CN105941149B - 一种板栗体细胞胚的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组织培养，具体公开了一种板栗的体细胞胚的诱导方法，将板栗的幼胚胚尖作为外植体，进行体细胞胚的诱导培养，所述幼胚胚尖优选取自开花后45～54天的板栗。本发明以主栽品种‘燕山红栗’板栗作为试验材料，以幼胚胚尖作为外植体，并优化了采集时间和诱导方法，对板栗体细胞胚发育过程进行研究，为今后进一步建立板栗转基因再生体系进行核心种质遗传改良奠定了坚实的基础。

Description

一种板栗体细胞胚的诱导方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养，具体地说，涉及板栗的体细胞胚的诱导。

背景技术

板栗(Castanea mollissima)是壳斗科栗属植物，根系发达，适应性强，是我国重要的生态经济林树种。栗属植物分布遍及北半球的亚洲、欧洲、非洲和美洲大陆。现存的栗属植物有十多种，其中，进行经济栽培的种主要有中国板栗Castanea mollissima、欧洲栗Castanea sativa、日本栗Castanea crenata、美洲栗Castanea dentate。板栗在中国栽培历史悠久。由于板栗属于异花授粉植物、长期进行实生繁殖、种间可以杂交，以及板栗生长地区复杂的地理生态条件等，在长期的系统发育和进化过程中，形成了丰富的种质资源。

体细胞胚(somatic embryo)又叫胚状体，是离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。植物体细胞胚发生途径有两种：直接发生途径和间接发生途径，两者区别在于是否经由胚性愈伤组织的发生。多数植物体细胞胚的发生都是间接发生途径，如柑橘须经胚性愈伤组织诱导形成体细胞胚，但也有一些植物的体细胞胚是通过直接发生途径形成的，如在苹果叶片培养中，离体叶片可以直接产生体细胞胚。还有少数植物，体细胞胚发生途径既可以通过直接途径也可以通过间接途径，如葡萄等。由于体细胞胚是单细胞起源，具有两极性、遗传稳定性高等特点，目前被广泛应用于基因遗传转化体系的研究中。在桃、山核桃等果树中，利用体细胞胚发生进行植株再生及遗传转化体系的研究已进行了成功报道。悬浮培养等手段有利于体细胞胚的发生，在百合和马尾松体细胞胚的研究中已有应用，并且利用悬浮培养诱导体细胞胚发生，可有效控制体细胞胚发生同步化，悬浮培养物生长较快，培养周期短等优点。

在栗属植物美洲栗和欧洲栗中，利用未成熟胚和叶片等作为外植体都已成功诱导了体细胞胚的发生，此后，以体细胞胚再生体系成功进行了美洲栗和欧洲栗基因遗传转化，获得转基因植株。对于我国板栗体细胞胚的发生，张玲等利用板栗胚珠作为外植体对体细胞胚的发生作了初步研究，仅仅诱导出胚性愈伤，出现球形胚，但体细胞胚并未继续发育至成熟，且胚珠诱导体细胞胚的效率较低，因此，亟需一种高效完整的诱导板栗体细胞胚发生的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种板栗体细胞胚的诱导方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种板栗体细胞胚的诱导方法，将板栗的幼胚胚尖作为外植体，进行体细胞胚的诱导培养。本发明通过试验发现，将幼胚胚尖作为外植体，具有极高的愈伤组织诱导率。

进一步地，本发明优化了外植体的采集时间，优选所述幼胚胚尖取自开花后45～54天的板栗。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(1)将外植体接种到诱导培养基中进行诱导增殖培养；

(2)将增殖培养得到的体细胞胚或体细胞胚发生前体转移至发育培养基中培养，并观察体细胞胚形态；

(3)当观察到出现子叶形胚时，将发育培养基中的体细胞胚转移至成熟培养基中，促进体细胞胚发育至成熟。

更进一步地，本发明提供两种诱导方法，即不悬浮培养诱导与悬浮培养诱导，具体如下：

不悬浮培养诱导：所述步骤(1)将外植体接种到诱导培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养，直至有体细胞胚形成；

所述诱导培养基的配方为：WPM((木本植物)培养基基盐混合物)+109mg·L^{- 1}Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+1.0g·L^-1水解酪蛋白(Casein hydrolysate)+0.5mg·L^-1 2,4-D+0.3mg·L^-1 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.7％琼脂。

悬浮培养诱导：所述步骤(1)包括：

S1、将外植体接种到诱导培养基中，在23～25℃条件下暗培养28～32天，得到体细胞胚发生前体；

S2、将体细胞胚发生前体接种到液态的增殖培养基中，悬浮培养40～50天，得到增殖的体细胞胚发生前体；悬浮培养条件为，23～25℃下，摇床，暗培养；

所述诱导培养基的配方为：WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末(100x)+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖+0.7％琼脂；

所述增殖培养基的配方为：WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末(100x)+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖。

配方中的上述成分(除激素类、蔗糖、琼脂)均可购自Phytotechnologylaboratories公司。激素类、蔗糖、琼脂可使用本领域常用试剂，属于本领域技术人员的常规选择。

悬浮培养中使用的维生素不可以高温灭菌，而不悬浮培养的维生素可以直接高温灭菌。

其中，“3％蔗糖”和“0.7％琼脂”中的百分比是指质量比体积，相当于30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂。

进一步地，悬浮培养中的摇床条件为100～120rpm。

需要说明的是，无论是悬浮培养还是不悬浮培养，二者的区别仅在于步骤(1)的不同，后续步骤均一致。

所述步骤(2)为：将增殖培养得到的体细胞胚或体细胞胚发生前体转移至发育培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养；

所述发育培养基的配方为：WPM+109mg〃L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+1.0g〃L^-1水解酪蛋白(Casein hydrolysate)+0.5g〃L^-1L-谷氨酰胺(L-glutamine)+6％蔗糖+0.7％琼脂。

所述步骤(3)中，当观察到出现子叶形胚时，将发育培养基中的体细胞胚转移至成熟培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养；

所述成熟培养基的配方为：B5基本培养基(Gamborg’s“B5”salts)+109mg·L^{- 1}Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+0.1mg·L^-1萘乙酸(NAA)+0.1mg·L^-1 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+6％蔗糖+0.7％琼脂。

进一步地，本发明提供所述幼胚胚尖的获得方法，具体为：将采集的板栗去蓬后得到板栗果实，对板栗果实进行消毒处理后，剥取幼胚胚尖。

所述消毒处理具体为：利用75％乙醇处理1min后，利用3％NaClO处理5min，无菌水冲洗去除残留。

本发明的有益效果在于：

本发明以主栽品种‘燕山红栗’板栗作为试验材料，以幼胚胚尖作为外植体，并优化了采集时间和诱导方法，对板栗体细胞胚发育过程进行研究，为今后进一步建立板栗转基因再生体系进行核心种质遗传改良奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明实验例1中‘燕山红栗’的外观图。

图2为本发明实验例1中‘燕山红栗’去除刺蓬后的未成熟果实。

图3为本发明实验例1中‘燕山红栗’两种不同形态(胚珠、幼胚胚尖)外植体；A.胚珠；B.幼胚胚尖(黑框所示)，bar＝1mm。

图4为本发明实验例1中诱导形成的两种不同愈伤组织形态；A.胚性愈伤组织；B.非胚性愈伤组织。

图5为本发明实验例1中体视显微镜观察到的(不经悬浮培养)体细胞胚的形态结构，bar＝1mm；箭头所指为球形胚箭头所指为不同阶段的体细胞胚，分别是A.球形胚前体；B.球形胚；C.过渡期；D.心形胚；E.鱼雷形胚；F.子叶形胚。

图6为本发明实验例1中悬浮培养过程板栗体细胞胚的形态观察，箭头所指为球形胚。

图7为本发明实验例1中体视显微镜观察到的(经悬浮培养)体细胞胚的形态结构，bar＝1mm；箭头所指为球形胚箭头所指为不同阶段的体细胞胚，分别是A.球形胚前体；B.球形胚；C.心形胚；D.鱼雷形胚；E.子叶形胚。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例以‘燕山红栗’为例，用于说明本发明所述的板栗体细胞胚的诱导方法。

包括如下步骤：

一、板栗的采集：

‘燕山红栗’第一次盛花期后的45天～54天进行采集，4℃保存备用。

二、板栗的消毒与外植体的获取：

将采集的板栗去蓬，在超净工作台上进行表面消毒及接种工作，75％乙醇处理1min，3％NaClO处理5min，无菌水冲洗3～4次。在对外植体消毒灭菌的过程中，轻轻摇晃三角瓶，使得乙醇、NaClO与外植体充分接触；无菌水冲洗时，也要轻轻摇晃三角瓶，保证无菌水与外植体充分接触，每次2min。用尖头镊子小心从板栗未成熟果实中剥取板栗幼嫩的幼胚胚尖，用于之后的接种。

三、体细胞胚的诱导和增殖培养：

(1)体细胞胚发生前体(proembryogenic mass，PEMs)的诱导和增殖培养：

诱导：将幼胚胚尖接种于诱导培养基(WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末(100x)+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖+0.7％琼脂)上。25℃暗培养30天。

增殖：PEMs增殖培养采用悬浮培养，即接种5g PEMs于60mL增殖培养基(WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末(100x)+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖)中。100rpm，25℃暗培养45天，每两周更换一次新鲜培养基。

(2)体细胞胚的诱导和增殖培养：

将悬浮培养的PEMs转移至发育培养基(WPM+109mg〃L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+1.0g〃L^-1水解酪蛋白+0.5g〃L^-1L-谷氨酰胺+6％蔗糖+0.7％琼脂)，23～25℃暗培养，每两周利用体视显微镜(OLYMPUS SZX7)观察体细胞胚形态。

四、体细胞胚的成熟

当观察体细胞胚的形态中出现子叶形胚时，将发育培养基的体细胞胚转移至成熟培养基(B5基本培养基+109mg·L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+0.1mg·L^-1萘乙酸+0.1mg·L^-1 6-BA+6％蔗糖+0.7％琼脂)，23～25℃暗培养。每周利用体视显微镜(OLYMPUSSZX7)观察体细胞胚形态。在此培养基上，体细胞胚可发育子叶型胚。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：步骤三、体细胞胚的诱导和增殖培养过程不同，具体如下：

(1)将幼胚胚尖接种于诱导培养基(WPM+109mg·L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末(1000x)+1.0g·L^-1水解酪蛋白+0.5mg·L^-1 2,4-D+0.3mg·L^-1 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂)上，23～25℃暗培养。每月更换一次新鲜培养基，大约三个月(诱导与增殖)后，有体细胞胚形成。诱导培养基可作为增殖培养基，在此培养基上，胚性愈伤组织可以保持胚性增殖。每两周利用体视显微镜(OLYMPUS SZX7)观察体细胞胚形态。

(2)将成功诱导的体细胞胚转移至发育培养基(WPM+109mg·L-1Nitsch&NitschVitamin Powder+1.0g·L-1Casein hydrolysate+0.5g·L-1L-glutamine+6％蔗糖+0.7％琼脂)，23～25℃暗培养。此培养基可诱导体细胞胚进一步发育。

对比例1～2

对比例1～2与实施例1～2的区别在于：步骤二中，用尖头镊子小心从板栗未成熟果实中剥取板栗幼嫩的胚珠。

实验例1

本实验例用于说明样品采集时间、外植体的选择以及诱导方法对板栗体细胞胚发育的影响。

具体实验方案如下：

一、不同发育时期对板栗胚性愈伤组织的影响

在研究胚性愈伤组织诱导和增殖过程发现，不同采样时期(第一次盛花期后42天、45天、48天、51天、54天、57天、60天、63天、66天)诱导的胚性愈伤组织出现了不同程度的褐变。褐变较为严重的胚性愈伤组织在后期进行增殖培养时，不能有效增殖，并且褐变程度会逐渐变大。由表1可以看出，‘燕山红栗’在花后54天以后的样品开始褐变，花后57天以后所采样品褐变等级达到三级以上。因此，‘燕山红栗’采用花后54天之前的样品用于胚性愈伤组织的诱导。因此，‘燕山红栗’最适宜胚性愈伤组织诱导的取样时间为花后45天～54天之间。

表1不同取样时间‘燕山红栗’诱导胚性愈伤组织的褐变等级

注：由于不能精确计算愈伤组织的褐变率，故采用褐变等级的方法来估计其褐变程度。愈伤组织褐变等级划分：0级，无褐变发生；一级，轻微褐变发生，约占愈伤组织的1％；二级，轻度褐变发生，约占愈伤组织的20％；三级，可明显观察到褐变发生，约占愈伤组织的50％；四级，褐变较严重，约占愈伤组织的70％；五级，完全褐变。

二、外植体类型和诱导方法对板栗胚性愈伤组织诱导的影响

分别接种‘燕山红栗’两种不同形态(胚珠、幼胚胚尖)的幼胚外植体(图3)，每个月观察统计胚性愈伤组织诱导率。试验中观察到胚性愈伤组织(图4，A)呈淡黄色，细胞颗粒较小呈松散排列，细胞表面有光泽，而非胚性愈伤组织颜色略呈褐色，细胞排列紧密(图4，B)。

从愈伤组织诱导率来看(表2)，接种‘燕山红栗’胚珠(图3，A)的愈伤组织诱导率分别为54.99％和0.1％，而接种幼胚胚尖(直径2mm左右，图3，B)的愈伤组织诱导率都在95％以上，差异极显著，因此，幼胚胚尖是诱导板栗愈伤组织较适宜的外植体。

从愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率(表2)也可看出，两种诱导方法对于幼胚胚尖都比较合适，愈伤组织诱导率均在95％以上，胚性愈伤组织诱导率均在79％以上；而对于胚珠作为外植体，不经悬浮培养尚可诱导小部分愈伤组织，而悬浮培养并不适合胚珠作为外植体来诱导。但是，悬浮培养时，愈伤组织生长较快，培养周期相对较短，这是悬浮培养的主要优势。

表2不同诱导方法、不同外植体的愈伤组织及胚性愈伤组织诱导率比较

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列中不同大写字母表示0.01水平差异极显著。

愈伤组织诱导率(％)＝长出愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100％。

胚性愈伤组织诱导率(％)＝长出胚性愈伤组织的外植体数/长出愈伤外植体数×100％。

三、板栗体细胞胚发生形态学观察

接种‘燕山红栗’幼胚胚尖，观察两个板栗品种胚性愈伤组织发育前期的形态学变化过程。结果发现离体暗培养5天后，开始有愈伤组织发生。接种10天、15天和20天后分别观察胚性愈伤组织形态，发现胚性愈伤组织形态随时间变化不大。胚性愈伤组织颜色均呈现乳白色或淡黄色，色泽较鲜亮。将幼胚胚尖接种到体细胞胚诱导培养基上，3个月后观察到有体细胞胚的形成。经发育培养基、成熟培养基，观察到体细胞胚呈现不同的形态。利用体视显微镜可观察到球形胚前体、球形胚、过渡期、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚等胚性愈伤组织的形态结构(图5和图7)。

试验过程中发现，体细胞胚发生前体在液体诱导培养基中，增殖相当快，且长势均匀，转移至发育培养基后体细胞胚生长较为一致，球形胚等出现较整齐(图6)，且增殖较快。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种用于提高板栗胚性愈伤组织诱导率的体细胞胚的诱导方法，其特征在于，将板栗的幼胚胚尖作为外植体，进行体细胞胚的诱导培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚胚尖取自开花后45～54天的板栗。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将外植体接种到诱导培养基中进行诱导增殖培养；

(2)将增殖培养得到的体细胞胚转移至发育培养基中培养，并观察体细胞胚形态；

(3)当观察到出现子叶形胚时，将发育培养基中的体细胞胚转移至成熟培养基中，促进体细胞胚发育至成熟。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)将外植体接种到诱导培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养，直至有体细胞胚形成；

所述诱导培养基的配方为：WPM+109mg·L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末+1.0g·L^-1水解酪蛋白+0.5mg·L^-1 2,4-D+0.3mg·L^-1 6-苄基氨基嘌呤+3％蔗糖+0.7％琼脂。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将外植体接种到诱导培养基中培养得到体细胞胚发生前体，再将体细胞胚发生前体接种到液态的增殖培养基中，悬浮培养40～50天，得到增殖的体细胞胚发生前体；

(2)将增殖培养得到的体细胞胚发生前体转移至发育培养基中培养，并观察体细胞胚形态；

(3)当观察到出现子叶形胚时，将发育培养基中的体细胞胚转移至成熟培养基中，促进体细胞胚发育至成熟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

S1、将外植体接种到诱导培养基中，在23～25℃条件下暗培养28～32天，得到体细胞胚发生前体；

S2、将体细胞胚发生前体接种到液态的增殖培养基中，悬浮培养40～50天，得到增殖的体细胞胚发生前体；悬浮培养条件为，23～25℃下，摇床，暗培养；

所述诱导培养基的配方为：WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖+0.7％琼脂；

所述增殖培养基的配方为：WPM+Schenk&Hildebrandt维生素粉末+2.0mg·L^-1 2,4-D+3％蔗糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，摇床培养的条件为100～120rpm。

8.根据权利要求4、6、7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将增殖培养得到的体细胞胚或体细胞胚发生前体转移至发育培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养；

所述发育培养基的配方为：WPM+109mg·L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末+1.0g·L^-1水解酪蛋白+0.5g·L^-1L-谷氨酰胺+6％蔗糖+0.7％琼脂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，当观察到出现子叶形胚时，将发育培养基中的体细胞胚转移至成熟培养基中，在23～25℃条件下进行暗培养；

所述成熟培养基的配方为：B5基本培养基+109mg·L^-1Nitsch&Nitsch维生素粉末+0.1mg·L^-1萘乙酸+0.1mg·L^-1 6-苄基氨基嘌呤+6％蔗糖+0.7％琼脂。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述幼胚胚尖的获得方法为：将采集的板栗去蓬后得到板栗果实，对板栗果实进行消毒处理后，剥取幼胚胚尖。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述消毒处理为：利用75％乙醇处理1min后，利用3％NaClO处理5min，无菌水冲洗去除残留。