CN110317772A

CN110317772A - 一种大麦小孢子的取材方法

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Publication number: CN110317772A
Application number: CN201910673875.0A
Authority: CN
Inventors: 郭桂梅; 何婷; 李颖波; 陈志伟; 陆瑞菊; 刘成洪
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-07-24
Also published as: CN110317772B

Abstract

一种大麦小孢子的取材方法，包括：1)幼穗取材及预处理；2)收集、纯化小孢子。本发明在幼穗取材时，通过控制旗叶到叶舌间距为1.1‑2.0cm，缩小小孢子培养中的诱导分化差异，分离获得的小孢子经培养后诱导成胚率高，分化绿苗能力强，小孢子培养再生的效率提高了3倍，大大降低了小孢子培养中对人工及设备的要求，且能做到量化取材标准，可以提高取材的效率和标准的实用性。

Description

一种大麦小孢子的取材方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种大麦小孢子的取材方法。

背景技术

小孢子具有单细胞和单倍体的特性，是细胞工程遗传育种、遗传转化的理想受体，也是研究胚胎发生机理的理想对象。游离小孢子培养是获得纯合加倍单倍体的有效途径，游离小孢子培养技术是目前研究的热点之一，要使游离小孢子培养能够顺利进行，取材至关重要。

大麦小孢子培养取材多采用镜检方法，对取得的幼穗剥离，挑取花药，捣碎，在显微镜下镜检，观察小孢子的发育时期来确定合适的取材时期，选择最适宜启动小孢子离体胚胎发育的时期来达到高效培养再生的目的。

但是，小孢子发育是连续的、复杂的，存在多态性，需要用合适发育时期的比例来定，而对于小孢子发育时期比例的判定标准还存在难度和差异。

前期研究有报道根据花药颜色来决定取材时期，但对于花药颜色的辨别也会因人而异，且对取材人的技术要求较高，不能够推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大麦小孢子的取材方法，确定合适的取材旗叶间距，分离获得的小孢子经培养后愈伤组织产量增加30％左右，获得的愈伤组织易诱导成胚，分化绿苗能力强，再生效率提高了3倍，缩小小孢子培养中的诱导分化差异，提高大麦小孢子培养中的取材效率及取材标准的实用性，提高生产效益。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种大麦小孢子的取材方法，包括如下步骤：

1)幼穗取材及预处理

取旗叶到叶舌间距为1.1-2.0cm的大麦幼穗，保留幼穗上部两片叶子下的基部1.0-1.5cm，置于2-10℃环境中低温预处理10-30天；

2)收集、纯化小孢子

对幼穗进行消毒，将花苞接种至试管中，添加10-15ml提取液，旋切，过滤；滤液以400-1000r·min^-1速度，离心3-7min，重复1-4次，收集小孢子；

收集到的小孢子用提取液于23-28℃，黑暗中预处理1-3天后，再用20-22％麦芽糖纯化，将死活细胞分开，收集活的小孢子；

其中，所述的提取液中含有甘露醇50-70g·L^-1，添加CaCl₂ 0.8-1.5g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸0.8-1.1g·L^-1和秋水仙碱5-25mg·L^-1，pH 5.6-6.0。

优选地，所述步骤1)中，将选取的幼穗置于2-5℃环境中低温预处理。

又，所述步骤1)中，将选取的幼穗低温预处理21-30天。

进一步，步骤2)中，将花苞接种至提取液中后放置于0-5℃处理1-2天后再旋切。

又，步骤2)中，将收集到的小孢子用提取液于23-25℃、黑暗中预处理2天。

优选地，步骤2)中，所述麦芽糖的浓度为21％。

又，步骤2)中，所述的提取液中含有甘露醇60g·L^-1，添加CaCl₂ 1.1g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸0.976g·L^-1和秋水仙碱20mg·L^-1，pH5.8。

优选地，所述大麦为适于制作啤酒的大麦材料，优选花30。

本发明在幼穗取材时，通过控制旗叶到叶舌的间距来取材，控制小孢子来源质量，简单易行，分离获得的小孢子诱导成胚率高，分化绿苗能力强，大幅度增加小孢子培养再生的效率；大大降低对人和设备的要求，且能做到量化取材标准，可以提高取材的效率和标准的实用性。

发明人研究发现，在大麦幼穗取材时，若旗叶到叶舌的间距太短，材料太嫩，前期处理时容易死亡，旋切时也易受到伤害，培养时也易死亡，也就是小孢子发育时期过早，不适宜诱导培养；间距太长时，小孢子发育时期晚，培养过程中会出现大量浓密型细胞，有的死亡，有的能继续发育成愈伤组织，但此愈伤组织的胚性差，分化能力弱或没有，因此，控制旗叶到叶舌的间距为1.1-2.0cm，缩小小孢子培养中的差异，能尽量减少实验研究中因材料造成的误差，产生的胚性愈伤多，胚性愈伤能分化成更多的绿苗，即同等产量的愈伤组织，质量好的能形成更多的绿苗，具有更大的绿苗分化潜力。

在诱导培养前，将小孢子于提取液于中23-28℃、黑暗中预处理1-3天，作为缓冲及适应的过程，若直接进行培养，小孢子会死掉，提取液中的甘露醇可诱导大麦小孢子进行脱分化，改变原有配子体发育途径；提取液中还含有秋水仙碱，可以提高小孢子的存活率，提高胚状体和绿苗的产量。

本发明在大麦幼穗取材时，保留幼穗上部两片叶子下的基部1.0-1.5cm，维护叶片的密封性，保护内部的无菌环境，可降低实验的污染率，同时避免消毒时液体进入穗子内部且很难再冲洗干净，对穗子中的小孢子造成伤害；置于2-10℃环境中低温预处理10-30天，诱导小孢子脱分化，改变原有配子体发育途径的作用，即有助于花粉由配子体途径向孢子体途径的转换，同时低温降低了小孢子的新陈代谢；低温时间过短起不到应有的作用，处理时间过长，材料会黄掉，小孢子活力和能力均会下降。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中在大麦幼穗取材时控制旗叶间距，简单、易行，能有效避免因需花药颜色观察或小孢子发育时期观察造成的材料损伤和浪费，还能解决因对技术设备的要求而无法取材进行小孢子培养的问题。

本发明从取材源头控制取样小孢子的质量，使小孢子培养再生的效率提高了3倍，提高生产效益；同时，明确合适的旗叶到叶舌间距后，缩小小孢子培养中的差异，能尽量减少实验研究中因材料造成的误差，提高研究的精确度，提升取材效率，奠定设定取材标准的基础。

附图说明

图1为本发明实施例中大麦幼穗取材时旗叶到叶舌间距示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1.材料

大麦品系花94-30(称“花30”)，2017年11月种植于青浦基地，2018年3月下旬开始取材。

2.方法

2.1取材与幼穗预处理

待“花30”植株旗叶开始抽出至旗叶到叶舌间距抽出4cm以内，均进行取材，按照旗叶到叶舌间距进行取样，参见图1和表1，图1中，2号为实施例3，1号为对比例1，3号为对比例2，4号为对比例3。

上部两片叶子的基部保留长度为1.0-1.5cm，剪去叶片，放入保鲜袋中，5℃低温预处理21天。

2.2收集、纯化小孢子

在无菌超净工作台上，接种前用10％的消毒灵消毒10min，无菌水冲洗4～5次，每个试管(50ml)接5个幼穗的花苞，加入12ml提取液，将花苞接种至提取液中后放置于0-5℃处理1-2天，用高速分散器超速旋切，把旋切好的悬浮液，用150目筛网过滤，滤液以700r·min^-1，5min低速离心，重复3次，收集小孢子。

2.3小孢子培养和愈伤组织诱导

收集到的小孢子用提取液于25℃、黑暗中预处理2天后再纯化培养，培养前用诱导培养基洗涤1次，然后将小孢子密度调节至1.0×10⁵个·mL^-1，取1.0mL小孢子悬浮液接种于培养皿(35mm×12mm)中，3个重复，用封口膜封口，25℃，暗培养，18天，形成愈伤组织。

2.4绿苗分化和统计

把形成的愈伤组织称其质量后转入分化培养基中，诱导愈伤组织的分化，绿苗形成，待绿苗长至2-3cm时，挑出并统计绿苗数目，统计5周。

提取液含有甘露醇60g·L^-1，添加CaCl₂ 1.1g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸(N-Morpholine ethane sulfonic acid，MES)0.976g·L^-1和秋水仙碱20mg·L^-1，pH 5.8。

诱导培养基以N₆培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g·L^-1、激动素(Kinetin，KT)0.5mg·L^-1、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)1.0mg·L^-1、MES 0.976g·L^-1、水解干酪素100mg·L^-1及谷氨酰胺400mg·L^-1，PH 5.8。

分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖30g·L^-1、6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)0.5mg·L^-1、KT1.5mg·L^-1及萘乙酸(Naphthaleneacetic acid，NAA)0.05mg·L^-1，用琼脂粉5.5g·L^-1固化培养基，pH 5.8。

提取液和诱导培养基为过滤灭菌，分化培养基为0.11Mpa、121℃高温高压灭菌15min。

3.生长统计指标和数据处理

愈伤产量：小孢子培养18d时转移至分化培养基的愈伤组织质量，培养皿吸尽液体培养基后采用电子天平称量，用mg·皿^-1表示；

绿苗产量：每皿愈伤组织能分化出的绿苗数，用株·皿^-1表示；

再生能力：每100mg愈伤组织分化出的绿苗数，用株·100mg^-1愈伤组织表示；

所有试验结果采用Microsoft Excel 2010、DPS v7.05版数据处理系统进行分析，结果参见表1。

表1 不同距离段下小孢子培养的愈伤产量、绿苗产量和再生能力

注：表中性状值为“均值±标准误”，其后面的不同字母代表各性状在不同预处理间差异显著(P<0.05)，下表相同。

从表1中可以看出，不同间距段的培养结果差异明显，本发明实施例的小孢子绿苗产量和再生能力明显优于对比例，形成的愈伤组织质量好，具有更大的绿苗分化潜力。

4.取材优化前后小孢子培养的反应

分别利用本发明的取材方法和现有技术中的取材方法进行取材，并进行小孢子培养，本发明的取材方法中，旗叶到叶舌的间距在1.1-2.0cm，而现有取材方法是根据小孢子发育时期或花药颜色混合取样的(即对旗叶到叶舌的间距不做考察)，培养结果参见表2。

表2 取材方法优化前后的小孢子培养的愈伤产量、绿苗产量和再生能力

从表2可以看出，本发明小孢子的愈伤产量、绿苗产量和再生能力均显著高于现有取材方法下的愈伤产量、绿苗产量和再生能力。

本发明从取材源头把好小孢子来源质量，使小孢子培养再生的效率提高了3倍，提高了生产效益；同时，明确合适的旗叶到叶舌间距后，缩小小孢子培养中的差异，能尽量减少实验研究中因材料造成的误差，提高研究的精确度，提升取材效率，奠定设定取材标准的基础。

Claims

1.一种大麦小孢子的取材方法，包括如下步骤：

1)幼穗取材及预处理

选取大麦幼穗，其旗叶到叶舌的间距为1.1-2.0cm，保留幼穗上部两片叶子下的基部1.0-1.5cm，除去叶片，置于2-10℃环境中低温预处理10-30天；

2)收集、纯化小孢子

对幼穗进行消毒，将花苞接种至试管中，添加10-15ml提取液，旋切，过滤；滤液以400-1000r·min^-1速度离心3-7min，重复1-4次，收集小孢子；

将收集到的小孢子用提取液于23-28℃，黑暗中预处理1-3天后，再用20-22％麦芽糖纯化，将死活细胞分开，收集活的小孢子；

其中，所述的提取液中含有甘露醇50-70g·L^-1，添加CaCl₂0.8-1.5g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸0.8-1.1g·L^-1和秋水仙碱5-25mg·L^-1，pH5.6-6.0。

2.根据权利要求1所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤1)中，将选取的幼穗置于2-5℃环境中进行低温预处理。

3.根据权利要求1或2所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤1)中，将选取的幼穗低温预处理21-30天。

4.根据权利要求1所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤2)中，将花苞接种至提取液中后放置于0-5℃处理1-2天后再旋切。

5.根据权利要求1所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤2)中，将收集到的小孢子用提取液于23-25℃黑暗中预处理2天。

6.根据权利要求1或5所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤2)中，所述麦芽糖的浓度为21％。

7.根据权利要求1所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，步骤2)中，所述的提取液中含有甘露醇60g·L^-1，添加CaCl₂ 1.1g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸0.976g·L^-1和秋水仙碱20mg·L^-1，pH5.8。

8.根据权利要求1-7任一项所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，所述大麦为适于制作啤酒的大麦材料。

9.根据权利要求8所述大麦小孢子的取材方法，其特征在于，所述大麦的品种为花30。