CN101411304B - 远源百合杂交植株的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种远源百合杂交植株的培育方法，克服了现有技术种远源杂交不易亲和的问题，本发明将子房和花药的进行离体培养，然后采用将子房切断的非常规授粉方式进行离体授粉，此后进行胚培养即可得杂交植株，采用本发明的方法得到了杂种苗，证明本发明方法成功的克服了远源杂交不亲和的问题，能较好的提高种子结实率，具有很好的推广应用价值。

Description

远源百合杂交植株的培育方法

技术领域

本发明涉及杂交植株培育方法，特别是涉及远源百合杂交植株的培育方法。

背景技术

百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lillium)植物的总称，多年生草本。目前，全球约有115种，我国已发现有55个种，18个变种，占世界百合属植物的一半。20世纪初，国外以荷兰、日本和美国为中心，开展了百合的育种工作，利用本身已经优良的东方系、麝香系和亚洲系百合进行组间和种间杂交，培育出具有良好商业性状的新品种，推出OT和LA系列杂交新品种。目前市场上主要的百合切花品种集中在亚洲系(Asiatic hybrids)、东方系(Orientalhybrids)、麝香系(Longiflomm hybrids)、OT型、LA型等5个品系上。我国对百合杂交后代的培育，仅局限于百合野生资源的种质之间，进行种间杂交，到现在三十多年来没有新品种获得商业价值。

种间杂交及多倍化育种是国外花卉育种的重要途径，百合育种更是如此。在百合常规杂交育种过程中，所选配的许多杂交组合或者完全不亲和，或者虽然亲和，但胚发育不全，致使杂交不易成功。百合种间杂交的不亲合一直是困扰国内外百合杂交育种的技术难题。国外对AO、OT和LA曾经采用柱头离体受精的方法进行过组间杂交，但目前还未见LOT和OTL型杂交新种质的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中百合种间杂交的不亲和的缺陷，提供一种远源百合杂交植株的培育方法，该方法能较好的解决种间杂交的不亲和问题

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

远源百合杂交植株的培育方法，包括如下步骤：

(1)子房和花药的离体培养：将百合切花材料插入水中，采开花前1～2天的花蕾，分离花蕾中成熟但尚未开放的花苞，灭菌后剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养；

(2)离体授粉：4～7天后，将母本的子房切断，直接授粉于子房的切断面上，将授粉后的子房置于MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养；

(3)胚培养：45～50天后，取出膨大而变黄的子房，剥出胚珠接种于诱导培养基中，培养100～120天后将胚珠中的胚剥取，接种至MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中，7～10天后即得杂交植株；其中诱导培养基的组成为：以MS为基本培养基，含6％蔗糖、0.01～0.05mg/l萘乙酸、7g/l琼脂，PH值为5.8。

在上述的步骤(2)中，母本的子房最好在距离顶端1～2cm处切断。授粉后的子房的培养条件为25℃、光照强度1500lux、光照时间12小时。

上述步骤(1)具体为：将百合切花材料插入水中，采开花前1～2天的花蕾，分离花蕾中成熟但尚未开放的花苞，置于75％酒精中浸泡1～2分钟，取出，无菌水清洗3次，0.1％HgCl消毒4～6分钟，无菌水再清洗3次，用无菌滤纸吸干水份，剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养。

上述步骤(3)具体为：45～50天后，取出膨大而变黄的子房，剥出胚珠接种于诱导培养基中，在25℃下暗培养21天，然后25℃、1500lux白炽灯条件下全天光照培养21天，此后晚上八点打开白炽灯、早上八点关闭进行培养，100～120天后将胚珠中的胚剥取，接种至MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养，7～10天后即得杂交植株。

前述远源百合的母本为L型百合，父本为OT型或O型百合。其中所述L型百合为新铁炮，OT型百合为黄色风暴，O型百合为蒂伯。国外对AO、OT和LA进行过组间杂交，但还未见L×OT型杂交新种质的报道。本发明通过离体培养对麝香百合系L型“新铁炮”和OT型“黄色风暴”及O型百合“蒂伯”进行组间杂交，采用前述子房切断的授粉方式以及离体胚抢救技术来克服受精前后的障碍，获得了L×OT、L×O的新型百合杂交后代。

发明人对不同的授粉方式、灭菌方式以及培养基都进行了研究，具体如下：

一、材料和方法

材料：杂交品种OT型“黄色风暴”(L.‘yellowenn’)、麝香百合系L型“新铁炮”(L.‘formolingi’)及O型百合“蒂伯”(L.‘Tiber’)三个品种，无菌条件下接种在培养基中。

方法：

1.1子房、花药离体培养

在超净工作台上，取成熟但尚未开放的花苞，灭菌，剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS+0.02mg/l萘乙酸培养基中，观察45天再进行杂交授粉。杂交组合为L×OT、OT×L和L×O。

1.2授粉方法

采用常规授粉和非常规授粉的方法。常规授粉是将花粉直接授在柱头上，非常规授粉分为切柱头授粉、柱头嫁接和子房切断。其中，切柱头授粉是将柱头切掉，直接授粉于花柱上；柱头嫁接时将花柱切短并将柱头对换；子房切断是将子房切掉1～2mm左右并直接授粉在切断后的子房上面，将授粉后的子房置于MS+0.02mg/l萘乙酸的培养基中，培养45-50天。

1.3胚培养

授粉后45-50天，取出膨大的子房，将种子剥出进行离体培养，分别置于不同浓度培养基共9种：蔗糖浓度分别为3％、6％和9％，萘乙酸的浓度分别为0.01mg/l、0.02mg/l和0.05mg/l，琼脂7g/l，调节PH值为5.8。进行三周暗培养，温度为25℃。然后全天光照在1500lux白炽灯下，温度为25℃，保持三周。再次调整光照时间，晚上八点将白炽灯打开，早晨八点关闭，保持12小时光照。

二、结果与分析

2.1不同灭菌方式对子房离体培养的影响

子房、花药的离体培养中，消毒灭菌是很重要的步骤，它是影响远缘杂交的外界因素，直接关系到种子成活率。如果消毒不彻底，会引起细菌或真菌感染，导致子房和花药死亡。在实验过程中，因为接种操作不规范等引起的细菌感染，可以采取二次灭菌的方式，将子房根部切断再消毒，使污染率进一步降低。本次实验为筛选出最适宜的培养基，先进行前期对比实验，选取162个花苞，分别用75％酒精和0.1％Hgcl进行消毒然后清洗，根据消毒时间的不同，筛选出最佳消毒时间为先进行酒精消毒2min然后升汞消毒6min(如表1所示)，成活率达到93.75％。通过对比消毒时间，余下的花苞均采用先酒精消毒2min然后升汞消毒6min的方式进行消毒，以获得较高的花苞成活率。

表1不同灭菌方式对子房离体培养的影响

2.2不同授粉方式对杂交结实的影响与分析

在离体培养条件下，为克服授精障碍采取的非常规授粉方法是很有效的，子房膨大率达到42.6％，且获得有胚的种子。而作为对照组常规授粉的母本，在子房膨大之前就出现枯萎现象，12天便枯萎了，几乎没有出现膨大，不能得到正常发育的种子。由表2可以看出，切割子房的方法种子结实率相对较高。

表2不同授粉方式的杂交结果

授粉方式	授粉子房数目	子房膨大数	从授粉到膨大子房枯萎时间/d	形成蒴果数
					常规授粉	30	-	12	-
切割柱头	128	58	10～65	20
					柱头嫁接	82	33	10～62	15
子房切断	102	42	15～55	24

2.3诱导培养基的蔗糖浓度和萘乙酸浓度对种子培养的影响与分析

由表3可以看出，蔗糖浓度对种子培养的影响比较显著，6％的培养基最适宜种子的培养，当萘乙酸浓度为0.02mg/l时，种子成活率比较高。本次实验中，种子在蔗糖浓度为6％的培养基中成活率均在50％以上，比较适合种子的生长发育。经过100-120天的胚珠培养，可获得少量胚，将胚剥出胚珠接种在培养基上，7-10天即可萌发成苗。

表3不同浓度培养基对种子成活的影响

三、结论与讨论

国外对AO、OT和LA曾经采用柱头离体受精的方法进行过组间杂交，但未见LOT和OTL型杂交新种质。本发明对此进行研究，选取的材料麝香百合L“新铁炮”具有生长周期较短、茎强度和花朵品质的维持较好、多数情况下对缺光不敏感的优点。而本身为杂交品种的OT“黄色风暴”花呈淡黄色且花朵大、生命力强、花型美丽、具芳香气息。期望把两者间的有益性状结合在一起，培育出生长周期较短，茎强度和花朵品质好，对缺光的敏感性小，且花色、花型都比较丰富的新品种。

通过实验室条件下的花药离体培养，对L×OT、OT×L及L×O进行杂交，获得了杂种胚和植株。采用子房膨大率和种子成活率为种间杂交亲和力的判定指标，筛选出最适宜的消毒方法和时间、最佳培养基和最佳授粉方式。经过筛选，采取先用酒精消毒2min然后升汞消毒6min的方法污染率最低。蔗糖浓度为6％，萘乙酸浓度为0.02mg/l的培养基为最佳培养基，最适合种子的培养。

与现有技术相比，本发明采用非常规的授粉方式即将子房切割直接授粉在子房切割面上，花粉管不用通过柱头和花柱，而是直接进入子房最后到达胚囊，释放精子并分别与卵细胞及极核结合形成完整的胚及胚乳，通过此授粉方式可以得到有胚的种子，并能成功获得杂交苗，证明该方法可以克服远源杂交不亲和的问题，能较好的提高种子结实率，具有很好的推广应用价值。

具体实施方式

本发明的优选实施方式：

取材：从市场上购买麝香百合系L型“新铁炮”和OT型百合“黄色风暴”及O型百合“蒂伯”切花材料，插入水中，选择无病虫害的花枝，采开花前1-2天的花蕾。

灭菌：在超净工作台上，选取花蕾种成熟但尚未开放的花苞，置于75％酒精浸泡1分钟，无菌水清洗3次，再用0.1％HgCl消毒5min，无菌水再清洗3次。无菌滤纸吸干水分，剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养，培养条件为25℃、光照强度1500lux、光照时间12小时。灭菌是关键之一，灭菌时间太长，花粉及子房易受到伤害，灭菌时间太短又会因污染而失败，故操作应特别小心。

离体授粉：培养6天后，选择无菌的子房和花药，花药最好选择已完全开裂的，采用子房切断的方式进行非常规授粉，即将“新铁炮”的子房在距离顶端1～2cm处切断，采无菌的“黄色风暴”和“蒂伯”花粉分别直接授粉于不同的切断后的子房上面，将授粉后的子房置于MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中在常规组培条件下培养。

胚珠培养：授粉后15天左右可看出部分子房会开始膨大，大部分会渐渐变黄枯萎，培养4550天后，少数子房膨大而开始变黄。此时取出膨大且变黄的子房，将胚珠剥出进行离体培养，接种于以下培养基中：以MS为基本培养基，蔗糖浓度为6％，萘乙酸浓度为0.03mg/l，琼脂7g/l，调节PH值为5.8。在25℃下暗培养21天，然后25℃、1500lux白炽灯条件下全天光照培养21天，此后晚上八点打开白炽灯、早上八点关闭进行培养，保持12小时光照。

胚培养：胚珠培养100-120天后，胚珠中可见少数明显的正常胚或球形的胚。剥取其中的胚接种至MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中，约7-10天后可成苗，即可获得其杂种植株，该杂种植株即为L×O杂种苗和L×OT杂种苗。

远源杂种的鉴定：采用核型分析、同工酶及RAPD分子标记技术可鉴定出远源杂种的真假，具有亲本核型特征的即为真杂种，同工酶及RAPD分析表明，真杂种除了具有父母本的带型外，还会产生不同于亲本的新带型。

远源杂种百合的繁育：按常规百合的繁育技术进行，组培快繁的配方为MS培养基附加6％的蔗糖，生根培养基为MS培养基附加6％的蔗糖和0.01mg/l萘乙酸。试管苗(或球)在2-4℃的低温下处理37-50天，然后栽入腐叶土中，在海拔2000m左右种植。小籽球采收后，在2-5℃的低温下处理70-90天可以打破休眠，然后在海拔2000-2400m左右，土壤pH值为5.5-6.5的地方种植，进行第二次繁球。有多数籽球可形成商品开花种球，开花后可用于新类型百合品种选育。

Claims (7)

1.一种远源百合杂交植株的培育方法，包括如下步骤：

(1)子房和花药的离体培养：将百合切花材料插入水中，采开花前1～2天的花蕾，分离花蕾中成熟但尚未开放的花苞，灭菌后剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养；

(2)离体授粉：4～7天后，将母本的子房切掉1～2mm，直接授粉于子房的切断面上，将授粉后的子房置于MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养；

(3)胚培养：45～50天后，取出膨大而变黄的子房，剥出胚珠接种于诱导培养基中，培养100～120天后将胚珠中的胚剥取，接种至MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中，7～10天后即得杂交植株；其中诱导培养基的组成为：以MS为基本培养基，含6％蔗糖、0.01～0.05mg/l萘乙酸、7g/l琼脂，PH值为5.8；

其中，所述远源百合杂交植株的母本为L型百合，父本为OT型或O型百合。

2.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：步骤(2)中，授粉后的子房的培养条件为25℃、光照强度1500lux、光照时间12小时。

3.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：步骤(1)为：将百合切花材料插入水中，采开花前1～2天的花蕾，分离花蕾中成熟但尚未开放的花苞，置于75％酒精中浸泡1～2分钟，取出，无菌水清洗3次，0.1％HgCl₂消毒4～6分钟，无菌水再清洗3次，用无菌滤纸吸干水份，剥去花瓣，将子房和花药分别接入MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养。

4.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：步骤(3)为：45～50天后，取出膨大而变黄的子房，剥出胚珠接种于诱导培养基中，在25℃下暗培养21天，然后25℃、1500lux白炽灯条件下全天光照培养21天，此后晚上八点打开白炽灯、早上八点关闭进行培养，100～120天后将胚珠中的胚剥取，接种至MS培养基+0.02mg/l萘乙酸的培养基中培养，7～10天后即得杂交植株。

5.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：所述L型百合为新铁炮。

6.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：所述OT型百合为黄色风暴。

7.按照权利要求1所述远源百合杂交植株的培育方法，其特征在于：所述O型百合为蒂伯。