CN114208676B

CN114208676B - 一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法

Info

Publication number: CN114208676B
Application number: CN202111625705.9A
Authority: CN
Inventors: 钱春桃; 郑莉娜; 孙博文; 孙亚亭; 颜乐龙; 刘爽; 李季; 娄群峰; 陈劲枫
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114208676A

Abstract

本发明公开了一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，以野生种西印度瓜为母本，栽培种‘新红瑞’为父本，进行人工杂交，包括：步骤1、取母本雌花与父本雄花进行授粉，授粉后喷施氯吡脲水溶液和噻苯隆溶液并套袋隔离；步骤2、取授粉后14～21d的幼嫩果实，先清洗表面，然后对果皮表面消毒，取出幼胚；步骤3、将幼胚置于培养基中进行黑暗培养，所述培养基为：MS+6‑BA+蔗糖+植物凝胶混合培养基；步骤4、所述黑暗培养的28～32d后转入继代培养基中继代培养，所述继代培养基为MS培养基，直接诱导幼胚分化成苗。本发明制得了甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种，解决了栽培甜瓜资源遗传基础狭窄，抗病抗逆能力弱的问题。

Description

一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法

技术领域

本发明涉及一种甜瓜部分种间杂种的创制方法，特别是一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法。

背景技术

现有甜瓜育种中，由于大多数甜瓜栽培种在驯化过程中抗病虫害和抗非生物胁迫性差，严重限制了其产量和品质的提高及应用地域范围的拓展，造成甜瓜种质资源品种比较单一、品种间遗传差异较小，遗传基础越来越狭窄。

野生种是作物改良的种质资源，通过远缘杂交可以将野生种中优异的基因转移到栽培种，以增强栽培种的抗病抗逆性，提高果实的品质和产量。但是受到杂交障碍等因素的严重制约，甜瓜属野生种与栽培甜瓜之间的种间杂交很难实现。而存在于甜瓜属栽培植物与野生植物之间杂交不亲和性的机理还不很清楚。西印度瓜作为甜瓜属一个野生种，国内外已经有众多研究者开展了其与同属植物之间的种间杂交研究。20世纪70年代以来，国外学者就西印度瓜野生种开展了相关种间杂交研究(George Fassuliotis and B.V.Nelson，1988；Yuichi Matsumoto，et al,2012)，并取得了不同程度的研究进展，有研究中只收到了西印度瓜与甜瓜杂交的果实，未有成熟的种子；George Fassuliotis and B.V.Nelson通过胚培养和体细胞杂交获得了Cucumis metuliferus×C.anguria的种间杂交F₁。国内王吉明等人2004年的研究中，在西印度瓜×甜瓜授粉3d后的幼胚DNA中扩增出父本的特征带，表明西印度瓜与甜瓜产生了真实的杂交；2010年的研究获得了未见父本特征形态的可育植株。截止目前，试图进行西印度瓜和甜瓜之间的种间杂交都没有成功，未能实现两个物种之间的基因交流。

发明内容

针对上述现有技术缺陷，本发明的任务在于提供一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，解决栽培甜瓜资源遗传基础狭窄，抗病抗逆能力弱的问题。

本发明技术方案如下：一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，以野生种西印度瓜为母本，栽培种‘新红瑞’为父本，进行人工杂交，包括以下步骤：

步骤1、取母本雌花与父本雄花进行授粉，授粉后喷施氯吡脲水溶液和噻苯隆溶液并套袋隔离；

步骤2、取授粉后14～21d的幼嫩果实，先清洗表面，然后对果皮表面消毒，取出幼胚；

步骤3、将幼胚置于培养基中进行黑暗培养，所述培养基为：MS+6-BA+蔗糖+植物凝胶混合培养基；

步骤4、所述黑暗培养的28～32d后转入继代培养基中继代培养，所述继代培养基为MS培养基，直接诱导幼胚分化成苗。

进一步地，包括步骤5、幼苗驯化移栽，所述幼苗驯化移栽时置于温度为26～28℃，光照强度为1400～1600lx，湿度为61％～81％RH的光照培养箱中进行。

进一步地，所述氯吡脲水溶液浓度为0.001％～0.002％。

进一步地，所述噻苯隆溶液浓度为0.01～0.02mg/L。

进一步地，所述步骤4中的继代培养的培养温度26～28℃，在光周期15～18h/6～9h。

进一步地，所述步骤1中，在授粉前一日，对母本雌花去雄后套袋隔离。

进一步地，所述步骤3将幼胚置于培养基前先将幼胚置于灭菌的滤纸上吸干多余的水分和瓜囊，然后再转移至培养基。

本发明与现有技术相比的优点在于：

1、本发明的甜瓜属部分种间杂种的获得方法中，以野生种西印度瓜为母本，以栽培种‘新红瑞’为父本，进行人工杂交，经过幼胚离体培养得到杂交后代，该方法为挖掘和利用甜瓜属野生种的基因资源，在克服甜瓜远缘杂交和有效利用野生种质获得突破。

2、本发明得到的杂种F₁和其他杂交后代材料可作为遗传育种研究的材料，通过自交或者与栽培种回交，创造染色体附加系、代换系或培育新种质，也可用来进行染色体组加倍获得新材料。

3、本发明形成了一套甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种获得方法，对丰富甜瓜品种的遗传基础，优化育种技术发挥重要的积极作用。

附图说明

图1为杂种的组培照片。

图2为父本、母本及杂种的幼苗期植株形态照片。

图3为父本、母本及杂种的幼苗期叶片照片。

图4为父本、母本及杂种的幼苗植株前期的雄花照片。

图5为父本、母本及杂种的SSR标记电泳图。

图6为母本、杂种以及两者回交后代BC₁的的SSR标记电泳图。

图7为杂种的根尖有丝分裂中期制片

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例，一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，以野生种西印度瓜(葫芦科作物遗传与种质创新实验室)为母本P₂，以栽培种‘新红瑞’(以购买商品种的形式引进)为父本P₁，进行人工杂交，经过幼胚离体培养得到杂种F₁，具体步骤如下：

步骤1、在开花前一天的傍晚时分，选取生长健壮，状态良好的西印度瓜母本植株的雌花，用镊子轻轻剖开花萼及花冠，然后用镊子夹住花丝，将雄蕊全部去掉。并立即对去雄母本的花序进行套袋隔离。在开花当天上午9:00～10:00左右，花粉活力最好时使用2～3朵栽培种甜瓜‘新红瑞’的雄花对子房的雌蕊部分进行第1次授粉并套袋隔离，然后次日和第3日早上分别再次进行授粉，共授粉2～3次，并进行套袋隔离挂牌标记。授粉后，对不同的实验株的雌花子房分别喷施浓度为0.001％、0.0015％、0.002％的氯吡脲水溶液，再使用浓度为0.01mg/L、0.015mg/L、0.02mg/L噻苯隆溶液连续喷施2d或3d，以促进杂种胚的启动刺激发育；

步骤2、分别取上述实验株授粉后14d、18d、21d的幼嫩果实，然后使用75％的酒精对表面进行消毒，放在超净工作台中使用解剖刀将幼胚剥出，并在灭过菌的滤纸上吸干多余的瓜囊和水分；

步骤3、将步骤2的幼胚置于培养基中进行黑暗培养，培养基为：MS+6-BA+蔗糖+植物凝胶混合培养基，6-BA添加量为1mg/L，蔗糖添加量为30g/L，植物凝胶添加量为2.8g/L；

步骤4、黑暗培养的28d、30d和32d后分别转入继代培养基中继代培养，继代培养基为MS培养基，继代培养的培养温度26～28℃，在光周期15～18h/6～9h，本实施例均使用了16h/8h的光周期进行培养，直接诱导幼胚分化成苗。

步骤5、幼苗驯化移栽，幼苗驯化移栽时置于温度为26～28℃，光照强度为1400～1600lx，湿度为61％～81％RH的光照培养箱中进行，驯化一周左右就可以将其移栽到田间进行栽培管理。

对上述实施例得到的甜瓜属野生种与栽培种甜瓜部分种间杂种进行鉴定，主要包括：对获得的后代材料同时进行杂种形态学鉴定、杂种细胞学鉴定、杂种分子标记鉴定。

甜瓜部分种间杂种的植物形态学鉴定方法，具体步骤如下：

将杂交父母本及后代材料于2021年3月中旬定植在南京农业大学白马科研教学基地，6月中旬开始对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计，性状统计均按照甜瓜种质资源描述规范进行。依据杂交父母本及杂种的表现型所得的可能的杂种植株进行鉴定。

通过对杂交父母本及后代材料中随机选取植株进行形态学观察，调查统计中发现双亲在多个性状中具有多样性，但初步观察表明：种间杂种的大多数形态主要与母本西印度瓜相似，除了在前期F₁植株的叶片形状和颜色、雄花的形状大小和果梗长短有所不同，居于双亲中间型(如图1至图4，表1)；F₂中出现雌花和雄花花瓣偏向于父本甜瓜‘新红瑞’的单株；除此之外，与‘新红瑞’进行回交的后代材料其蔓枯病抗性也有所增强。

表1

甜瓜部分种间杂种的细胞学鉴定方法，具体步骤如下：

取下F₁的健康根尖进行有丝分裂中期制片，从植株上取下F₁根尖先使用8-羟基喹啉避光固定1h,然后在M:G固定液中再接着固定1d，然后将根尖拿出，放入培养皿中，用蒸馏水清洗2～3次，每次4～5min左右，然后将其切成大、中、小根尖，接着将其放在37℃金属浴中进行酶解，酶解到一定程度之后，利用去壁低渗火焰干燥法制片，并在显微镜下观察统计染色体数目，经统计观察发现F₁的染色体数目为24条(如图7)。

甜瓜部分种间杂种的分子标记鉴定方法，具体步骤如下：

取母本西印度瓜、父本‘新红瑞’和杂交材料F₁、F₂及回交后代的植株叶片，参照Paterson等(1999)采用改良CTAB法分别提取父母本及其杂交后代材料植株的DNA；

所使用的PCR反应体积为10μL，其中正、反引物各1μL、DNA1μL、Mix 5μL、ddH₂O2μL，将上述成分混合后离心，并盖上硅胶盖，防止水分蒸发；

进行PCR扩增时，所使用的PCR扩増程序为：95℃5min；95℃30s,50℃30s，72℃40s,28个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后向PCR扩增产物中加入5μL的溴酚蓝燃料，混匀；其中Mix、Marker均购自Takara公司。

电泳结果分析表明:在54对SSR引物中筛选出52对多态性比较好的引物，对父母本及杂种后代进行扩增，其中9对引物(表2Primer ID:3-4、4-1、5-1、5-2、8-1、8-2、8-5、11-1、11-3)，在F₁杂种中均扩增出父母本的共显性标记，分别表现为父母本的特征带，扩增条带表现为双亲互补型(图5)。

表2

引物名称	正向引物	反向引物
			3-4	AACGCTCCAACAAAAACTC	CACTTTAACTTGCAGCTGTG
4-1	TGCCACTCTCTTCCTCTC	AATGACGATTTCTCCTC
			5-1	ATCACCCACCCCACCACTGCCAAAA	CCTTGAAAAACCACCAACATAACAC
5-2	TAAACCTCACCCCAAAAAC	AGGATGAGGGTGGAAAGAG
			8-1	AAGAAGGCCTCCAATCAAG	AGAGCGAGAGGAACAACAG
8-2	TGTGACAATGTGCAACCAG	AAAAATGGTGTTAAACGACATGG
			8-5	AATCGAAATCCATCTCAC	TCTAAGCCACGACATCAC
11-1	GAAACGATGTCGGAGAAAG	GGGTGAAATGAAAGGGAG
			11-3	GCATACGACTCTTGGAAATCG	GAATCACGAAGAGAGCTGCAC

以‘新红瑞’作母本回交获得的后代材料在其中一对特异性引物中(左侧序列F：TCCGAAGTAAACATCAAAGACA右侧序列R：GGTCAGTCAAGATAGTTACGGTTG)显示回交后代材料中有父本F₁的遗传物质片段(图6)，这些信息在分子水平上证明了野生种西印度瓜与栽培甜瓜‘新红瑞’杂交所获得的种间杂种的真实性。

对比例

除以‘新红瑞’为父本，野生种西印度瓜为母本进行了上述实施例的杂交试验，其反向杂交试验也进行了尝试，另外，还使用了西印度瓜、剌瓜、非洲角以及酸黄瓜等野生种，与其他栽培种甜瓜，包括‘海蜜2号’、‘白皮脆’、‘联华金红’、‘特大白沙蜜S5’、‘超甜小麦酥S4’、‘金红皇冠’、‘满田红’、‘G6’、‘金红蜜’甜瓜进行了杂交试验尝试，这些杂交组合不是没有收到种子就是没有明显的杂交性状。

Claims

1.一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，其特征在于，以野生种西印度瓜为母本，栽培种‘新红瑞’为父本，进行人工杂交，包括以下步骤：

步骤1、取母本雌花与父本雄花进行授粉，授粉后喷施氯吡脲水溶液和噻苯隆溶液并套袋隔离，所述氯吡脲水溶液浓度为0.001%～0.002%，所述噻苯隆溶液浓度为0.01～0.02mg/L；

步骤3、将幼胚置于培养基中进行黑暗培养，所述培养基为：MS+6-BA +蔗糖+植物凝胶混合培养基，所述6-BA的添加量为1mg/L，所述蔗糖的添加量为30g/L，所述植物凝胶的添加量为2.8g/L；

2.根据权利要求1所述的甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，其特征在于，包括步骤5、幼苗驯化移栽，所述幼苗驯化移栽时置于温度为26～28℃，光照强度为1400～1600lx，湿度为61%～81%RH的光照培养箱中进行。

3.根据权利要求1所述的甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，其特征在于，所述步骤4中的继代培养的培养温度26～28℃，光周期15～18h/6～9h。

4.根据权利要求1所述的甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，其特征在于，所述步骤1中，在授粉前一日，对母本雌花去雄后套袋隔离，对父本雄花套袋隔离。

5.根据权利要求1所述的甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法，其特征在于，所述步骤3将幼胚置于培养基前先将幼胚置于灭菌的滤纸上吸干多余的水分和瓜囊，然后再转移至培养基。