CN108293879A - 一种甘遂的快速繁殖方法 - Google Patents
一种甘遂的快速繁殖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108293879A CN108293879A CN201810360508.0A CN201810360508A CN108293879A CN 108293879 A CN108293879 A CN 108293879A CN 201810360508 A CN201810360508 A CN 201810360508A CN 108293879 A CN108293879 A CN 108293879A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- root
- culture
- gansui
- iba
- callus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 claims description 10
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 18
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035784 germination Effects 0.000 abstract description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 47
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 31
- 239000000463 material Substances 0.000 description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 23
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 17
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 13
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 12
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000399949 Ditylenchus dipsaci Species 0.000 description 3
- 244000043261 Hevea brasiliensis Species 0.000 description 3
- 240000005001 Paeonia suffruticosa Species 0.000 description 3
- 235000003889 Paeonia suffruticosa Nutrition 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 241001093951 Ailanthus altissima Species 0.000 description 2
- 241000221079 Euphorbia <genus> Species 0.000 description 2
- 241000221017 Euphorbiaceae Species 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000701408 Euphorbia kansui Species 0.000 description 1
- 244000072347 Fraxinus griffithii Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000245654 Gladiolus Species 0.000 description 1
- 244000245214 Mentha canadensis Species 0.000 description 1
- 235000001878 Mentha haplocalyx Nutrition 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000409198 Packera aurea Species 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 1
- 240000000851 Vaccinium corymbosum Species 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 210000000081 body of the sternum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012174 chinese wax Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 1
- -1 diterpene lipid Chemical class 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种甘遂的快速繁殖方法，以去除顶芽并带腋芽原基的茎段为外植体，先在培养基(MS+6‑BA 1.0mg/L+IAA 3.0mg/L)中诱导出丛生芽；待丛生芽高为5cm时，将其切成1cm长的单芽，置于培养基(MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L)中进行壮苗培养；当单芽生长至有5‑7枚叶片时，切取其顶端长为2cm的带叶小段，置于(1/2MS+IBA 0.5mg/L)或(1/2MS+IBA 1.0mg/L)中进行生根培养。该方法萌发效率高，繁殖系数高，育苗速度快，可为甘遂的人工栽培提供大量的种苗，减少对其野生资源的破坏。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种甘遂的快速繁殖的方法。
背景技术
甘遂(Euphorbia kansui Liou)是大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)的多年生草本植物，是我国特有的一种传统中药，在历代本草中均有记录[中国科学院西北植物研究所编著，1974]。其药用价值始载于《神农本草经》[神农本草经，1995]，入药部位是干燥块根，苦寒有毒，可治疗水肿、咳喘、肿瘤、大小便不通等病症，具除水、利尿、通便等药用功效。现今甘遂集中分布在山西、陕西、河南、宁夏和甘肃等地，其中陕西为优秀甘遂的主产地[权宜淑，1994]，多生于田埂、低山坡、沙地和路旁等。近年来研究发现甘遂乳汁中含有多种有效化学成分，如二萜脂类，可显著地抗癌、抗病毒等[Dickenson and Fairbaim,1975；潘勤和闵知大，2003；郑维发，2004]，因此甘遂被视为重要的抗癌、抗病毒药材，收录于历版《中华人民共和国药典》中[中华人民共和国卫生部药典委员会，2015]。但是，甘遂种子萌发率低，大面积繁殖收到了限制，因此，需要建立一种快速繁殖的方法满足市场对甘遂药材原植物的需要。
广义的植物组织培养是无菌前提下，将离体的器官如根、茎、叶、花、果实等作为外植体或植物体原生质体放入人工配制的培养基上培养，在适当条件下，使其形成完整的植株，也叫作植物的离体培养。完整过程是：器官或组织通过脱分化产生愈伤组织，愈伤再分化出现新的组织或器官，长成完整植株。植物组织培养是建立转基因体系的前提和基础。一般以器官或分生组织等为外植体的再生途径有两种：直接诱导外植体长出器官，长成植株，即器官发生(organogenesis)和诱导体细胞胚胎的发生，进而完成植株再生，即胚状体发生(embryogenesis)。植物组织培养可在短时间内快速获得大量的无菌苗，不仅缩短了时间，且保留了植株母体的优良性状。植物细胞和组织培养现也已成为用于生产和积累许多有价值的生物活性化合物的替代系统，这种系统安全且低成本，因为它有许多益处以使化合物在自然生产过程的诸多问题最小化，从而允许这些化合物可以连续、可靠和可预测的生产，并且在良好的控制条件下可以不受季节变化的影响优化和增强它们的生物合成[et al.,2009]。
影响植物组织培养的主要因素有：
1.1外植体的选择及消毒
选择合适的外植体，是直接决定组织培养成功的第一步。理论上植物体的任何器官或组织都具有全能性，都可以重新分化形成新的植物体，但植物不同器官或组织、不同发育阶段和不同的生理状态时具有的脱分化和再分化的能力存在极大的差异。外植体的取材部位、材料处理大小及采集材料的时间等也影响了组织培养的成败。
在器官或组织越幼嫩的时期，其分化程度越低，越容易诱导出愈伤组织，因此大多数实验中一般选择幼嫩茎段。但由于幼嫩茎段在消毒时损伤较多，且有些植物含有复杂的次生代谢产物，直接诱导愈伤组织比较困难，因此很多研究者选择带腋芽原基的茎段先进行快繁培养，再用快繁所得的无菌苗作为材料来摸索愈伤诱导的条件。研究发现中部的腋芽比顶芽和基部芽的诱导率和增殖率都高[蔺红苹和吴飞凤，2010；周庆华等，2011]。在外植体消毒时，暴露的伤口越小，消毒剂对其的伤害越少，褐变程度就越轻。所以一般情况下，切茎段为1.5cm长的小段。外植体的采集时间对组培的成功也很重要，植株一般在生长力强盛的季节，再生的能力也非常强，在这个时间点采集的外植体材料，污染率低，极易成活[毕君等，2013；王非等，2012；王尚堃等，2010]。赵鑫等(2007)在研究中发现2月份左右的外植体材料，菌少，容易消毒，且后期长势较好，反而8-10月份的休眠芽材料，极易染菌且生长缓慢，也很容易褐化。张玉娇等(2009)在黄冠梨组织培养的研究中发现，在初代培养阶段4月初取样的外植体比5月底的污染率低3倍，褐化率低3.5倍，钟宇等(2001)发现西洋杜鹃外植体取材效果最佳的时间是3-5月，还有研究发现在3月下旬到4月上旬取茎段效果较好[王蔚琼，2013]。
外植体的表面消毒及其内生菌的灭菌对组培成功的影响也是非常重要的[姜泽海等，2011]。消毒剂的种类、消毒的时间长短都对消毒效果影响很大[宗娟，2010]。因此，在实验中，要根据实验材料的特殊性采取适合的消毒剂及消毒时间。在大戟科橡胶树中，花药是组培最常用的外植体，常见的消毒程序是：先在75％乙醇中泡30-60s，再在0.1％-0.2％升汞中浸10-15min，最后用无菌双蒸水涮洗4～5遍[谭德冠等，2011]。
1.2基本培养基的选择
培养基是组织培养的物质基础，组培成功与否，一方面由外植体的性质决定，另一方面与培养基及成分密切相关。李素华等(2009)在常青白蜡(Fraxinus griffithii)组织培养研究中表明基本培养基是诱导芽分化的重要条件。现常见的培养基有很多种，如：MS、1/2MS、WPM、White、B5、N6、KT、KM-8P、LP和SH等。在诱导愈伤和培养再生植株时常用的的培养基为MS、1/2MS和WPM，其中MS培养基应用最广。培养基又有固体培养基(一般适合幼胚、花药、内珠被、未受粉胚珠和子房、根、茎尖、嫩茎及叶片的培养)和液体培养基(适合悬浮细胞培养或原生质体诱导胚愈伤)两种。陈峰等(2013)在培养基和调节剂对臭椿(Ailanthusaltissima)组织培养的影响研究中发现，MS、1/2MS、WPM、N6和B5这5种基本培养基的诱导情况不同，其中N6效果最好。因此要根据培养目的并结合采集外植体的部位来选择恰当的培养基[王慧英，2010]。当物种比较特殊时，可适当改良培养基。
培养基的pH值对组培的影响也是非常大的。pH值直接决定酸碱度，也影响组培材料对营养的吸收[李浚明，2002]。不同的植物材料可能需要不同的pH值环境，大多在5.0-6.5。廉家盛等(2010)在蓝莓(Semen Trigonellae)“美登”组织培养研究中发现其最适的pH值为5.4。
1.3植物生长调节剂的选择
培养基中的植物生长调节剂是必不可少的，主要用到的是生长素和细胞分裂素。根据不同的材料来调节二者的比例来达到不同的目的，这是组培的关键，也是较难把握的因素。常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D等，细胞分裂素有6-BA和KT等。虽然各种生长素和细胞分裂素的作用有相对的专一性，但在相互作用时有重叠和互补效应[Bai and Qu,2001；唐小艳等，2006]。
在大多数植物组培中，当二者的浓度比较接近时，可以诱导愈伤产生；当细胞分裂素浓度高，生长素浓度较低时，可以作为启动培养基，诱导茎段腋芽或顶芽形成，也可以作为增殖培养基；在生根时，二者的浓度为零或很低均可产生根。在橡胶树的花药愈伤诱导中，谭德冠等(2011)认为2,4-D是必须的。在复杂的胚状体分化过程中，王泽云等(1978)认为KT与NAA的组合是非常有利的。薛寒青等(2008)在唐菖蒲(Vaniot Houtt)的组培过程中发现植物生长调节剂的种类及浓度对其芽的增殖培养作用很大。李格等(2004)在激素对薄荷(Mentha haplocalyx)组培影响的研究中发现当6-BA在0.5-5.0mg/L时，有利于诱导出茎段芽，且随着浓度的升高，诱导率升高；当NAA在0.05-1.0mg/L时，有利于苗的生长；当6-BA2.0mg/L+NAA 0.1mg/L时，诱导芽的效果最佳。孙爱花等(2012)在橡胶树叶片愈伤诱导实验中发现，培养基中不加或者只加一种生长调节剂时，不能诱导出愈伤，在NAA1.5mg/L+6-BA1.0mg/L的培养基中，诱导率最高。
1.4褐化的控制
褐化现象是植物中的酚类被氧化为醌类所致，也就是切口上出现棕褐色物质的现象。褐化不仅影响外植体的愈伤诱导，而且也影响继代和增殖培养，严重时导致其他酶系统失活，引起代谢紊乱，从而导致细胞死亡[张俊琦和罗晓芳，2006]。在外植体脱分化或再分化时，这是很常见的现象。
导致植物材料褐化的原因复杂且多[李新凤等，2010]。郭艳茹等(2008)发现褐化与植物的基因、外植体年龄、植株部位、外植体的损伤程度有关，也与培养条件如温度、光照和培养基成分等密切相关。因此选择合适的材料部位，是减少褐化的一个关键且简便的方法。
吴丹(2007)在牡丹(Paeonia suffruticosa)的组培中发现绣球型比单瓣型更容易褐化，因此认为花型复杂，花色深的品种比其他品种的褐化程度及频率都要高。通常番茄(Lycopersicon esculentum)中7d－9d苗龄的子叶最合适建立快繁体系[常婧，2015]。一般情况下，当材料处理的过小或者材料过老时，褐化会很严重，分化程度高的真叶和苗龄较大的子叶也容易发生褐变。牡丹的组培研究中发现NaClO消毒处理的外植体褐化水平较高。随着消毒时间的增长，消毒剂对材料的伤害加深，材料的受损程度也升高，从而导致褐化加剧。但消毒时间短，会导致消毒不彻底，材料污染率极高，因此需要根据材料选择恰当的消毒剂和消毒时间，减少污染的同时减轻褐变。可以选择在处理材料时，尽量保证适当减少伤口且伤口平齐。温度对愈伤组织褐化的影响主要是温度过高，PPO的活性升高，褐化现象就加剧[刘兰英，2002]。低温可以有效减少褐化的产生。因此大多数研究都选择可以减少褐化的最适培养温度28℃。
目前在甘遂的器官结构和发育、化学成分、药理作用及临床应用等几大方面的具有大量的研究，虽然，在传统培育中，甘遂种子具有难以萌发，萌发率较低的现象，因此，繁殖率低，繁殖速度慢，耗种量大，但目前还没有任何提高其产量的有效培育方法的报道及应用。采用组织培养技术，可以快速繁殖大量种苗，满足药材的市场对甘遂的需要。我们筛选了甘遂快速繁殖的最优条件，得到快繁的无菌苗，为甘遂更好的开发利用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是建立甘遂一种有效的快速繁殖的方法，筛选出甘遂快速繁殖的最优条件，得到快繁的无菌苗，为甘遂更好的开发利用奠定基础。
本发明所采用的技术方案是，一种甘遂的快速繁殖方法，以去除顶芽并带腋芽原基的茎段为外植体，先在含有1.0mg/L 6-BA，3.0mg/L IAA的MS培养基中诱导出丛生芽；待丛生芽高为5cm时，将其切成1cm长的单芽，置于含有1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA的MS培养基中进行壮苗培养；当单芽生长至有5-7枚叶片时，切取其顶端长为2cm的带叶小段，置于含有0.5mg/L IBA的1/2MS培养基或含有1.0mg/L IBA的1/2MS培养基中进行生根培养。
进一步地，培养前，先进行消毒处理，消毒过程如下：(1)70％乙醇浸泡10s；(2)无菌水洗2次；(3)0.08％升汞消毒8min；(4)无菌水涮洗5遍。
进一步地，丛生芽培养阶段的诱导率为89.46％，增殖系数为8.93。
进一步地，在1/2MS+IBA0.5mg/L培养基中，初代生根率为28.15％。
进一步地，在1/2MS+IBA 1.0mg/L培养基中，初代生根率为35.01％。
本发明的有益效果在于：萌发效率高，繁殖系数高，育苗速度快，可为甘遂的人工栽培提供大量的种苗，减少对其野生资源的破坏。
附图说明
图1为几组不同激素组合诱导的愈伤组织；其中，A：第1组的茎段，25d；B：第1组的茎段，培养25d后挑出愈伤换入新的培养基中再10d；C：第5组的茎段，25d；D：第7组的茎段，25d；E：第11组的茎段，25d；F：第14组的茎段，20d；G：第14组的叶片，30d；H：第16组的茎段，25d；I：第17组茎段，25d。标尺＝1cm。
图2为几组不同激素组合诱导的芽；其中，A：第1组，35d；B：第3组，35d；C：第4组，7d；D：第4组，35d；E：第5组，35d；F：第8组，35d；G：第10组，7d；H：第10组，30d；I：第11组，30d。标尺＝1cm。
图3为不同激素对生根的影响；其中，A：第3组，30d；B：第6组，30d；C：第7组，30d；D：第13组，30d；E：第13组，58d；F：第14组，17d；G：第14组，58d；H：第21组，30d；I：第30组，13d。标尺＝1cm。
具体实施方式
1消毒条件的筛选及无菌材料染菌的处理
1.1外植体的选择及消毒条件筛选
外植体材料在每年秋冬两季染菌严重，导致消毒困难，且存活率极低，因此选用3～4月份的茎段或叶片为外植体。
经过消毒条件的摸索，发现以幼嫩叶片和茎段为外植体时，70％乙醇浸泡10s的效果最好，且时间必须严格控制在10s，因为随着时间的延长，外植体的污染率虽然降低，但脱水逐步加重，褐化率升高，最终材料死亡(表1)。
表1 70％乙醇不同时间对甘遂外植体的影响
乙醇初步消毒后，再用次氯酸或升汞消毒，设计了9组处理，通过对这9种消毒方法的数据进行方差分析和多重比较(表2)发现，当以叶片做外植体时，选择1％次氯酸消毒8min或0.08％升汞5min，次氯酸虽然消毒比较温和，漂洗后残留较少，但消毒效果不如升汞，如次氯酸消毒8min后存活率为12.27％，升汞消毒5min后存活率略高些，为17.86％，且与其他处理组比较，差异显著。因此，对于甘遂叶片和茎段，均选择升汞进行消毒。升汞进行消毒时，虽然污染率随着时间的延长而降低，但褐化率越来越高，且外植体的存活率也降低了，当茎段作为材料时，消毒8min时的存活率为21.31％，而增加2min后，存活率降低为6.44％。因此根据甘遂的不同部位作为外植体材料时，需要确定合适的消毒时间：叶片作为外植体时，升汞消毒5min；茎段，升汞消毒8min。
表2不同消毒处理对甘遂外植体的影响
最终确定消毒程序如下：(1)70％乙醇浸泡10s；(2)无菌水洗2次；(3)0.08％升汞消毒：叶片消毒5min，茎段消毒8min；(4)无菌水涮洗5遍。
3.2.1.2染菌处理
当材料染了农杆菌等细菌，可用200mg/L头孢溶液处理10min(切勿时间过长，会影响无菌材料的生长)；当染了霉菌等有孢子的真菌，必须在高温灭菌锅中灭菌后丢弃，避免孢子引起二次污染。
2不同激素组合的愈伤诱导情况
通过统计不同激素配比的实验数据(表3)和培养数天后的愈伤变化情况(图1)发现，不同的激素浓度配比对诱导愈伤、愈伤生长状况及褐化的影响差异较大，其中2,4-D、IAA和NAA分别与6-BA组合的愈伤诱导能力大小为：2,4-D>NAA>IAA，且诱导出的愈伤组织质量也为：2,4-D>NAA>IAA。IAA和6-BA组合时，外植体一周后出现愈伤组织，且愈伤为绿色，致密的颗粒状组织(图1-A)，生长缓慢(图1-A,B)，不适合之后用作分化材料；NAA和6-BA组合诱导时，外植体同样是一周左右出现愈伤，且当浓度为1.0mg/L时，愈伤是绿色，致密的团状组织，生长缓慢；当浓度增加到2.0mg/L时，愈伤则变为淡绿色，疏松的颗粒状组织，适合之后分化，但出愈率不是很高(图1-C)；当NAA与IAA共同与6-BA作用时，诱导出的愈伤质量也很好，为淡绿色，疏松的颗粒状(图1-D)；2,4-D和6-BA组合诱导时，当6-BA浓度固定，随着2,4-D浓度的升高，出愈率增高，但当2,4-D增大到5.0mg/L时，茎段或叶片的愈伤诱导受到阻碍，基本不产生愈伤组织或产生极少的愈伤(图1-E)；当2,4-D浓度固定时，随着6-BA浓度的降低(即二者差距缩小时，但6-BA浓度须高于2,4-D浓度)，出愈率升高：在2,4-D浓度为0.1mg/L，6-BA分别为5.0mg/L和2.5mg/L时，出愈率都很低，但当6-BA的浓度为1.0mg/L时，出愈率增加到17.79％，且愈伤质量也很好(图1-H)。因此诱导愈伤时，6-BA的浓度要高于2,4-D。由表3可以看出，同样的激素条件处理下，茎段整体比叶片更容易诱导出愈伤组织。在2,4-D与6-BA组合处理时，大多数处理组中的茎段3天就开始膨大，都诱导出愈伤组织，其中第17组(MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L)的诱导率达到最高，为67.89％，可后期观察发现，其培养到25天时褐化较严重(图1-I)，而诱导率(60.88％)次之的14组，愈伤在20天时褐化程度最轻，生长较快，呈黄白色的颗粒状(图1-F)。叶片在培养第3天时，只有第9、10、11和12组中大部分叶片膨大，在第7天时其余组叶片也开始膨大，之后越来越多的黄绿色愈伤出现。叶片愈伤诱导中，也是第14组的诱导率最高，褐化程度最轻(图1-G)。因此，最终茎段和叶片均选用第14组(MS+6-BA 2.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L)为甘遂愈伤诱导的最佳培养基组合。
表3不同激素组合对诱导愈伤的影响
3甘遂的快繁培养
3.1不同激素组合的快繁诱芽情况及增殖培养
快繁培养时，对其生长状态观察发现，带腋芽茎段大多7天就可以看到不定芽的突起(无顶芽)，IAA和6-BA组合诱导的芽均为基部丛生芽，繁殖系数为2～8，即由一个茎段长出平均2～8个不定芽，生长较快，茎为绿色，纤细(图2,A-F)，由表4可知，当6-BA浓度固定时，随着IAA浓度的升高，诱导率和增值系数均增高(图2,A,B,D和E,F)，其中第4组的诱芽率(89.46％)和增殖系数(8.93)均最高，茎生长快，绿色且较粗，叶明显(图2,C,D)，增殖培养观察发现，生长状态一致且稳定，因此选第4组诱导丛生芽；NAA和6-BA诱导的芽基本为单芽，茎为红色，较粗，叶较大(图2,G-I)。当6-BA的浓度为1.0mg/L时，茎生长较快(图2,G,H)，较粗，其中第10组的诱芽率非常高(89.39％)，当6-BA的浓度为0.5mg/L时，生长慢，叶片明显，但30d后茎中部的叶干枯，顶端叶卷曲(图2,I)。增殖培养发现，第10组的茎生长快，生长状态良好，因此选用第10组壮苗培养。最终茎段先在第4组培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA3.0mg/L)中诱导出丛生芽，生长到5cm时再切成1cm长的单芽，置于第10组培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L)中进行壮苗培养。
表4不同激素组合对芽诱导的影响
3.2不同激素对诱导快繁生根的影响
由于甘遂富含乳汁，且含丰富次级代谢产物，导致生根不易。因此将之前长的特别健康且粗壮的带叶茎段剪成2cm长的茎段，如此反复操作几次，可促进生根。
快繁培养诱导生根中，对其生长状态进行观察，统计不同处理下的生根率发现MS空白或MS加激素均不能诱导生根，1/2MS培养基更适用于甘遂诱根(表5，图3,I)，因此生根实验选择1/2MS培养基。用IAA在1/2MS培养基中诱导生根时，15天左右少数处理组中茎基部轻微愈伤化，仔细观察发现基部有根原基突起，根开始生长，随着IAA浓度加大，生根率和平均根数也呈增加趋势，在IAA为0.5mg/L时，生根率为10.84％，但根细弱，卷曲，待到30天时，根平均长约1cm(图3,A)，当IAA浓度增加到3.0mg/L时，茎基部并未产生愈伤，而是膨大，30天时的诱导率达到23.33％，平均生根3.71个，较粗短，不卷曲，但根生长慢，平均根长约为1cm(图3,B)，因此不使用IAA诱导生根。用NAA诱导生根时，同样是15天左右才看到根萌动，且生根率均不高，但根生长很快，当NAA浓度为0.05mg/L时，30天后根平均长度约为5cm，但细且卷曲(图3,C)，当增加到3.0mg/L时，长出愈伤根，生长缓慢，所以NAA也不适合诱导生根。用IBA诱导生根时，大多7天就可以看到根原基突起，诱导率比较高，且根生长较快，随着浓度的升高，生根率也增加，但当达到3.0mg/L时，基部严重愈伤化，生根率降低，且长出的根在第20天时也开始形成愈伤，其中当IBA浓度为0.5mg/L和1.0mg/L时，生根率及生根质量都较好：茎段在1/2MS+IBA 0.5mg/L中生长到第30天时，根粗且健壮，平均根长约4cm，(图3,D)，当生长到第58天时，根上长出很多绿色的芽(图3,E)；茎段在1/2MS+IBA1.0mg/L中，会出现两种根：少量的愈伤根和大量正常根，正常根生长到第17天时长2cm(图3,F)，生长到第30天时发现有少数主根生出侧根，这是唯一一组出现侧根的，继续生长到58天时，根基部也出现芽，比1/2MS+IBA 0.5mg/L中的少，但芽已经长到4cm高(图3,G)。当IAA或NAA分别与GA3组合使用时，依然不能诱导生根。当IBA与GA3组合时，可以诱根，不过生根率较低，为13.33％，根粗，不卷曲，生长较快，平均长约3cm。当NAA与IBA组合时，生根率最高(36.67％)，但根细，比13或14组长的稍慢。很多研究表明，活性炭(AC)对诱导生根起很大作用，但在本实验中发现在1/2MS培养基中单独加入活性炭或再加入激素IAA或NAA时，均不能生根，反而影响茎段生长，加入IBA时，可以生根，但生根率比1/2MS+IBA的4组都低，根健康(图3，H)。在MS培养基中加入IAA或NAA，发现茎段除基部愈伤化外无变化，其中当IAA为3.0mg/L时，13天时茎段变化较小(图3，I)，30天时茎段基部形成大量愈伤，无根形成。因此，最终选择第13组(1/2MS+IBA 0.5mg/L)或第14组(1/2MS+IBA 1.0mg/L)为甘遂诱导生根的最佳培养基。
表5不同激素及培养基对生根诱导的影响
Table 13 Effects of different hormone and medium on induce root
Claims (5)
1.一种甘遂的快速繁殖方法，其特征在于，以去除顶芽并带腋芽原基的茎段为外植体，先在含有1.0mg/L 6-BA，3.0mg/L IAA的MS培养基中诱导出丛生芽；待丛生芽高为5cm时，将其切成1cm长的单芽，置于含有1.0mg/L6-BA，0.2mg/L NAA的MS培养基中进行壮苗培养；当单芽生长至有5-7枚叶片时，切取其顶端长为2cm的带叶小段，置于含有0.5mg/L IBA的1/2MS培养基或含有1.0mg/L IBA的1/2MS培养基中进行生根培养。
2.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，培养前，先进行消毒处理，消毒过程如下：(1)70％乙醇浸泡10s；(2)无菌水洗2次；(3)0.08％升汞消毒8min；(4)无菌水涮洗5遍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，丛生芽培养阶段的诱导率为89.46％，增殖系数为8.93。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1/2MS+IBA 0.5mg/L培养基中，初代生根率为28.15％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1/2MS+IBA 1.0mg/L培养基中，初代生根率为35.01％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810360508.0A CN108293879B (zh) | 2018-04-20 | 2018-04-20 | 一种甘遂的快速繁殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810360508.0A CN108293879B (zh) | 2018-04-20 | 2018-04-20 | 一种甘遂的快速繁殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108293879A true CN108293879A (zh) | 2018-07-20 |
| CN108293879B CN108293879B (zh) | 2021-06-01 |
Family
ID=62848602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810360508.0A Expired - Fee Related CN108293879B (zh) | 2018-04-20 | 2018-04-20 | 一种甘遂的快速繁殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108293879B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115968783A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-04-18 | 北京艾比蒂生物科技有限公司 | 一种彩叶大戟的快速繁殖方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103404432A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-11-27 | 张曦予 | 圣诞红的组织培养与快速繁殖方法 |
| CN104335900A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-02-11 | 南京帝道农业科技有限公司 | 一种甘遂诱变的繁殖方法 |
-
2018
- 2018-04-20 CN CN201810360508.0A patent/CN108293879B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103404432A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-11-27 | 张曦予 | 圣诞红的组织培养与快速繁殖方法 |
| CN104335900A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-02-11 | 南京帝道农业科技有限公司 | 一种甘遂诱变的繁殖方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JUAN SHEN等: ""The Chemical and Biological Properties of Euphorbia kansui"", 《THE AMERICAN JOURNAL OF CHINESE MEDICINE》 * |
| 王豆: ""甘遂2个ATG8同源基因的表达分析及愈伤培养和离体快繁培养"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115968783A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-04-18 | 北京艾比蒂生物科技有限公司 | 一种彩叶大戟的快速繁殖方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108293879B (zh) | 2021-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104335903B (zh) | 一种促进白及快速繁殖的方法 | |
| CN101803569B (zh) | 试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法 | |
| CN104813939B (zh) | 一种荷花再生体系的构建方法 | |
| CN101822220A (zh) | 一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法 | |
| CN101361459A (zh) | 去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法 | |
| CN105191792B (zh) | 扁桃斑鸠菊的快速繁殖方法 | |
| CN101548646B (zh) | 一种通过体细胞胚及次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法 | |
| CN113331059B (zh) | 一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法 | |
| CN107410024A (zh) | 一种油梨愈伤组织的诱导方法以及促进其芽分化的方法 | |
| CN106106178A (zh) | 一种糖果鸢尾的组织培养方法 | |
| CN111616049B (zh) | 一种草果组培育苗方法 | |
| CN108770688A (zh) | 一种千里香的快速繁殖方法 | |
| CN105993952A (zh) | 猪血木栽培苗快速繁育方法 | |
| CN103109745B (zh) | 一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法 | |
| CN102499082A (zh) | 东方百合种球的试管繁育方法 | |
| CN115885855B (zh) | 一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法 | |
| CN115606503B (zh) | 一种紫菀的组织培养方法 | |
| CN112602595A (zh) | 一种提高大蒜生长点分化不定芽数量的组培方法 | |
| CN107873517A (zh) | 一种通过芍药子叶诱导愈伤组织再生不定芽的方法 | |
| CN106577280A (zh) | 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗 | |
| CN108293879A (zh) | 一种甘遂的快速繁殖方法 | |
| CN102349438B (zh) | 黄金小神童的组培快繁育苗方法 | |
| CN107006372A (zh) | 香椿离体组织快速繁殖的方法 | |
| CN106665358A (zh) | 一种桔梗叶片的快速诱芽及组培繁殖方法 | |
| CN107568063B (zh) | 一种油料植物白檀组培快繁方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210601 |