CN101803569B - 试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法 - Google Patents
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Abstract
试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法是在试管内对深山草莓花瓣愈伤组织分化产生的优良变异新品种的试管苗进行匍匐茎诱导，并采取试管内高温结合茎尖对该品种进行脱毒研究，获得可用于生产的无病毒草莓种苗。该方法得到新品种在试管内培养基诱导匍匐茎，诱导率为99.5%以上；将含有匍匐茎的试管苗在试管内于56℃条件下培养85d后，切取1mm的茎尖在培养基中进行茎尖愈伤组织诱导，然后将茎尖愈伤组织转接到培养基进行愈伤组织芽苗再分化培养，将再生芽苗进行病毒检测，脱毒率为100%。试验结果证明，可利用在试管内高温处理结合茎尖脱毒的方法完全脱除病毒，从而建立草莓脱毒体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物栽培方法，即一种试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法。
背景技术
在现有技术中，草莓(Fragaria chiloensis. Duch. Bail.)是蔷薇科多年生草本植物，近几年，我国草莓生产发展迅速，草莓的面积和产量已跃居世界首位。但由于栽培草莓都是通过无性繁殖，病毒侵染之后，随同无性繁殖材料传播扩散，因此无性繁殖数量越大，病毒传播速度也越快，通过几年的栽培后，受病毒的危害，引进的品种果实变小、品质变劣、产量降低等退化现象普遍发生，造成草莓产量的减少，一般减产30％左右，复合侵染时损失更大。草莓病毒病是由草莓感染病毒而发生的病害，在栽培上表现出黄化型和缩叶型两种症状类型，草莓病毒病危害面广，据不完全统计，草莓病毒的种类多达60多种，其中草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus，SmoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus，SMTEV)、草莓镶脉病毒(Strawberry vein band virus，SVBV)和草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus，SCrV)是侵染我国草莓的4种主要病毒，总侵染率为80%以上，其中单病毒的侵染率达40%以上，两种以上病毒的复合侵染率达38%以上。由于病毒病具有潜伏侵染的特性，植株不能很快表现症状，所以在生产上常被忽视。近年来病毒的危害已越来越受到育种学家的重视，成为草莓生产上急需解决的问题。我国的草莓脱毒技术起步较晚，目前还不能满足生产要求。目前，国内外利用生物技术等手段进行定向选育抗逆性强的新品种，本课题组在前人研究的基础上，开展了长白山野生深山草莓(别名绿叶东方草莓)[Fragaria orientalis Lozinsk. var.concolor(Kitag.) Liou et C. Y. Li]花瓣诱导再生植株和变异植株的研究，以期获得具有优良性状和的抗逆性强的草莓新品种。通过近十余年试验和栽培观察，获得了6个遗传稳定的优良株系，又从这6个优良株系种确定了1个优质、丰产及抗病力强，并可用于生产和推广的新品种，暂定名为“长白1号”，栽培2年后发现该品种草莓植株严重矮化，叶片产生不规则黄色斑点，扭曲变形，匍匐茎数量逐年减少，繁殖率下降，果实变小，大幅度减产等现象。经检测该品种感染了草莓斑驳病毒和草莓皱缩病毒。草莓脱毒研究大多集中在茎尖脱毒、花药培养脱毒、高温处理和药处理等方面，但均很难达到100%的脱毒率，茎尖脱毒采用0.30 mm的茎尖，但0.3 mm的茎尖脱毒效果虽好，但成活率低且达不到完全脱毒，而且剥离茎尖难度大，操作易被污染，所需时间较长，工作效率低。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种脱毒效果更好的试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法。
本发明的技术解决方案是：试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法包括草莓的试管苗在试管内培养基诱导匍匐茎，培养温度(22±2) ℃，培养33～45 d(天)；然后将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为50～56 ℃的恒温培养箱中进行80～85 d高温培养处理后，再切取0.5～1.0 mm的茎尖在培养基中进行茎尖愈伤组织诱导，温度(24±2) ℃，培养28～35d；然后将茎尖愈伤组织转接到培养基进行愈伤组织芽苗再分化培养，温度(24±2) ℃，培养30～40d得再生芽苗。将再生芽苗进行病毒检测，草莓斑驳病毒和皱缩病毒脱毒率达100%。生根、移栽成活率达97% 以上。
优选方案是：试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法包括草莓的试管苗在试管内培养基诱导匍匐茎，培养温度22℃，培养45 天；然后将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为56 ℃的恒温培养箱中进行85 天高温培养处理后，再切取1.0 mm的茎尖在培养基中进行茎尖愈伤组织诱导，温度24℃，培养30天；然后将茎尖愈伤组织转接到培养基进行愈伤组织芽苗再分化培养，温度24℃，培养35天得再生芽苗。
所述试管内培养基为LS+6-BA1.00 mg·L-1+GA31.90 mg·L-1+KT1.00 mg·L-1。
所述的茎尖愈伤组织诱导的培养基为MS+6-BA0.50 mg·L-1+NAA 0.20 mg·L-1。
所述的愈伤组织芽苗再分化培养基为MS+6-BA1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。
本发明的优点是：为了避免剥离极小茎尖的困难和可操作性难等问题，本发明在试管内对试管苗进行了匍匐茎的诱导，诱导率为99.5%以上，同时进行了高温处理结合较大茎尖(1mm)脱毒的方法对该新品种草莓进行脱毒体系的建立。本发明试验还采用均匀设计法对影响该新品种试管内诱导匍匐茎发生的激素浓度配比和温度及培养时间进行优化组合筛选，以期获得试管内诱导匍匐茎发生的最佳激素浓度配比和温度及培养时间，并在试管内利用适宜大小的茎尖进行高温处理获得无病毒生产苗。为草莓等经济作物脱毒奠定基础和提供新方法。该种方法是草莓脱毒苗工厂化快繁生产的一条简便易行的脱毒实用方法，避免了以往茎尖培养与高温处理相结合脱毒法存在的问题，脱毒率达100%，生根、移栽成活率达97% 以上。
下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施方式
试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法：
1材料与方法
1.1 试材：深山草莓花瓣愈伤组织诱导产生的优质、丰产性状遗产稳定的变异株系，其品种特性为：植株大，生长健壮，多级花序，每支花序4-5朵花，花瓣易落，果形圆锥近心形。酸甜适中，香味浓郁。果皮红色，富有光泽，韧性强，果皮硬度极大，含糖9.7-11.3%，可溶性固形物10.6-14.3%，维生素C129.4 mg/100 g，一级序平均单果重62.4 g，最大果重90 g。花芽分化和形成比其他现有品种早，断根处理能促进花芽分化。花器大，花粉量多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例极高(图1a, b)。
1.2 方法
1.2.1匍匐茎诱导培养基的筛选 以LS为基本培养基，内含蔗糖20 g·L-1，琼脂粉7.0 g·L-1，再附加不同质量浓度的细胞分裂素6-BA(由预试验确定为1.00～1.50 mg·L-1)、赤霉素GA3(由预试验确定为1.20～1.80 mg·L-1)和激动素KT(由预试验确定为0.30～0.70 mg·L-1)，调节pH为6.0，外植体在温度(22±2) ℃、光照强度25μmol·m-2·s-1、光照周期10 h·d-1条件下培养，为了提高该新品种草莓试管苗匍匐茎的诱导速度和诱导率，采用均匀设计法，选用U10(103)均匀表，每个处理接种试管苗为30株，重复3次，诱导率取平均值。考察6-BA、GA3和KT不同质量浓度交叉配比对匍匐茎诱导率的影响，结果见表2。试管苗培养45 d统计匍匐茎诱导率，筛选最适合新品种草莓试管苗匍匐茎诱导的培养基。
1.2.2 高温结合茎尖脱毒 以将带有匍匐茎的试管苗接种于1/4LS培养基中，加入蔗糖10 g·L-1，琼脂7.0 g·L-1，调节pH为6.0，在温度为35～50 ℃条件下，培养30～80 d。为了提高试管苗匍匐茎尖的脱毒率，选用U11(112)均匀表，每个处理接种茎尖数为30株，重复3次，脱毒率取平均值。同时考察培养温度和培养时间对脱毒率的影响，结果见表2。经过处理的茎尖再切取1.0 mm茎尖，在培养基MS+6-BA0.50 mg·L-1+NAA 0.20 mg·L-1中进行茎尖愈伤组织培养，再将愈伤组织转接到培养基MS+6-BA1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1进行愈伤组织芽苗再分化培养，将再生芽苗进行病毒检测，选择无病毒苗用于栽培生产，同时确定最适合的脱毒条件。其中NAA为α-萘乙酸。
1.3 数据处理与分析
采用均匀设计法进行初步规律设计性试验，数据分析处理应用均匀设计软件(Uniform Design 3.0V)。
2 结果与分析
2.1 LS培养基中6-BA、GA3和KT浓度配比对草莓试管苗匍匐茎诱导的影响
由表1试验结果可得回归方程Y=-0.393-20.1X 1+51.9X 2+33.3X 3，样本容量Ｎ=10，显著性水平α=0.05，经计算，复相关系数Ｒ＝0.9939，剩余标准差s=1.79，检验值Ｆ t ＝163.6，临界值Ｆ (0.05,3,6)＝4.757，Ｆ t ＞Ｆ (0.05,3,6)，表明回归方程有意义。对各方程项进行显著性检验可知：各方程项对Y影响均显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X 1=1.00，X 2=1.80，X 3=0.70，在此组合基础上求得最优解：y=96.3，此解为回归方程的解析解，需按公式Y=y±u α ·s(其中u α 为正态分布的双侧分位数，s为剩余标准差)计算出优化值区间估计为Y=96.3±4.37，即91.93%～100.67%。计算各方程项对回归的贡献值可知，U 1＝97.0，U 2＝925，U 3＝193，即6-BA、GA3和KT对回归的贡献率为U 1/U＝6.20%，U 2/U＝59.1%，U 3/U＝12.4%，说明GA3对草莓试管苗匍匐茎诱导的贡献远远大于6-BA和KT。又因6-BA与诱导率呈负相关，GA3和KT均与诱导率呈正相关，猜测GA3在1.80 mg·L-1以上有较高诱导率的峰值，又以TDZ为1.80、1.85、1.90、1.95和2.00 mg·L-1，6-BA为 0.50、0.60、0.70、0.80、0.90和1.00 mg·L-1以及KT为0.70、0.80、0.90和1.00 mg·L-1做了12个处理的试验，发现GA3为1.90 mg·L-1和6-BA为1.00 mg·L-1及KT为1.00 mg·L-1时匍匐茎诱导率最高。因此，将新品种草莓试管苗接种到附加GA31.90 mg·L-1和6-BA1.00 mg·L-1及KT1.00 mg·L-1的LS培养基上进行试管苗匍匐茎诱导的验证试验，重复3次。培养10 d，试管苗基部开始增粗；继续培养至33 d，从试管苗的苗心发出2～3条匍匐茎，33 d后匍匐茎可长至2.0 cm以上，诱导率达99.5%以上，在估计区间内，且比表1中10个处理的诱导率均高。因此，该新品种草莓试管苗匍匐茎诱导的最佳培养基为：LS+6-BA1.00 mg·L-1+GA31.90 mg·L-1+KT1.00 mg·L-1。
表 1 草莓试管苗匍匐茎诱导培养基的U10(102)均匀设计试验安排与结果
2.2 温度和培养时间对草莓脱毒的影响
根据表2试验结果可得回归方程Y=-101+2.99X 1+0.608X 2，样本容量Ｎ=11，显著性水平α=0.05，经计算，复相关系数Ｒ=0.8579，剩余标准差s=10.3，检验值Ｆ t ＝11.15，临界值Ｆ (0.05,2,8)＝4.459，Ｆ t ＞Ｆ (0.05,2,8)，回归方程显著。对各方程项进行显著性检验可知，各方程项对Y影响均显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X 1=50.0，X 2=80.0，在此组合基础上求得最优解：y=97.2，此解为回归方程的解析解，同理，按公式Y=y±u α ·s计算出优化值区间估计为Y=97.2±23.7，即73.5%～120.9%。计算得各方程项对回归的贡献值和回归贡献率分别为：U 1＝2.06e+3，U 1/U＝87.3%，U 2＝923，U 2/U＝39.1%，即高温温度对脱毒率Y的贡献大于培养时间，通过回归分析结果可知，温度与培养时间均与脱毒率呈正相关。猜测处理温度高于50 ℃和培养时间超过80 d有较高的脱毒率，为此，又以温度为50、53、56、57和60 ℃以及培养时间为80、85和90 d做了10个处理的试验，发现温度为50 ℃和培养时间为85 d时脱毒率最高且苗在培养基中生长良好。因此，将带有匍匐茎的试管苗在温度为56 ℃的恒温培养箱中培养85 d后切取1.0 mm的茎尖在培养基MS+6-BA0.50 mg·L-1+NAA 0.20 mg·L-1中进行茎尖愈伤组织培养，待茎尖完全脱分化形成愈伤组织后，再将愈伤组织切割成小块转接到培养基MS+6-BA1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1进行愈伤组织芽苗再分化培养，将再生芽苗进行病毒检测，草莓斑驳病毒和皱缩病毒脱毒率达100%。在估计区间内，且比表2所列11个处理的脱毒率均高。可见，该新品种草莓完全脱除斑驳病毒和皱缩病毒的最佳培养条件为：将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为56 ℃的恒温培养箱中处理85 d。
表 2 草莓高温结合茎尖脱毒的U11(112)因素及水平设计
待再生芽苗长至2.00 cm以上时，将芽苗从愈伤组织上切下，接种到1/2MS+IAA0.05 mg·L-1培养基上进行生根培养，待根长至1.00 cm，苗高达3.00 cm以上时，将生根苗从培养瓶中取出，在含有5 mg·L-1高锰酸钾溶液中洗去根上残留的琼脂，然后植入经100倍杀毒矾消毒过的田园土和河砂(3:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在(18±2) ℃，每天自然光照9 h，每天通风换气一次，7 d后可揭去薄膜，每天傍晚喷洒清水1次，成活率达97% 以上。待苗长至10 cm时(一般含有5片叶)，定植于畦上(严格防治虫害)，每年取匍匐茎苗作为草莓生产苗，经多年的栽培观察，品种特性稳定。栽培试验同时证明了在试管内进行高温处理结合茎尖脱毒方法是草莓脱毒和建立草莓无毒生产苗体系的一种可操作的实用方法。
3结论与讨论
本试验结果表明，培养基LS+6-BA1.00 mg·L-1+GA31.90 mg·L-1+KT1.00 mg·L-1对新品种草莓试管苗匍匐茎诱导的效果最好，诱导率达99.5%以上，这可能是适当的6-BA、GA3和KT可促进并调节草莓试管苗向匍匐茎分化等原因。将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为56 ℃的恒温培养箱中处理85 d，可完全脱除草莓斑驳病毒和皱缩病毒，且草莓植株的器官形态较好，这可能是在封闭的培养瓶中有草莓生长和发育较适宜的湿度、营养物质、生长调节物质和自身内源激素等物质的调节作用所致。
目前，草莓脱毒研究大多集中在茎尖脱毒、花药培养脱毒、高温处理和药处理等方面。茎尖脱毒需采用0.30 mm茎尖，且茎尖越小脱毒效果越好，但成活率低，况且剥离茎尖难度大，操作易被污染，所需时间较长，工作效率低；高温脱毒法是利用病毒粒子不耐高温的特点，使用高温使病毒粒子钝化失活的原理来灭活病毒。高温脱毒后的脱毒率仅60%～70%。由于温度难以控制且各病毒对温度的敏感范围不同很难控制。况且高温处理时间长、效果差，长时间在高温下的草毒无湿度保障、营养失调和根部上热等导致植株死亡，植株不易分化匍匐茎或匍匐茎生长不良，操作很麻烦；通过草莓花药愈伤组织诱导再生植株的途径被作为脱毒手段以来，国内外不少单位进行了草莓花药培养的研究，并培育了春夏秋冬香、宝交、早生、达娜等品种的花药脱毒苗。尽管多数学者认为，花药培养的脱毒率为100%。但有些学者发现花药培养的脱毒率虽然很高，但并不能达到100%，并发现花药培养的植株带轻型黄边病毒，这可能是花药培养达不到完全脱毒的原因；而抗病毒药剂法是一种新的脱毒方法，其作用原理是将草莓茎尖在三氮唑核苷(病毒唑)、5-二氢尿嘧啶(DHT)和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)等抗病毒药剂于三磷酸状态下处理嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养诱导再生植株的方法，这样可阻止病毒RNA帽子结构形成。但此方法涉及到所用药剂的选择性、药剂对草莓植株遗传物质的改变和药剂在草莓植株体内的残留等问题有待于进一步深入研究。相对于以上方法茎尖培养与热处理结合脱毒，是草莓较好的脱毒方法，许多对其进行了广泛的研究。但得到的脱毒效果不尽相同，但均达到90%以上，这可能与热处理方式、茎尖大小和品种有关。可见，茎尖培养与高温处理相结合比单纯的高温处理或茎尖培养脱毒率高得多。但此种茎尖培养与热处理结合脱毒的方法存在高温处理的温度低病毒钝化率低，处理后茎尖外植体消毒难且经过消毒的茎尖成活率极低，不易操作。为此，本研究对茎尖培养与热处理结合脱毒的方法进行改良，即利用深山草莓花瓣诱导产生的已感染了斑驳病毒和皱缩病毒的新品种草莓的试管苗在试管内诱导匍匐茎，然后将带有匍匐茎的试管苗在试管内直接进行高温处理，高温处理后再切取1 mm的茎尖进行培养诱导无毒再生植株的方法，并通过多次试验、病毒检测和栽培观察脱毒率达100%。证明了该种方法是草莓脱毒苗工厂化快繁生产的一条简便易行的脱毒实用方法，避免了以往茎尖培养与高温处理相结合脱毒法存在的问题。同时本试验应用均匀设计法处理和分析数据，缩短了试管内诱导匍匐茎发生和温度及培养时间的筛选周期。在加大科研力量培育出优质、高产、多抗的草莓新品种的同时。还要积极开展草莓脱毒研究，本研究结果可能对其它种草莓的脱毒和工厂化育苗有一定的参考意义。
Claims (2)
1.一种试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法，其特征在于包括草莓的试管苗在试管内培养基LS+6-BA1.00mg·L-1+GA31.90mg·L-1+KT1.00mg·L-1诱导匍匐茎，培养温度20-24℃，培养33～45天；然后将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为50～56℃的恒温培养箱中进行80～85天高温培养处理后，再切取0.5～1.0mm的茎尖在培养基MS+6-BA0.50mg·L-1+NAA 0.20mg·L-1中进行茎尖愈伤组织诱导，温度22-26℃，培养28～35天；然后将茎尖愈伤组织转接到培养基MS+6-BA1.00mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1进行愈伤组织芽苗再分化培养，温度22-26℃，培养30～40天得再生芽苗。
2.按照权利要求1所述的试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法，其特征在于草莓的试管苗在试管内培养基LS+6-BA1.00mg·L-1+GA31.90mg·L-1+KT1.00mg·L-1诱导匍匐茎，培养温度22℃，培养45天；然后将带有匍匐茎的试管苗在培养瓶中于温度为56℃的恒温培养箱中进行85天高温培养处理后，再切取1.0mm的茎尖在培养基MS+6-BA0.50mg·L-1+NAA0.20mg·L-1中进行茎尖愈伤组织诱导，温度24℃，培养30天；然后将茎尖愈伤组织转接到培养基MS+6-BA1.00mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1进行愈伤组织芽苗再分化培养，温度24℃，培养35天得再生芽苗。
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