CN103749309B - 一种生产白术脱毒苗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产白术脱毒苗的方法，包括1.白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：将白术胚接种于初代培养基中：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L；2.增殖培养：增殖培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L；3.病毒检测：将含病毒的白术苗舍去，不含病毒的白术苗继续增殖培养；4.生根培养：将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到生根培养基中：1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；5.炼苗移栽。本发明通过单因素试验，获得了白术的初代培养基配方和生根培养基配方，通过正交设计获得白术组培苗增殖培养基配方，最重要的是本发明利用种胚部分不含病毒的事实通过胚培养获得白术脱毒苗。
Description
技术领域
本发明属于植物脱毒与组织培养快繁技术领域，具体说涉及一种生产白术脱毒苗的技术方法。
背景技术
白术（Atractylodes macrocephala Koidz），多年生菊科（Asteraceae）苍术属草本植物，是中医“参、术、苓、甘”四大名贵药材之一，其干燥根茎，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效，为常用的补益类中药，俗有 “十方九术”之说。由于白术应用广，市场需求量大，白术在全国各地均有推广种植。
然而在白术的栽培中常受到病虫害危害，特别是在高温高湿的天气，有时整片死亡甚至绝收，造成无法挽回的经济损失。白术的病害有细菌病害、真菌病害和病毒病害。病毒病害的防治与细菌和真菌病害完全不同，没有防治的特效药剂, 通常采用脱毒的方法来达到防治目的。因此白术脱毒苗的生产是最大限度降低病毒病害的有效措施。
病毒在植株体内的积累很大程度上影响植株的品质和产量，对植株的生产和利用造成极大的危害。
常规的茎尖脱毒，为最广泛的脱毒手段之一，除操作繁琐外，还存在脱毒率与成活率相矛盾的问题，即若想得到较高的脱毒率需要将茎尖周围的幼叶等组织剥除，仅留生长锥部分进行培养，但这样的材料成活率很低，有时甚至为零，若想提高成活率则需要用较大的茎尖进行培养，这又会使脱毒率不理想。
近年来，虽然有文献对白术的组培快繁技术进行了研究，但都属于常规的组培，对于如何生产白术脱毒苗的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于解决白术病毒病的危害，提供一种白术脱病毒组培苗的生产方法，建立白术组培脱毒的技术体系。本发明基于白术种胚部分不含病毒的检测结果，将种胚分离出来进行培养，以获得脱病毒苗，提高白术种苗品质。
本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种生产白术脱毒苗的方法，包括以下操作流程：
1.白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式为：蒸馏水浸泡12h，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用；使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基中：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；接种一周后，观察到种胚开始萌发；
2.增殖培养：培养40-60天待苗长到2-3cm左右，在超净工作台上将苗从培养瓶中取出，置于无菌皿中，修剪后转接到增殖培养基中：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40d后，统计得平均增殖倍率达到3.5；
3.病毒检测：将增殖苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测，采用ELISA检测法，步骤如下：
1）将待检样品加入盛有通用缓冲液GEB的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用磷酸盐吐温缓冲液PBST润洗3次，每次3min；
2）加封闭液脱脂奶粉ECM，每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h；1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min；
3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
5）于各反应孔中加入碱性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜；
6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性；
ELISA检测结果显示，90%的胚培养苗不含病毒，将含病毒的白术苗舍去，不含病毒的白术苗继续增殖培养；
4.生根培养：在超净工作台上，将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到生根培养基中：1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；一个月后，组培苗平均生根数可高达8条/株；
5.炼苗移栽：当白术组培苗根长≥1cm时，将培养瓶从组培室移出，置于炼苗室常温闭瓶炼苗4d，旋松盖子2d，半开盖子2d，全开盖2d；炼苗完成后，将白术苗从培养瓶移出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，移栽于盛有松针土的花盆中，浇透水，每天早晚清水喷洒叶面保湿，一周后减少喷水次数；一个月后，统计成活率可以达到92%以上。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术
方案可知，本发明通过单因素试验，获得了白术的初代培养基配方和生根培养基配方，通过正交设计获得白术组培苗增殖培养基配方，最重要的是本发明利用种胚部分不含病毒的事实通过胚培养获得白术脱毒苗，胚培养避免了茎尖脱毒存在的问题，不仅操作简便，而且成活率和脱毒率均较高，简化了脱毒过程，建立了胚培养获得白术脱毒苗的技术体系,为解决白术的病毒危害问题奠定了基础。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种生产白术脱毒苗的方法具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
一种生产白术脱毒苗的方法，包括以下操作流程：
1.白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式为：蒸馏水浸泡12h，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用；使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基中：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；接种一周后，观察到种胚开始萌发；
2.增殖培养：培养40-60天待苗长到2-3cm左右，在超净工作台上将苗从培养瓶中取出，置于无菌皿中，修剪后转接到增殖培养基中：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40d后，统计得平均增殖倍率达到3.5；
3.病毒检测：将增殖苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测，采用ELISA检测法，步骤如下：
1）将待检样品加入盛有通用缓冲液GEB的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用磷酸盐吐温缓冲液PBST润洗3次，每次3min；
2）加封闭液脱脂奶粉ECM，每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h；1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min；
3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
5）于各反应孔中加入碱性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜；
6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性；
ELISA检测结果显示，90%的胚培养苗不含病毒，将含病毒的白术苗舍去，不含病毒的白术苗继续增殖培养；
4.生根培养：在超净工作台上，将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到生根培养基中：1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；一个月后，组培苗平均生根数可高达8条/株；
5.炼苗移栽：当白术组培苗根长≥1cm时，将培养瓶从组培室移出，置于炼苗室常温闭瓶炼苗4d，旋松盖子2d，半开盖子2d，全开盖2d；炼苗完成后，将白术苗从培养瓶移出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，移栽于盛有松针土的花盆中，浇透水，每天早晚清水喷洒叶面保湿，一周后减少喷水次数；一个月后，统计成活率可以达到92%以上。
本发明是通过单因素试验，获得白术的初代培养基配方和生根培养基配方，通过正交设计获得白术组培苗增殖培养基配方，最重要的是本发明利用种胚部分不含病毒的检测结果，通过胚培养获得白术脱毒苗，简化脱毒过程，具体地：
其中：白术种子及其各部位的病毒检测，采用ELISA检测法，步骤如下：
将购买的白术种子用蒸馏水浸泡12h后，使用枪状镊和医用镊子将每个种子的种皮、子叶和胚分离开来，对种子、种皮、子叶和胚进行3次重复的ELISA检测。
1）将待检样品加入盛有GEB(通用缓冲液)的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST（磷酸盐吐温缓冲液）润洗3次，每次3min。
2）加封闭液ECM（脱脂奶粉），每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h。1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min。
3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h。2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min。
4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h。2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min。
5）于各反应孔中加入临时配制的PNP（碱性磷酸酯酶）底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜。
6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性。
种子及各部位的ELISA检测结果见表1。从表1可知，河北安国张步乡村和浙江磐安产地的种子及子叶部位均检出含有病毒PVX（马铃薯X病毒）、ORSV（齿兰环斑病毒）和CYMV（剑兰花叶病毒），河南焦作种子及子叶部位检出含有病毒PVX、ORSV，不含CYMV；三个产地的种皮和胚部分均未检出含有病毒PVX、ORSV和CYMV。因此，在本发明中，采用胚培养获取白术脱毒苗。
其中：白术种子处理和胚的无菌萌发，除种子预处理和初代培养基不同外，其余处理方式相同。
购买的白术种子的预处理方式有6种，见表2。
然后在超净工作台用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用。使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术的胚接种于表3所述的初代培养基中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。一个月后，统计各种处理的成活率，统计分析结果见表4.
从表4可知，成活率A组＞C4组和E2组＞B组＞其他处理组，整体比较可以看出，病毒唑的加入一定程度上抑制了种胚的萌发，但加入量和抑制作用没有正相关性。
白术胚培养苗经扩繁后，采用ELISA进行病毒检测。于超净工作台上将苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测，步骤如下：
1）将待检样品加入盛有GEB(通用缓冲液)的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST（磷酸盐吐温缓冲液）润洗3次，每次3min。
2）加封闭液ECM（脱脂奶粉），每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h。1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min。
3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h。2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min。
4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h。2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min。
5）于各反应孔中加入临时配制的PNP（碱性磷酸酯酶）底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜。
6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性。
白术胚培养苗的ELISA病毒检测结果见表5。从表5可知，处理组A检出率最高，处理组B、C、D和E均起到了一定的脱毒效果，即胚培养与病毒抑制剂的处理均起到了脱毒的效果，但是不同病毒的脱除率不同。对PVX来讲，D组处理的脱除率较好，B组次之，C组和E组较差；而对ORSV和CYMV来讲，B、C、E组处理的脱除率较好，D组较差。从简便、节约、环保的角度综合考虑，处理B（即通过用蒸馏水浸泡种子后，将胚接种于不含病毒唑的初代培养基）即可得到较高的脱毒率，此处理对PVX的脱除率可达90%，对ORSV和CYMV的脱除率高达100%。又处理B成活率较其他处理（除C4和E2外）的高，因此，本发明选择处理B为适宜处理方式。
其中：增殖培养基的筛选：
通过正交试验设计获得白术苗增殖培养基配方，选择6-BA、NAA、KT三个因素，分别设定三个浓度水平（见表6），采用L9(34)正交表（见表7）进行正交试验以获取白术组培苗增殖的适宜培养基配方。基本培养基均为MS，各组均添加30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉，pH值为5.8。
白术增殖的正交试验共有9组处理，各处理除增殖培养基不同外，其余处理方式都相同，如下：
白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式为：蒸馏水浸泡12h。然后在超净工作台上用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用。使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基（1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L）中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。
增殖培养：在超净工作台上将苗从培养瓶取出，修剪后转接到表7所述的增殖培养基中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。
接种40天后，统计增殖数并计算增殖倍率，对试验结果进行极差分析。白术苗增殖正交试验结果及分析见表8，结果表明白术苗增殖培养基的最佳配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L。
其中：白术生根试验共有6组处理，各处理除生根培养基不同外，其余处理方式都相同，如下：
种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式，为：蒸馏水浸泡12h。然后在超净工作台用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用。使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基（1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L）中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。
增殖培养：培养50天后，在超净工作台上将苗从培养瓶取出，修剪后转接到增殖培养基（MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L）中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。
生根培养：在超净工作台上，将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到表9所述的生根培养基中，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的组培室中。一个月后，统计白术组培苗的平均生根情况并进行分析，白术组培苗生根试验所用的培养基配方及生根结果见表9。
由表9可知，处理2生根率远远高于其它处理组，为8.21，选择处理2即1/2MS+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉为白术组培苗生根的适宜培养基配方。处理2生根苗炼苗移栽，30d后统计成活率可以达到92%以上。
本发明基于白术种胚部分不含病毒的检测结果，利用胚培养生产脱毒苗，简化了实验过程，且经ELISA病毒检测，胚培养苗的脱毒率达90%以上，将检测结果含病毒的株系弃去，不含病毒的用于增殖培养,可生产出100%脱毒的组培苗。
本发明建立了白术脱毒培养的技术体系，为大规模生产无病毒种苗，促进白术产业健康发展奠定了基础。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种生产白术脱毒苗的方法，其特征在于：包括以下操作流程：
（1）白术种子的预处理及其胚的无菌萌发：购买的白术种子的处理方式为：蒸馏水浸泡12h，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡60s，无菌水冲洗2-3次，再置于10%次氯酸钠溶液中10min，期间搅拌，无菌水冲洗5-6次，倾尽无菌水待用；使用经过高压灭菌的枪状镊和医用镊子将消过毒的白术种子置于无菌皿中去皮剖开，并拔取种胚部分，将白术胚接种于初代培养基中：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；接种一周后，观察到种胚开始萌发；
（2）增殖培养：培养40-60天待苗长到2-3cm，在超净工作台上将苗从培养瓶中取出，置于无菌皿中，修剪后转接到增殖培养基中：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+琼脂粉6g/L，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40d后，统计得平均增殖倍率达到3.5；
（3）病毒检测：将增殖苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测，采用ELISA检测法，步骤如下：
1）将待检样品加入盛有通用缓冲液GEB的研钵充分研磨，然后用移液枪移取100μL于聚苯乙烯板的反应孔中，同时做阳性、阴性及空白对照孔，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用磷酸盐吐温缓冲液PBST润洗3次，每次3min；
2）加封闭液脱脂奶粉ECM，每个反应孔200μL，置于37℃孵育1h；1h后，用PBST缓冲液润洗3次，每次3min；
3）加新鲜稀释的抗体，在每个反应孔中加100μL，置于37℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
4）于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，置于25℃孵育2h；2h后，用PBST缓冲液润洗7-8次，每次3min；
5）于各反应孔中加入碱性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL，置于37℃进行暗培养，过夜；
6）结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性；
ELISA检测结果显示，90%的胚培养苗不含病毒，将含病毒的白术苗舍去，不含病毒的白术苗继续增殖培养；
（4）生根培养：在超净工作台上，将培养到4cm左右的白术组培无根苗直立插入到生根培养基中：1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；一个月后，组培苗平均生根数可高达8条/株；
（5）炼苗移栽：当白术组培苗根长≥1cm时，将培养瓶从组培室移出，置于炼苗室常温闭瓶炼苗4d，旋松盖子2d，半开盖子2d，全开盖2d；炼苗完成后，将白术苗从培养瓶移出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，移栽于盛有松针土的花盆中，浇透水，每天早晚清水喷洒叶面保湿，一周后减少喷水次数；一个月后，统计成活率可以达到92%以上。
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