为16小时光照/天，光照强度为2500LUX。
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| C. Rambaud et al..The induction of tetraploidy in chicory (Cichorium intybus L . var.Magdebourg) by protoplast fusion.《Euphytica》.1992,第62卷第63-67页，尤其是第63页"Material and methods"部分. * |
| E.Nenz et al..An efficient and rapid procedure for plantlet regeneration from chicory mesophyll protoplasts.《Plant Cell,Tissue and Organ Culture》.2000,第62卷第85-88页，尤其是摘要. * |
| 陈发棣等.菊科植物原生质体研究进展.《西北植物学报》.2005,第25卷(第9期),第1913-1920. * |
| 陶抵辉等.生物多倍体诱导方法研究进展.《生命科学研究》.2007,第11卷(第4期),第6-13页. * |
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