CN100553445C - 新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法，属于植物组培快繁和杂交制种技术领域。该方法包括：培养基的制备，取百合未成熟胚为外植体，经诱导、增殖、鳞茎膨大培养、冷藏、移栽、病毒检测后，进而利用无毒试管鳞茎苗，进行大田种植、开花、杂交制种，获得大量新铁炮百合无毒种子。本发明的优点是：接种操作容易、污染率低、成活率高、种性变异率低、杂交制种纯度高，种子质量好，并缩短了诱导培养周期，降低了成本，实用性强，便于推广应用。

Description

新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法

技术领域

本发明涉及植物组培快繁和杂交制种技术领域，尤其涉及百合杂交组合的亲本试管鳞茎组培和杂交制种方法。

背景技术

新铁炮百合(Lilium formolongi)系铁炮百合与台湾百合种间杂交种(Lilium longflorum×L.formosanum)，至今，以其为基础又从中选育出了一批优良品系，主要用于切花栽培。该杂交种与普通百合最大的区别是可采用种子繁殖，其形态特性与铁炮百合相似，花大瓣厚、香气浓郁、花色洁白，花朵不同于铁炮百合侧向开放，多数为冲天怒放，并具有台湾百合生育期短，耐高温的特性，花期与铁炮百合完全错开，可弥补我国夏季高温的百合市场空缺，具有良好的市场开发前景。以往新铁炮百合杂交制种亲本一般采用自交留种或鳞片扦插繁殖，但长期连续自交繁殖易导致性状的退化，长期无性繁殖易受百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合无症病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)侵染，致使新铁炮百合种子生产受到很大限制。为了提高该百合杂交制种质量，适应大规模种植的需要，我们对杂交亲本材料进行了选育和组培快繁，进而利用亲本间的杂交获取大量优质的杂交种子，这对新铁炮百合的快速开发具有重要的意义。

百合组培与无毒苗生产的关键是脱毒技术和试管鳞茎膨大技术。以往获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒等多种方法以及它们间的相互组合方法。目前普遍采用的方法是茎尖培养脱毒法，常规的步骤是：通过植物顶端分生组织切取茎尖(0.2~0.3mm茎尖组织)，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织再分化鳞茎芽，通过增殖培养后，将鳞茎芽接种在添加少量AC(活性炭)的MS培养基上，得到生根脱毒苗或试管鳞茎是目前通常采用的方法。百合科百合属园艺种应用组培技术快速繁殖试管鳞茎已有成功的例子，并有相关的技术专利，例如，CN1762205A披露了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到东方百合脱毒鳞茎的方法，CN1695427A发明名称为″一种培育东方百合试管鳞茎的方法″公开了通过选择无病毒的鳞茎，采用鳞片接种进行无菌条件下培育鳞茎。

但是这两种脱毒组织培养法存在的问题是：前者需切取极小的茎尖分生组织作为外植体，但茎尖组织越小，成活率就越低，而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒，同时容易造成污染，此外，茎尖培养一般需先形成愈伤组织，再从愈伤组织分化不定芽(鳞茎芽)，由于经过愈伤组织培养阶段，一则易发生遗传变异不利于优良品种种性的保持，二则延长了组培苗的培育周期；后者选择生长健壮经检测不带病毒的鳞茎，直接进行鳞片诱导培养，易造成植物体内内生菌和真菌的污染，而且脱毒往往不彻底；因此，仍需要一种更有效、简便的脱毒方法。

以往利用种子未成熟胚作为外植体进行组织培养已在水稻、小麦等作物上取得成功，但不同的植物对培养基配方和培养条件等均有严格的要求。因此，故至目前尚未见到有关利用新铁炮百合杂交组合的父本与母本未成熟胚经组培快繁长成亲本试管鳞茎，并进而分别种植至开花、授粉、杂交制成种子的方法的研究报道，因此开发此项技术对提高新铁炮百合制种产量和质量有重要的价值。

发明内容

本发明目的是解决以往茎尖脱毒培养接种外植体微小导致成活率、脱毒率较低，和茎尖培养需经愈伤组织阶段形成鳞茎芽易发生遗传变异等的缺陷，提出一种利用百合种子不带毒的原理，分别以其杂交组合之父本与母本的幼胚为外植体经组织培养得到新铁炮百合的父本、母本试管鳞茎，并进而分别种植至开花、授粉、杂交获得新铁炮百合杂交种子的方法，以取代新铁炮百合常规的自交留种或鳞片扦插繁殖，并提高组培的成活率、缩短组培周期、减少遗传变异，提高其制种的产量和质量。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法，按如下步骤进行：

(1)培养基的制备、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：

a)基本培养基：诱导和增殖培养基选用白糖为30~60g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，pH为5.8；试管鳞茎膨大培养基选用白糖为70~90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，并另加甘露醇1.0~5.0g/L，AC1.0~5.0mg/L，pH为6.0；

b)诱导培养基：MS+6-BA 0.5~2.0mg/L+IBA 0.1~0.5mg/L；

c)增殖培养基：MS+6-BA 0.1~1.0mg/L+IBA 0.1~0.5mg/L；

d)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.1~0.5mg/L。

(2)外植体的选取与灭菌处理：分别取新铁炮百合杂交组合之父本与母本的自交未熟果子，经灭菌处理后，取其所含种子未成熟胚作为组培的外植体；

(3)诱导培养：将步骤(2)父本与母本的未成熟胚分别接种在诱导培养基上，在温度20±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000Lx的环境条件下，培养20~25d，子叶伸长至0.8~1.0cm，子叶基部形成白色鳞茎状组织时，再培养50d左右，不经愈伤组织阶段，直接形成鳞茎芽和/或无根组培苗；将组培瓶鳞茎芽和/或无根组培苗置于3~5℃低温处理45~60d，使鳞茎感应低温，促进组培苗生长活性提高；

(4)增殖培养：将步骤(3)鳞茎芽和/或无根组培苗的叶片和部分基部组织切除，根据鳞茎大小纵向分切成2~6块带有鳞茎基部组织的鳞茎切块，接种在增殖培养基上，在温度20±1℃，光照时间12h/d，光照强度1000~3000Lx的环境条件下，培养20d后，每个切块增殖2~5个鳞茎芽，再培养40d形成有根或无根组培苗；

(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)的有根或无根组培苗切除根和叶片，将鳞茎接种在鳞茎膨大培养基上，在温度20±2℃，黑暗条件下培养60~70d，直接生成直径0.8～1.2cm，重0.6~1.1g的父本和母本的试管鳞茎；

(6)低温处理：将步骤(5)试管鳞茎出瓶后用清水清洗，包裹于消毒过的泥炭中，经10~12℃预处理10~20d，再在3~5℃处理50~60d，至打破休眠；

(7)移栽：将步骤(6)试管鳞茎移栽到以70％泥炭和30％珍珠岩混合基质的穴盘中，至幼苗长3~5片真叶时定植大田；

(8)病毒检测：采用RT-PCR法检测百合LSV、LMoV病毒；

(9)杂交制种：选择适宜时期，在土壤肥沃，排水良好的田块进行制种，塑料大棚的门及四周通风处安装25目防虫网，防止蚜虫及其它昆虫侵入传染病毒；将步骤(8)检测无病毒的父本苗和母本苗分别定植在邻近的大棚内，每个30米×6米标准大棚内定植5000~6000株；8月下旬至9月中，当母本花朵接近开放，在花药未成熟裂开前，在严格隔离条件下人工去除花药，在母本柱头表面形成大量粘液时，将当天采集的已形成大量可散开花粉粒的父本成熟花药，用手指小心地把花粉涂抹在母本的柱头上进行杂交授粉，第二天再次同样方法进行授粉以提高杂交结实率；果子发育至成熟阶段加强大棚保温工作，白天适当通风，定期进行叶枯病药剂防治，加强肥水管理，增施磷钾肥有利于提高种子饱满度，保证果子正常成熟，至果子正常成熟后分批采收。

所述培养基的制备经进一步优化为，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：

a)基本培养基：诱导和增殖培养基选用白糖为50g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，pH为5.8；试管鳞茎膨大培养基选用白糖为70g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，并另加甘露醇1.0g/L，AC 3.0mg/L，pH为6.0；

b)诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L；

c)增殖培养基：MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.2mg/L；

d)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.5mg/L。

所述的百合未成熟胚为于10月中、下旬，从绿色果皮的果子所含种子内采集的白色，胚乳呈浆状，长度2~3mm的幼胚。

所述的果子灭菌处理：为果子经75％酒精浸泡1.0~1.5min，用无菌水冲洗3~5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15~20min，用无菌水冲洗3~5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13~15min，最后用无菌水冲洗3~5次。

本发明的有益效果是：

(1)本发明利用新铁炮百合杂交组合之父本与母本的未成熟胚作为组培的外植体，由于幼胚体积较大接种操作容易；直接用果子进行消毒，消毒更彻底，对幼胚损伤较小，幼胚接种成功率高，可达80％以上，污染率低，只有5％左右或更低，而一般茎尖培养接种易产生玻璃化，接种成功率只有30％～40％，污染率在30％左右；幼胚培养能直接成苗，而茎尖培养易形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成苗，易发生变异，且延长了组培苗的培育周期。因此本发明技术操作方便、污染率低、接种成功率高、种性变异率低、并缩短了诱导培养周期60~70天，实用性强，便于推广应用；

(2)本发明利用百合种子本身不带毒的原理，以新铁炮百合杂交组合之父本与母本的未成熟胚为外植体，辅以特定的培养基配方和培养条件，通过组织培养方法分别获得父本和母本的无毒苗，进而经栽培至开花、杂交获得杂交种子，解决了以往百合茎尖脱毒不彻底、污染率高、效率低的问题，本发明培育的组培苗经病毒检测均未检测到百合LSV、LMoV病毒，可有效解决新铁炮百合常规的自交留种或鳞片扦插繁殖引起的制种亲本退化的问题；

(3)以往新铁炮百合杂交组合之父本与母本虽然易自交留种，但若长期自交留种容易造成性状退化，生长势下降，若利用鳞片扦插繁殖易传播病毒病，而且保存亲本需每年进行田间种植，易受不良气候条件和病虫害的影响。应用本发明技术既可快速获得父本与母本大量无毒试管鳞茎，适合工厂化生产，又能保持亲本性状的稳定性，此外，处于休眠状态的试管鳞茎在组培室常温条件下可保存1年以上，便于种源保存。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：(新铁炮百合杂交组合亲本组培快繁和杂交制种方法1)

(1)基本培养基：诱导和增殖培养基选用MS基本培养基，其中白糖为30g/L，琼脂粉为4.0g/L，pH为5.8；试管鳞茎膨大培养基选用MS基本培养基，其中白糖为90g/L，琼脂粉为4.0g/L，另加甘露醇5.0g/L，AC 1.0mg/L，pH为6.0；

(2)外植体的选取与灭菌：于10月中、下旬，分别取新铁炮百合杂交组合″白云2号″之父本″T1038″与母本″T1026″果子皮为绿色时的未成熟果子，经75％酒精浸泡1.0min，用无菌水冲洗3~5次，再用0.1％升汞溶液灭菌20min，用无菌水冲洗3~5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗3~5次，再分别取其所含种子未成熟胚作为脱毒组培的外植体；

(3)诱导培养：在无菌条件下将步骤(2)将幼胚接种在MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L的诱导培养基上，在温度为22℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，培养20d后，子叶伸长至0.8~1.0cm，子叶基部形成白色鳞茎状组织，再培养50d，直接形成鳞茎芽或无根组培苗；将组培瓶苗置于3℃低温处理45d，使鳞茎感应低温，促进组培苗生长活性提高。

(4)增殖培养：将步骤(3)鳞茎芽或无根组培苗的叶片和部分基部组织切除，根据鳞茎大小分切成2~6块带有鳞茎基部组织的鳞茎切块，接种在MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.3mg/L的增殖培养基上，在温度为21℃，光照时间12h/d，光照强度1000Lx的环境条件下，培养20d后，每个切块诱导出2~5个鳞茎芽，再培养40d，形成有根或无根组培苗；

(5)试管鳞茎膨大培养基：将步骤(4)的组培苗切除根和叶片，将鳞茎接种在MS+甘露醇5.0g/L+AC 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L的鳞茎膨大培养基上，温度为22℃，黑暗条件下，培养60d，直接生成直径0.8~1.2cm，重0.6~1.1g的父本″T1038″与母本″T1026″的试管鳞茎；

(6)试管鳞茎冷藏：将步骤(5)试管鳞茎出瓶后用清水清洗，包裹于消毒过的泥炭中，经12℃预处理20d，再在5℃处理60d。

(7)移栽：当试管鳞茎经低温处理打破休眠后，移栽入盛有70％泥炭和30％珍珠岩混合基质的穴盘中，当幼苗具3~5片真叶时可定植大田；

(8)病毒检测：采用RT-PCR法检测百合LSV、LMoV病毒。

(9)杂交制种：我国南方地区大田定植期为5月5日，选择土壤肥沃，排水良好的田块进行制种，塑料大棚的门及四周通风处安装25目防虫网，防止蚜虫及其它昆虫侵入，将杂交组合组培无毒的父本苗″T1038″和母本苗″T1026″分别定植在邻近的大棚内，每个30米×6米标准大棚内定植株数为5000株。授粉时期为8月25至9月2日，当母本花朵接近开放，在花药未成熟裂开前，在严格隔离条件下人工去除花药，在母本柱头表面形成大量粘液时，将当天采集的已形成大量可散开花粉粒的父本成熟花药，用手指小心地把花粉并涂抹在母本的柱头上进行杂交授粉，第二天再次同样方法进行授粉以提高杂交结实率；采用大棚设施栽培，果子发育至成熟期加强大棚保温工作，白天适当通风，定期进行叶枯病药剂防治，加强肥水管理，增施磷钾肥有利于提高种子饱满度，保证果子正常成熟，至″白云2号″果子正常成熟后分批采收，采收期自11上旬至11月中旬。

实施例2：(新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法2)

(1)基本培养基：诱导和增殖培养基选用MS基本培养基，其中白糖为50g/L，琼脂粉为4.0g/L，pH为5.8；试管鳞茎膨大培养基选用MS基本培养基，其中白糖为70g/L，琼脂粉为4.0g/L，另加甘露醇1.0g/L，AC3.0mg/L，pH为6.0；

(2)外植体的选取与灭菌：于10月中、下旬，分别取新铁炮百合杂交组合″白云2号″之父本″T1038″与母本″T1026″果皮为绿色时的未成熟果子，经75％酒精浸泡1.5min，用无菌水冲洗3~5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15min，用无菌水冲洗3~5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌14min，最后用无菌水冲洗3~5次，再分别取其所含种子未成熟胚作为脱毒组培的外植体；

(3)诱导培养：在无菌条件下将步骤(2)幼胚接种在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L的诱导培养基上，在温度为20℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，培养22d后，子叶伸长至0.8~1.0cm，子叶基部形成白色鳞茎状组织，再培养50d，直接形成鳞茎芽或无根组培苗；将组培瓶苗置于5℃低温处理60d，使鳞茎感应低温，促进组培苗生长活性提高。

(4)增殖培养：将步骤(3)鳞茎芽或无根组培苗的叶片和部分基部组织切除，根据鳞茎大小分切成2~6块带有鳞茎基部组织的鳞茎切块，接种在MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.2mg/L的增殖培养基上，在温度为20℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，培养20d后，每个切块诱导出2~5个鳞茎芽，再培养40d，形成有根或无根组培苗；

(5)试管鳞茎膨大培养基：将步骤(4)的组培苗切除根和叶片，将鳞茎接种在MS+甘露醇1.0g/L+AC3.0mg/L+NAA 0.5mg/L的鳞茎膨大培养基上，温度为19℃，黑暗条件下，培养70d，直接生成直径0.8~1.2cm，重0.6~1.1g的父本″T1038″与母本″T1026″的试管鳞茎；

(6)试管鳞茎冷藏：将步骤(5)试管鳞茎出瓶后用清水清洗，包裹于消毒过的泥炭中，经10℃预处理10d，再在3℃处理50d。

(7)移栽：当试管鳞茎经低温处理打破休眠后，移栽入盛有70％泥炭和30％珍珠岩混合基质的穴盘中，当幼苗具3~5片真叶时可定植大田；

(8)病毒检测：采用RT-PCR法检测百合LSV、LMoV病毒。

(9)杂交制种：大田定植期为5月10日，选择土壤肥沃，排水良好、田块进行制种，塑料大棚的门及四周通风处安装25目防虫网，防止蚜虫及其它昆虫侵入，杂交制种的父本苗″T1038″和母本″T1026″苗分别定植在邻近的大棚内，每个30米×6米标准大棚内定植株数为5500株。授粉时期为9月1~10日，当母本花朵接近开放，在花药未成熟裂开前，在严格隔离条件下人工去除花药，在母本柱头表面形成大量粘液时，将当天采集的已形成大量可散开花粉粒的父本成熟花药，用手指小心地把花粉并涂抹在母本的柱头上进行杂交授粉，第二天再次同样方法进行授粉以提高杂交结实率；采用大棚设施栽培，果子发育至成熟期加强大棚保温工作，白天适当通风，定期进行叶枯病药剂防治，加强肥水管理，增施磷钾肥有利于提高种子饱满度，至″白云2号″果子正常成熟后分批采收，采收期自11月中旬至11月下旬

实施例3：(新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法3)

(1)基本培养基：诱导和增殖培养基选用MS基本培养基，其中白糖为60g/L，琼脂粉为4.0g/L，pH为5.8；试管鳞茎膨大培养基选用MS基本培养基，其中白糖为80g/L，琼脂粉为4.0g/L，另加甘露醇2.5g/L，AC 5.0mg/L，pH为6.0；

(2)外植体的选取与灭菌：于10月中、下旬，分别取新铁炮百合杂交组合″白云2号″之父本″T1038″与母本″T1026″果皮为绿色时的未成熟果子，经75％酒精浸泡1.25min，用无菌水冲洗3~5次，再用0.1％升汞溶液灭菌17.5min，用无菌水冲洗3~5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13min，最后用无菌水冲洗3~5次，再分别取其所含种子未成熟胚作为脱毒组培的外植体；

(3)诱导培养：在无菌条件下将步骤(2)幼胚接种在MS+6-BA0.75mg/L+IBA 0.5mg/L的诱导培养基上，在温度为19℃，光照时间12h/d，光照强度2500Lx的环境条件下，培养25d后，子叶伸长至0.8~1.0cm，子叶基部形成白色鳞茎状组织，再培养50d，直接形成鳞茎芽或无根组培苗；将组培瓶苗置于3℃低温处理50d，使鳞茎感应低温，促进组培苗生长活性提高。

(4)增殖培养：将步骤(3)鳞茎芽或无根组培苗的叶片和部分基部组织切除，根据鳞茎大小分切成2~6块带有鳞茎基部组织的鳞茎切块，接种在MS+6-BA0.15mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上，在温度为19℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，培养20d后，每个切块诱导出2~5个鳞茎芽，再培养40d，形成有根或无根组培苗；

(5)鳞茎膨大培养基：将步骤(4)的组培苗切除根和叶片，将鳞茎接种在MS+NAA 0.15mg/L的鳞茎膨大培养基上，温度为20℃，黑暗条件下，培养65d，直接生成直径0.8~1.2cm，重0.6~1.1g的父本″T1038″与母本″T1026″的试管鳞茎；

(6)试管鳞茎冷藏：将步骤(5)试管鳞茎出瓶后用清水清洗，包裹于消毒过的泥炭中，经11℃预处理15d，再在4℃处理55d。

(7)移栽：当试管鳞茎经低温处理打破休眠后，移栽入盛有70％泥炭和30％珍珠岩混合基质的穴盘中，当幼苗具3~5片真叶时可定植大田；

(8)病毒检测：采用RT-PCR法检测百合LSV、LMoV病毒。

(9)杂交制种：大田定植期为5月15日，选择土壤肥沃，排水良好、田块进行制种，塑料大棚的门及四周通风处安装25目防虫网，防止蚜虫及其它昆虫侵入，杂交制种的父本苗″T1038″和母本″T1026″苗分别定植在邻近的大棚内，每个30米×6米标准大棚内定植株数为6000株。授粉时期为9月5~15日，当母本花朵接近开放，在花药未成熟裂开前，在严格隔离条件下人工去除花药，在母本柱头表面形成大量粘液时，将当天采集的已形成大量可散开花粉粒的父本成熟花药，用手指小心地把花粉并涂抹在母本的柱头上进行杂交授粉，第二天再次同样方法进行授粉以提高杂交结实率；采用大棚设施栽培，果子发育至成熟期加强大棚保温工作，白天适当通风，定期进行叶枯病药剂防治，加强肥水管理，增施磷钾肥有利于提高种子饱满度，至″白云2号″果子正常成熟后分批采收，采收期自11月下旬至12月上旬。

试验例：(新铁炮百合制种亲本组培苗病毒检测)

(1)植物材料

a)对照材料：以带毒的百合鳞茎为材料。

b)处理材料：以实施例1获得的新铁炮百合杂交组合″白云2号″之父本″T1038″与母本″T1026″的组培苗为材料。

(2)病毒的RNA抽提

采用RNeasy Plant mini(QIAGEN)试剂盒，分别对每个百合样品进行总RNA的抽提，所用试剂器皿均需作无RNA酶处理，具体操作流程如下：

a)称取约0.1g的百合叶片，在灭菌的研钵中加液氮磨细后转入无菌Eppendorf管中。

b)迅速加入450μL RLT，缓冲液，振荡混匀后56oC温育3min。

c)将裂解液全部转入紫色管，13,000g离心2min。

d)将滤液转入新的无菌Eppendorf管中，注意不要搅动沉淀。加225μL无水乙醇轻柔颠倒混匀。

e)将所有样品转入粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液，留收集管。

f)加700μL RW1于粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液和收集管。

g)将RNA柱移入新的Kit中提供的2mL收集管中。

h)加500μL RPE于粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液。

i)再次加500μL RPE于粉红色小管，13,000g离心2min，干燥膜，确保柱边无水痕，弃滤液和收集管。

j)将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管(Kit中提供)加30μL无RNase水，10,000g离心1min，提取的RNA置-80oC保存。

(3)病毒各基因序列的扩增

a)引物设计

引物设计是RT-PCR成功的关键，本实验中的引物主要根据已经报道的百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)分离物序列设计。

b)cDNA第一链合成

用设计的下游引物进行逆转录，合成cDNA第一链。模板RNA 12.5μL，下游引物(100μmol/L)2μL，10×RT缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNasin 0.5μL，鼠源逆转录酶(M-MuLV逆转录酶，Promega)1μL，总体积20μL。37℃1-2h后加入60μL灭菌水，剧烈振荡混匀后贮于-20℃备用。

c)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

用病毒提取的RNA合成的cDNA第一链做模板来进行PCR扩增。采用Ex TaqTMPCR System(Life Technology Ltd)扩增目的片段。加入5μL 10×PCR缓冲液，再加入4μL 2.5mmol/L dNTPs，2μL(20μmol/L)上游引物及2μL下游引物，2μL cDNA第一链模板和0.2μL Taq DNA Polymerase(GIBCO)，用无菌去离子水调整到50μL。进入PCR循环：

94℃    3min

94℃    30sec

Tm℃    30sec    30个循环

72℃    1-2min

72℃    10min

具体参数可根据引物、模板、PCR片段大小来适量调整。

(4)PCR产物的检测

将PCR扩增产物进行1％Agarose Gel琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，在紫外灯下观察，检测扩增的片段和长度。

对带毒的百合鳞茎和新铁炮百合制种亲本脱毒组培苗分别进行LSV、LMoV病毒检测，带毒的百合鳞茎检测结果发现预期大小的扩增片段，新铁炮百合制种亲本脱毒组培苗检测结果均未发现预期大小的扩增片段，说明经过新铁炮百合制种亲本脱毒组培的苗中不存在这2种病毒的侵染。

Claims (4)

1、新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的制备、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：

a)基本培养基：诱导培养基和增殖培养基采用白糖为30～60g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，pH为5.8；鳞茎膨大培养基选用白糖为70～90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，并另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC1.0～5.0mg/L，pH为6.0；

b)诱导培养基：MS+6-BA 0.5～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

c)增殖培养基：MS+6-BA 0.1～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

d)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.1～0.5mg/L；

(2)外植体的选取与灭菌处理：分别取新铁炮百合杂交组合之父本与母本的自交未熟果子，经灭菌处理后，取其所含种子未成熟胚作为组培的外植体；

(3)诱导培养：将步骤(2)父本与母本的未成熟胚分别接种在诱导培养基上，在温度20±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lx的环境条件下，培养20～25d，子叶伸长至0.8～1.0cm，子叶基部形成白色鳞茎状组织时，再培养50d左右，不经愈伤组织阶段，直接形成鳞茎芽和/或无根组培苗；将组培瓶鳞茎芽和/或无根组培苗置于3～5℃低温处理45～60d，使鳞茎感应低温，促进组培苗生长活性提高；

(4)增殖培养：将步骤(3)鳞茎芽和/或无根组培苗的叶片和部分基部组织切除，根据鳞茎大小纵向分切成2～6块带有鳞茎基部组织的鳞茎切块，接种在增殖培养基上，在温度20±1℃，光照时间12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，培养20d后，每个切块增殖2～5个鳞茎芽，再培养40d形成有根或无根组培苗；

(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)的有根或无根组培苗切除根和叶片，将鳞茎接种在鳞茎膨大培养基上，在温度20±2℃，黑暗条件下培养60～70d，直接生成直径0.8～1.2cm，重0.6～1.1g的父本和母本的试管鳞茎；

(6)低温处理：将步骤(5)试管鳞茎出瓶后用清水清洗，包裹于消毒过的泥炭中，经10～12℃预处理10～20d，再在3～5℃处理50～60d，至打破休眠；

(7)移栽：将步骤(6)试管鳞茎移栽到以70％泥炭和30％珍珠岩混合基质的穴盘中，至幼苗长3～5片真叶时定植大田；

(8)病毒检测：采用RT-PCR法检测百合LSV、LMoV病毒；

(9)杂交制种：选择适宜时期，在土壤肥沃，排水良好的田块进行制种，塑料大棚的门及四周通风处安装25目防虫网，防止蚜虫及其它昆虫侵入传染病毒；将步骤(8)检测无病毒的父本苗和母本苗分别定植在邻近的大棚内，每个30米×6米标准大棚内定植5000～6000株；8月下旬至9月中，当母本花朵接近开放，在花药未成熟裂开前，在严格隔离条件下人工去除花药，在母本柱头表面形成大量粘液时，将当天采集的已形成大量可散开花粉粒的父本成熟花药，用手指小心地把花粉涂抹在母本的柱头上进行杂交授粉，第二天再次同样方法进行授粉以提高杂交结实率；果子发育至成熟阶段加强大棚保温工作，白天适当通风，定期进行叶枯病药剂防治，加强肥水管理，增施磷钾肥有利于提高种子饱满度，保证果子正常成熟，至果子正常成熟后分批采收。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基的制备：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：

a)基本培养基：诱导培养基和增殖培养基采用白糖为50g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，pH为5.8；鳞茎膨大培养基选用白糖为70g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，并另加甘露醇1.0g/L，AC 3.0mg/L，pH为6.0；

b)诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L；

c)增殖培养基：MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.2mg/L；

d)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.5mg/L。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的百合未成熟胚为于10月中、下旬，从绿色果皮的果子所含种子内采集的白色，胚乳呈浆状，长度2～3mm的幼胚。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的果子灭菌处理为果子经75％酒精浸泡1.0～1.5min，用无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，用无菌水冲洗3～5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，最后用无菌水冲洗3～5次。