KR102198083B1 - 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법 - Google Patents

유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 십자화과 채소 자원을 수집하고, 감식하여 분류하며 유도계의 파종 시간을 조절하여 개화기에 맞추도록 확보하는 단계1); 유도계로 십자화과 채소를 수분시키는 단계2); 주머니를 씌워 자가 수분시키거나 새싹 시기에 새싹을 벗겨 강제적으로 자가 수분시키는 단계3); 계통 안정성 감식을 진행하는 단계4); 안정한 계통을 불임계와 검정 교배시키는 단계5); 검정 교배된 후대의 불임도를 조사하여 우량 유지계를 선별 육종하는 단계6); 유도계로 검정 교배된 후대를 불임주에 수분시키는 단계7); 유도된 후대 육성을 조사하고, 계속하여 유도계로 불임 단주에 수분시켜 새로운 불임계를 선별 육종하는 단계8); 불임계를 유지계와 검정 교배시켜 혼성화된 새로운 조합을 선별 육종하는 단계9)를 포함하는 유채 배가 반수체 유도계를 이용하여 십자화과 채소 품종을 선별 육종하는 방법을 제공한다.

Description

유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법
본 발명은 농업에 관한 것으로, 특히 십자화과 채소의 혼성화된(hybrid) 새로운 품종 선별 육종계 및 불임계, 유지계의 신속한 선별 육종 방법에 관한 것이다.
십자화과 채소는 중국의 겨울 채소의 큰 종류이고 중국의 겨울 채소의 주요한 자연이며 주로 양배추, 콜리플라워(브로콜리), 배추(배추, 애배추), 무우, 개채류 십자화과 채소(청채, 갓, 양배추, 동갓 등)을 포함한다. 현재, 십자화과 채소는 기본적으로 혼성화된 품종 선별 육종을 달성하고 주요하게 이용하는 잡종 우세 경로는 세포질 불임 유형이며 양배추, 콜리플라워(브로콜리), 무는 주로 무우 세포질 불임 유형이고, 다른 십자화과 채소는 주로 세포질 불임으로 혼성화된 품종을 선별 육종한다. 십자화과 채소는 영양체를 얻는 것을 주요한 목적으로 하고, 품종 선별 육종은 주로 불임계와 유지계를 선별 육종하는 것을 가장 중요한 목적으로 하기에 복원계가 필요없다. 새로운 유지계와 불임계 검정 교배(test cross)이면 우수한 혼성화된 조합 또는 새로운 품종을 선별 육종할 수 있다.
십자화과 채소 새로운 품종 선별 육종에 있어서, 먼저 새로운 자가 수분계 또는 유전적으로 안정한 동형 접합 계통(株系;strain)-동형 접합계(자가 수분계)를 선별 육종한다. 다음, 동형 접합 계통과 세포질 불임계 검정 교배시켜 복원과 유지 관계를 판단하고 만약 유지계와 불임계가 새로운 혼성화된 품종을 혼성화 검정 교배시키거나 상기 유지계를 이용하여 상기 유지계 특성을 구비하는 불임계를 다중 세대 역교배하여 선별 육종하며 새로운 불임계와 복수개의 유지계를 검정 교배시켜 복수개의 우수한 조합 또는 품종을 선별 육종해 낼 수 있다. 동형 접합 계통과 불임계를 검정 교배시키면 검정 교배된 후대는 복원계도 아니고 유지계도 아니며 통상적으로 도태시키거나 다음 단계의 유지계 선별 육종에 진입한다. 십자화과 채소의 혼성화의 확대를 실현시키기 위하여, 현재 선별 육종한 동형 접합 자가 수분계는 복원 효율이 생산에서 여전히 품종의 선별 육종에 사용될 수 있는 복원 효율을 구비하나, 자원의 보호를 위해, 육종자는 유지계의 선별 육종을 택하는 경향이 있다.
통상적인 십자화과 채소 자가 수분계의 선별 육종은 두 개 또는 복수개의 유전적 배경이 상이한 품종계의 혼성화, 다계교배(聚合雜交; convergent cross) 또는 역교배를 통해 혼성화된 F1세대(또는 역교배된 BC1세대, 목표 형질의 선택 요구에 따라 다중 세대 역교배를 진행하여 BC2, BC3…… 등을 형성할 수 있음)를 형성하고, 후대를 역교배시키거나 F1세대는 자가 수분하여 F2세대를 형성하며, F2세대는 다시 우수한 단주(單株)를 선택하여 F3세대를 형성하고, F3세대는 다시 단주를 선택하여 자가 수분하며, F5 ~ F6세대에서야 안정한 십자화과 채소의 새로운 품종을 획득할 수 있고 1년을 1세대로 계산하면 필요한 시간은 대략적으로 6 ~ 7년이다. 안정한 자가 수분계는 다시 불임계와 검정 교배하고 다중 세대 역교배하여 새로운 불임계를 선별 육종하는 것은 5 ~ 6세대를 역교배하여야 한다. 따라서, 통상적인 방법으로 십자화과 채소의 이중계 새로운 품종을 선별 육종하는 것은 10 ~ 12년 정도의 시간이 필요하고 선별 육종된 혼성화된 새로운 조합 또는 새로운 품종의 효율은 매우 낮다.
현재, 십자화과 채소에서 유도계 또는 배가 반수체 유도계에 대한 보도가 없다. “유도계”는 상기 식물을 부본으로 이의 화분으로 동일한 유형의 식물체에 수분하여 동일한 유형의 식물체(모본)를 유도하여 반수체, 배가 반수체 (DH계) 등과 같은 상응한 효과를 발생하는 것을 지칭한다. 식물에서 유도계를 사용하여 새로운 품종의 선별 육종을 가장 많이 진행하는 것은 옥수수이지만, 옥수수의 유도계도 반수체 유도계이다. 가장 초기의 옥수수 반수체 유도계는 stock6이고, 상기 유도계는 단지 옥수수를 유도하여 반수체를 생성한 후, 반수체 식물체는 다시 인위적으로 염색체 증식을 진행하여 동형 접합 이배체(배가 반수체)를 형성하며 유도 효율은 비교적 낮고, 통상적으로 유도 효율은 10 ％ 이하(수확한 종자에서 획득한 반수체 개수로 계산함)이다.
본 발명의 목적은 십자화과 채소 육종 재료 및 품종을 신속하고 효과적으로 선별 육종하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 3세대(2년 또는 3년)만 필요로 하여 십자화과 채소 유전적으로 안정한 계통을 획득하여 십자화과 채소의 선별 육종 재료, 혼성화된 품종의 효율 및 타당성을 향상시킨다.
본 발명의 목적은 하기와 같이 달성된다.
본 발명의 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 육종하는 방법은 하기와 같은 단계를 포함한다.
단계1)에서, 화과 채소 육종 자원은 자원 재료의 질병 저항성, 항역(stress resistance), 재배 특성, 수율 특성, 품질 특성 등 형질을 수집하고 감식하며, 상이한 유래, 재배 특성 유전 차이가 큰 자원 재료를 분류하고 넘버링한다. 개화 시간을 조사하고 개화 시간에 따라 유채 배가 반수체 유도계의 파종을 지연시킨다. 통상적으로 유채 배가 반수체의 파종 시간은 전년 10월 20일 ~ 11월5일 사이이기에 유채 배가 반수체 유도계가 다음해에 양배추, 배추, 무우, 콜리플라워 등 십자화과 채소 개화기를 맞출 수 있도록 확보한다.
단계2)에서, 상기 단계1)에서 감식한 우량하고 유전적으로 불안정한 자원 재료를 초기 개화기에 인위적으로 제웅(불임 자원은 직접 수분시킬 수 있음)하고, 주머니를 씌워 격리시키며, 2 ~ 4일 후, 유채 배가 반수체 유도계로 수분시키고, 단주에 주머니를 씌워 유도된 후대를 수확한다.
단계3)에서, 상기 단계2)에서 수확한 유도된 후대를 재배하고 묘기에서 유세포 분석기(flow cytometer)로 유도된 후대의 배수성을 감식하며, 배수체, 반수체 및 유채 특성을 구비하는 식물체를 도태시키고, 육성이 정상이며 배수성이 정상인 단주를 선택하여 주머니를 씌워 자가 수분시키거나 새싹 시기에 새싹을 강제적으로 자가 수분시킨다.
단계4)에서, 상기 단계3)에서 유도된 후대의 정상적으로 자가 수분된 후대를 계통 재배하고 계통 내의 안정성과 일치성을 감식하며 계통 내의 일치성을 분자 마커(SSR 또는 SRAP)로 감식하고, 안정한 계통을 부본으로 하고 안정한 세포질 불임계(무우 세포 불임 등 세포질 불임 유형)를 모본으로 하여 검정 교배시키며, 검정 교배된 후대 종자를 수확한다.
단계5)에서, 상기 단계4)에서 검정 교배된 후대 종자를 재배하고, 검정 교배된 후대 식물체의 육성을 감식하며, 검정 교배된 후대가 완전한 불임인 경우, 단계4)의 부본에 대응되는 것은 상기 불임 유형의 유지계인 것으로 간주하여, 동시에 상기 유지계에 대하여 자가 결실률 감식을 진행하고; 검정 교배된 후대가 완전 가임인 경우, 단계4)의 부본에 대응되는 것은 상기 불임 유형의 복원계이기 때문에, 대응되는 복원계는 도태되고; 검정 교배된 후대가 불임이 불완전한 경우(절반 복원계 절반 유지계), 단계4)의 부본에 대응되는 것은 복원계도 아니고 유지계도 아니기 때문에 도태되거나 교배시켜 새로운 유지계로 전환 육종한다.
단계6)에서, 상기 단계5)에서 선별 육종된 유지계를 동일한 유형의 불임계와 검정 교배시키고, 수율, 품질, 질병 저항성을 구비하는 새로운 혼성화된 조합 또는 품종을 선별 육종한다.
단계7)에서, 상기 단계5)에서 선별 육종된 유지계를 동일한 유형의 불임계와 검정 교배시킨 후, 검정 교배된 후대의 재배 특성에 따라 상기 유지계와 검정 교배된 후대를 역교배시키거나 다중 세대 역교배시키거나 검정 교배 1세대에 유채 배가 반수체 유도계로 검정 교배, 역교배 또는 다중 세대 역교배 불임 단주에 수분시키고, 주머니를 씌워 격리시킨다.
단계8)에서, 상기 단계7)에서 수확한 단주 종자를 재배하고 개화기에 육성을 감식하며 불임 단주를 계속하여 유채 배가 반수체 유도계로 수분 유도하고 단주를 주머니를 씌워 격리시키며 단주로 수확한다.
단계9)에서, 상기 단계8)에서 2차 유도된 불임 단주 후대는 재배 특성, 분자 마커(SSR 또는 SRAP)를 통해 계통 내의 안정성, 일치성 감식을 진행한다. 재배 특성이 일치하며, 계통 내 안정한 불임 계통에 대해 십자화과 채소의 새로운 세포질 불임계를 형성하고, 유채 배가 반수체 유도계로 상기 불임 계통을 3차 유도 수분시켜 유도 효율을 감식한다.
단계10)에서, 상기 단계9)에서 3차 유도된 후대 감식 유도계는 상기 불임 계통의 유도 능력을 감식하고 만약 3차 유도된 후대 계통 내의 재배 특성, 불임도가 매우 일치하며, 유도 능력(계통 내의 재배 특성, 높은 불임도 식물체가 전체 유도된 후대에서 차지하는 비율)이 98 ％ 이상이면, 최종적으로 유채 배가 반수체 유도계로 새롭게 형성된 불임 계통(또는 안정한 불임계)의 유전 특성과 불임 상태를 유지한다.
단계11)에서, 상기 단계8)에서 2차 유도 후 형성된 불임 계통을 유채 배가 반수체 유도계로 수분시켜 이의 불임 형태를 유지하고 상기 불임 계통(또는 안정한 불임계)의 유전 특성은 유채 배가 반수체 유도계와 관련이 없다. 상기 불임 계통은 상기 단계7)의 유지계(임시 유지계) 의 특성을 유지하고, 상기 유지계(임시 유지계)는 일정한 유전적 차이를 구비하거나 50 ％ ~ 99 ％의 유지계(임시 유지계) 핵 유전자를 함유하거나 유지계(임시 유지계) 핵 유전자를 어느 정도 함유하는 것은 유지계(임시 유지계)와 불임 단주의 역교배 대수에 따라 결정되며, 상이한 정도의 유지계(임시 유지계)의 핵 유전자를 함유하는 외에 단계4)의 안정한 세포질 불임계의 핵 유전자를 더 함유한다.
단계12)에서, 상기 단계9)에서 형성된 상이한 유전 차이(또는 상이한 유전적 배경)의 세포질 불임 계통(안정한 불임계)는 유채 배가 반수체 유도계가 세포질 불임계에 대한 유도 능력(98 ％보다 큼)에 따라 동일한 유지계(유채 배가 반수체 유도계)로 유지할 수 있고, 유채 배가 반수체 유도계는 세포질 불임계의 만능 유지계가 된다. 동시에 하나의 유지계로 복수개의 유전적으로 안정하고 상이한 유전적 배경을 갖는 세포질 불임계를 유지한다.
단계13)에서, 단계1)의 상이한 유래, 재배 특성 및 유전적 차이의 재료 특성 및 대응되는 유래에 기초하여 유도된 안정한 유지계를 단계12)에서 형성된 안정한 새로운 불임계와 검정 교배시켜 수율 잠재력, 질병 저항성, 항역을 구비하는 새로운 십자화과 채소 품종을 선별 육종하여 십자화과 채소의 2계통 매칭에 의한 혼성화된 새로운 품종을 선별 육종한다.
본 발명을 사용하여 십자화과 채소 안정한 유전적 후대를 획득하는 것은 유채 배가 반수체 유도계 모체 식물체가 F1세대에서 단성생식(parthenogenesis)되도록 유도하고 F2세대에서 안정한 배가 반수체 개체를 형성하며 F3세대에서 안정성, 일치성 감식을 진행하여 안정한 유전적 후대를 획득한다.
상기 유채 배가 반수체 유도계의 선별 육종 방법은,
두 개의 유채 친본 재료의 혼성화된 F1세대 종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시켜 증식된 F1세대 식물체를 획득하는 단계①;
증식된 F1세대 식물체를 자가 수분시키거나 강제적으로 자가 수분시켜 F2세대를 획득하고 F2세대를 논밭 재배 관찰하며, 각 단주의 육성을 감식하고, 가임 후대를 선택하여 자가 수분시켜 F3세대를 획득하며, 형태, 세포학 및 분자 마커 감식을 통해 F3세대의 동형 접합성을 감식하고, 후세대 DNA를 중합효소 연쇄 반응 증폭시키고 전기영동으로 각 특이적 프라이머에 의해 증폭된 단주의 DNA 밴드 패턴 및 스트립 개수를 관찰하며, 각 단주는 모두 두 개의 친본의 혼성화된 후대를 표시하고, 각 단주 사이의 분자 마커 그래프 패턴은 일치하며 이는 이러한 단주가 동형 접합계인 초기 세대 안정계인 것을 나타내는 단계②;
획득한 초기 세대 안정계는 적어도 10개의 유채 일반 동형 접합 안정계와 상반교배하고, F1세대, F2세대는 초기 세대 안정계의 유전 특성 즉 단성생식 특성을 구비하는 지의 여부를 감식하며; 상기 상반교배에서 F1분리가 존재하고, F2세대에서 부분적으로 안정한 계통이 나타나면, 대응되는 초기 세대 안정계는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계인 단계③
를 포함하는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 선별 육종하는 단계(1);
단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 우성 형질을 구비하는 유채와 교배시켜(예컨대 우성 난쟁이 대, 보라색 잎, 꽃잎, 노란색 잎, 에루카산 등 형질) 혼성화된 F1세대 종자를 얻고 혼성화된 F1종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시켜 우성 형질을 갖는 증식된 F1식물체를 획득하는 단계①;
우성 형질을 갖는 증식된 F1식물체를 현미경으로 관찰하거나 유세포 분석기로 염색체 배수성을 감식하여 우성 형질을 갖는 배수체의 식물체를 선택하고, 비정상적인 배수체, 이수 배수체 식물체 및 우성 형질을 갖지 않는 배수체 식물체를 도태시키며; 우성 형질의 배수체 식물체는 배수성 유전이 안정하고 결실성이 좋으며 단성생식 유전 특성을 구비하고 우성 형질(예컨대 우성 난쟁이 대, 보라색 잎, 꽃잎, 노란색 잎, 에루카산 등 형질)을 갖는 육배체 또는 팔배체 유채 식물체인 단계②
를 포함하는 우성 유전적 형질을 갖고, 단성생식 유전 특성을 구비하며 배수성 유전이 안정한 배수체 유채를 선별 육종하는 단계(2);
배수성 유전이 안정적이고, 단성생식 유전 특성을 구비하며, 우성 형질을 갖는 배수체 식물체의 우성 형질은 검정 교배된 후대에서 생성된 혼성화된 식물체를 제거할 수 있고, 만약 검정 교배된 후대에서 우성 형질 식물체, 또는 이수 배수체 식물체가 나타나면 상기 식물체가 배수체 식물체와 모본이 교배되어 생성된 것을 나타내므로 상기 식물체를 제거하는 단계①;
상기 단주 검정 교배된 후대는 완전 불임이 나타나고, 정상적인 배수성 즉 이배체 또는 사배체 유채이며, 우성 형질을 갖지 않고, 이는 상기 검정 교배된 후대에 대응되는 부본 유전자는 검정 교배된 후대에 진입하지 않으며 우성 배수체 식물체가 유채 배가 반수체 유도계인 것을 나타내는 단계②
를 포함하는 유채 배가 반수체 유도계 감식하고 유도 능력을 측정하는 단계(3)
를 포함한다.
유채 배가 반수체 유도계에서 선별 육종하는 것은 두 개의 친본 재료 혼성화된 F1세대 종자 또는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 우성 형질을 구비하는 유채 혼성화시켜 얻은 혼성화된 F1세대 종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시키는 것이고, 구체적인 방법은 하기와 같다.
단계1)에서, 순도가 75 ％인 알코올로 종자 표면을 25 ~ 40초 동안 소독하고 0.1 ％의 염화수은(II)으로 12 ~ 17분 동안 소독한 후, 무균수로 종자 표면의 염화수은(II)을 깨끗하게 세척하며 무균 종이로 종자 표면의 수분을 흡수한 후 종자를 제1 배지에 접종시킨다.
단계2)에서, 종자를 제1 배지에 뿌리 내리고 발아시키며, 배양 조건은, 온도가 23 ~ 25 ℃이고, 낮 조명이 12 ~ 16시간이며, 조명 강도가 2000 ~ 3000럭스이고, 야간 배양이 8 ~ 12시간이며, 식물체가 1 ~ 2개의 진잎으로 자라면, 하부 배축으로부터 식물체를 절단하여 계속하여 제2 배지에 성장시킨다.
단계3)에서, 절단한 식물체를 계속하여 제2 배지에 삽입시켜 계속하여 배양시키고, 측싹을 분화시킨 후, 측싹 및 식물체를 제3 배지에 옮겨 뿌리 배양시킨다.
단계4)에서, 뿌리 배양 2주 후, 식물체에서 튼실한 뿌리가 자라난 후, 식물체를 실온에서 3 ~ 7일 동안 배양하고 식물체를 꺼내어 식물체의 배지를 수돗물로 깨끗하게 세척하며 침지 완충액에 15 ~ 30분 동안 침지시킨 후 온실로 이식하고 온실 온도는 16 ℃ ~ 25 ℃이며 상대습도는 60 ~ 80 ％이고 이식 생존율을 95 ％ 이상으로 보장할 수 있다.
상기 제1 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 ~ 1.5 mg
염색체 증식 유도제: 30 ~ 70 mg
자당: 20 ~ 30 g
아가: 8 ~ 10 g이며,
제1 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
상기 제2 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 ~ 1 mg
염색체 증식 유도제: 20 ~ 40 mg
자당: 20 ~ 30 g
아가: 8 ~ 10 g이고,
제2 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이며,
상기 제3 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
α-나프탈렌 아세트산: 0.03 ~ 0.5 mg
염색체 증식 유도제: 5 ~ 20 mg
자당: 20 ~ 30 g
아가: 8 ~ 10 g이며,
제3 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
상기 침지 완충액은 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
물: 1 L
이바오(EQUATION CONTACT®;易保; 파목사돈(famoxadone)) 또는 커루(CURZATE®; 克露; 사이목사닐(cymoxanil)): 0.6 ~ 1.2 g
α―나프탈렌 아세트산: 0.5 ~ 1 mg이다.
유채 배가 반수체 유도계는 유채와 십자화과 채소가 배가 반수체 후대를 생성하도록 직접 유도하여 인위적인 염색체 증식을 진행할 필요없이 동형 접합계를 획득하고 유도 효율이 높고 최대로 100 ％에 달할 수 있으며, 통상적인 유도 효율은 모두 50 ％ 이상이다. 배가 반수체 유도계가 모체 식물체를 유도하여 배가 반수체를 생성하는 주요한 원리는, 유도계는 모체 식물체를 유도하고 대포자 생식 세포(알세포)는 단성생식 효과를 발생하며, 알세포는 염색체 증식을 진행할 수 있고 즉 알세포가 단성생식하여 생성된 후대는 배가 반수체이며, 상기 현상의 메커니즘은 여전히 불명확하다.
상기 염색체 증식 유도제는 콜히친(colchicine), 트리플루랄린, 오리자린 중 적어도 하나를 사용한다.
상기 유채 배가 반수체 유도계(육배체 또는 팔배체 식물체)의 기본원리는 유도계는 단성생식 유도 유전자를 구비하고, 유도계가 부본일 경우, 유도계 염색체(또는 유전자)는 모체 식물체 염색체와 융합되지 않으며, 모체 식물체(즉 알세포, 이배체)를 유도하여 단성생식 효과를 발생하고, 모체 식물체 알세포 염색체 자가 증식되어 배가 반수체를 형성한다.
본 발명의 방법은 십자화과 채소 육종 재료 자가 수분계(DH계), 유지계, 새로운 세포질 불임계의 선별 육종에 신속하게 사용될 수 있다. 2년 또는 3세대의 시간 내에 상기 재료를 획득하여 십자화과 채소의 육종 시간을 크게 절감하고 육종 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 하기 장점을 구비한다.
1. 본 발명의 방법은 십자화과 채소 자가 수분계(유지계)를 신속하게 선별육종하여 가장 빠르면 3년 내에 안정적으로 유전된 자가 수분계(유지계)를 획득할 수 있거나, 새로운 불임계를 선별 육종할 수 있어, 가장 빠르면 4년 내에 안정한 불임계를 획득할 수 있고, 5 ~ 7년 시간 내에 십자화과 채소의 이중 매칭시켜 새로운 품종을 선별 육종하여 십자화과 채소의 선별 육종 주기를 절반 이상 절감하여 십자화과 채소 새로운 품종 선별 육종의 효율을 향상시키며 인력 및 물적 자원을 절약한다.
2. 본 발명의 방법은 전체 십자화과 채소에서 적용될 수 있어 적용 분야가 넓다.
3. 유채 배가 반수체 유도계는 모체 식물체가 배가 반수체를 생성하도록 직접 유도하여 인위적인 염색체 증식을 진행할 필요없이 하나의 단계로 안정한 후대를 형성할 수 있다.
4. 본 발명의 방법은 십자화과 채소 혼성화된 품종 선별 육종에 적용되고, 특히 무우 세포질 불임, 핵질 상호 작용 세포질 불임계, 유지계와 같은 십자화과 채소 세포질 불임계 재료의 선별 육종에 사용된다.
도 1은 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 새로운 품종을 선별 육종하는 방법의 흐름도이다.
도 2는 유채 배가 반수체 유도계의 선별 육종 흐름도이다.
도 3은 유채 초기 세대 안정계를 획득하는 방법의 흐름도이다.
도 4는 유채 배가 반수체 유도계Y3560의 선별 육종 흐름도이다.
도 5는 유채 배가 반수체 유도계Y3380의 선별 육종 흐름도이다.
도 6은 유채 초기 세대 안정계P3―2의 선별 육종 흐름도이다.
도 7은 양배추 유지계 용감(蓉甘)B012의 선별 육종도이다.
도 8은 양배추 무우 세포질 불임계 용감A105의 선별 육종도이다.
도 9은 무우 불임계 무용(蘿蓉)A007의 선별 육종도이다.
도 10은 P3-2 사배체 유채 뿌리 끝 염색체의 배수성 감식도이다.
도 11은 P3-2사배체 유채 유세포 분석 배수성 감식도이다.
도 12는 Y3380의 유세포 분석 배수성 감식도이다.
도 13은 Y3560의 유세포 분석 배수성 감식도이다.
실시예1:
도 1, 도 2, 도 5, 도 7을 참조하면, 수년간 수집한 양배추 자원을 논밭 재배하고, 형질을 관찰하며, 여기서 감(gan; 甘)336은 외관 형태, 풍산성, 질병 저항성이 비교적 좋으나, 군체 내부가 불안정하고, 유전 분리가 존재한다. 전년 가을 8월 중순에 파종하고, 9월 중순에 정식(定植)하며, 12월 하순에 영양을 제거하고 다시 정식하며, 첫 해 3월말 초기 개화기에 감336을 인위적으로 제웅하고, 주머니를 씌워 격리시키며, 제웅 3일 후, 유채 배가 반수체 유도계Y3380를 사용하여 수분을 유도하고, 주머니를 씌워 격리시킨다. 그 해 8월에 유도된 후대를 논밭에 파종하고, 25개의 후대의 외형이 양배추와 100 ％ 일치하며 유세포 분석기로 배수성을 감식한 결과 모두 이배체인 것을 확인한다. 두번째 해의 개화기에 유도된 후대 단주를 새싹을 벗겨 강제적으로 자가 수분시키고 주머니를 씌워 격리시키며 단주는 18개를 수확한다. 세번째 해에 유도된 후대 계통을 감식하고, 18개의 계통이 전부 일치하고, 각 계통 사이에 부분적 차이가 존재하는 것을 확인한다. 18개의 계통과 양배추 불임계(무우 세포질 불임) 룽루어A019를 검정 교배시켜, 18개의 안정한 계통 검정 교배된 후대는 모두 고도로 불임이고, 18개의 안정한 계통이 불임계에 대한 것은 모두 유지계이며, 형태 관찰 및 수율 조사를 통해 012계통 수율 우세, 질병 저항성, 항역성이 더욱 우수한 것을 확인하고 최종 용감B012의 유지계를 형성하여, 직접 양배추 무우 세포질 불임계와 조합 검정 교배시켜 새로운 품종을 선별 육종할 수 있다.
본 실시예에서, 유채 배가 반수체 유도계는 하기 방법을 통해 획득한다.
도 2, 도 4, 도 6, 도 7, 도 13을 참조하면, 본 출원인이 획득한 양배추형 유채 사배체의 초기 세대 안정계P3-2는 20개의 동형 접합 양배추형 사배체 유채와 상반교배시키고, 3개의 상반교배 F1세대에서 분리가 나타나고 이러한 3개의 조합의 F2세대에서 안정한 계통이 나타나며, P3-2가 단성생식 유전 특성을 구비한 것을 설명한다. P3-2를 사용하여 에루카산, 난쟁이 대 유채4247와 상반교배(난쟁이 대, 에루카산은 우성 형질임)시킨 후, 혼성화된 F1세대 종자를 염색체 증식시키고, 증식된 후대를 유세포 분석기로 감식하거나 뿌리 끝 현미경으로 관찰 감식한 결과 난쟁이 대 팔배체 식물체로 나타나며 상기 식물체를 Y3560으로 지칭한다.
도 2, 도 5, 도 6, 도 10, 도 11, 도 12를 참조하면, 본 출원인이 획득한 양배추형 유채 사배체의 초기 세대 안정계P3-2는 20개의 동형 접합 양배추형 사배체 유채와 상반교배시키고, 3개의 상반교배 F1세대에서 분리가 나타나고 이러한 3개의 조합의 F2세대에서 안정한 계통이 나타나며, P3-2가 단성생식 유전 특성을 구비한 것을 설명한다. P3-2를 사용하여 사배체 양배추형 난쟁이 대 유채 D3-5와 상반교배(난쟁이 대는 우성 형질임)시킨 후, 혼성화된 F1세대 종자를 염색체 증식시키고, 증식된 후대를 유세포 분석기로 감식하거나 뿌리 끝 현미경으로 관찰 감식한 결과 난쟁이 대 팔배체 식물체로 나타나며 상기 식물체를 Y3380으로 지칭한다.
본 실시예에서 P3-2를 난쟁이 대 유채 D3-5 혼성화된 F1, P3-2와 난쟁이 대, 에루카산 유채4247 혼성화된 F1종자를 배지에서 콜히친으로 진행하는 인위적인 염색체 증식의 방법은 하기와 같다.
1) 순도가 75 ％인 알코올로 종자 표면을 25초 동안 소독하고, 0.1 ％의 염화수은(II)으로 12분 동안 소독한 후, 무균수로 종자 표면의 염화수은(II)을 깨끗하게 세척하며 무균 종이로 종자 표면의 수분을 흡수한 후 종자를 제1 배지(염색체 증식 유도 배지)에 접종시키고;
2) 종자를 제1 배지에 뿌리 내리고 발아시키며, 배양 조건은 온도가 25 ℃이고, 낮 조명이 16시간이며, 조명 강도가 2000럭스이고, 야간 배양이 8시간이며, 식물체가 1 ~ 2개의 진잎으로 자라면, 하부 배축에서 식물체를 절단하여 계속하여 제2 배지에 성장시키고;
3) 절단한 식물체를 계속하여 제2 배지에 삽입시켜 계속하여 배양시키고, 측싹을 분화시킨 후, 측싹 및 식물체를 제3 배지(뿌리 내리는 배지)에 옮겨 뿌리 배양시키며;
4) 뿌리 배양 2주 후, 식물체에서 튼실한 뿌리가 자라난 후, 식물체를 실온에서 3일 동안 배양하고 식물체를 꺼내어 식물체의 배지를 깨끗하게 세척하며 침지 완충액에 15분 동안 침지시킨 후 온실로 이식하고, 온실 온도는 25 ℃이며 상대습도는 60 ％이고 이식 생존율을 95 ％ 이상으로 보장할 수 있다.
상기 제1 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 mg
콜히친: 50 mg
자당: 20 g
아가: 8 g이며,
제1 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
MS배지는 무라시게(Murashige)과 스쿠그(Skoog)가 발명하였으므로 MS로 약칭하며 이의 배합은 첨부 표1을 참조하고,
상기 제2 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 mg
콜히친: 30 mg
자당: 30 g
아가: 8 g이고,
제2 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이며,
상기 제3 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
α-나프탈렌 아세트산: 0.03 mg
콜히친: 20 mg
자당: 20 g
아가: 8 g이며,
제3 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
상기 침지 완충액은 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
물: 1 L
이바오 또는 커루: 0.6 g
α―나프탈렌 아세트산: 0.5 mg이다.
도 2, 도 3, 도 5을 참조하면, Y3380을 부본으로 하고, 양배추형 유채 세포질 불임계(0464A)와 검정 교배시키며, 검정 교배된 후대 50개는 모두 키가 큰 대이고 모두 사배체 유채이며, 그 중 49개는 전부 불임이고, 1개는 절반 불임이며, 형태 특징이 0464A와 완전히 동일하다. 아울러 P3-2를 사용하여 난쟁이 대 유채D3-5와 혼성화된 F1(비증식 식물체)을 부본으로 0464A와 검정 교배시켜 대조 검증으로 하고, 검정 교배된 후대 102개에서, 난쟁이 대가 62개이며, 키가 큰 대가 40개이고, 육성 분리가 비교적 크며, 전부 가임 73개, 절반 불임 20개, 전부 불임 9개가 나타난다. Y3380의 유전자는 검정 교배 식물체에 진입하지 않았고, 검정 교배된 후대는 0464A 단성생식으로 유래되며, 유도율은 98 ％이다. Y3380을 부본으로 양배추형 유채3954를 제웅하여 다계교배(3954는 F1, 중쌍11과 CAX가 혼성화되어 유래됨)시키고, 다계교배된 후대 F1는 분리되며, 각 F1은 자가 수분하고, F1자가 수분 식물체는 45개이다. 재배한 F2세대 계통은 45개이고, 안정한 계통 45개가 나타나며, 안정한 계통이 나타나는 비율은 100 ％이고, 유도율은 100 ％이다.
Y3380을 부본으로 하고 양배추형 유채3968과 제웅 다계교배시키고(3968는 F1세대이고, 중쌍11과 1365를 혼성화시켜 얻음), 다계교배된 후대 F1이 분리되며, 각 F1은 자가 수분하여 F1 자가 수분 식물체 52개를 얻는다. F2세대 계통을 52개 재배하면, 안정한 계통 28개가 나타나고, 안정한 계통이 나타나는 비율은 53.85 ％이고, 유도율은 53.85 ％이다.
Y3380을 부본으로 하고 양배추형 유채 중쌍11(통상적인 품종, 동형 접합계)과 제웅 혼성화시켜, 혼성화된 F1식물체 70개를 얻고, 70개의 F1형태는 중쌍11과 완전히 동일하며 각 단주는 자가 수분한 후 F2세대에서 분리가 나타나지 않고 안정한 계통이고, 중쌍11의 형태도 완전히 동일한 것은 F1세대가 순계인 것을 설명한다. 즉 Y3380을 중쌍11 혼성화시키는 과정에서 중쌍11이 단성생식을 발생하도록 유도하고 생성된 F1은 단성생식 자가 수분한 것이며 동형 접합계이므로 F1은 안정하고 F2도 안정하며 중쌍11과의 형태도 완전히 동일하며 상기 유도율은 100 ％이다.
마찬가지로, Y3380을 부본으로 하고 배추형 유채 아안황(雅安黃) 유채 YH(이배체 유채, 2n = 20)와 제웅 혼성화시켜, 혼성화된 F1식물체 98개를 얻고, 97개의 F1형태는 YH와 완전히 동일하며 각 단주가 자가 수분한 후 F2세대의 형태는 모두 이배체이고 외형은 YH와 일치한 것은, Y3380을 YH와 혼성화시키는 과정에서 YH가 단성생식을 발생하도록 유도한 것을 설명하며, 생성된 F1은 단성생식 자가 수분된 것이고, YH와의 형태는 완전히 동일하며, 상기 유도율은 98.9 ％이다. 최종적으로, 우성 난쟁이 대 팔배체 식물체Y3380은 유채 배가 반수체 유도계로 확인된다.
도 2, 도 3, 도 4를 참조하면, Y3560을 부본으로 하고, 양배추형 유채 세포질 불임계(0464A)와 검정 교배시키며 검정 교배된 후대 80개는 모두 키가 큰 대이며, 76개는 사배체 유채이며, 2개는 이배체이고, 2개는 팔배체이며; 여기서 76개의 사배체 식물체는 전부 불임이고, 4개는 절반 불임이며 형태 특징이 0464A와 완전히 동일하다. 아울러 P3-2를 사용하여 난쟁이 대, 에루카산 유채4247 혼성화된 F1(비증식 식물체)을 부본으로 0464A와 검정 교배시켜 대조 검증으로 하고, 검정 교배된 후대 153개에서, 난쟁이 대가 102개이며, 키가 큰 대가 51개이고, 육성 분리가 비교적 크며, 전부 가임 65개, 절반 불임 35개, 전부 불임 53개가 나타난다. Y3560의 유전자는 검정 교배 식물체에 진입하지 않은 것을 설명하고, 검정 교배 후대는 0464A의 단성생식으로 유래되며, 유도율은 95 ％이다.
Y3560을 부본으로 하고 배추형 유채 아안황 유채 YH(이배체 유채, 2n = 20)와 제웅 혼성화시켜, 혼성화된 F1식물체 145개를 얻고, 143개의 F1형태는 YH와 완전히 동일하며 각 단주가 자가 수분한 후 F2세대의 형태는 모두 이배체이고 외형은 YH와 일치한 것은, Y3560을 YH와 혼성화시키는 과정에서 YH가 단성생식을 발생하도록 유도한 것을 설명하며, 생성된 F1은 단성생식 자가 수분한 것이고, YH와의 형태도 완전히 동일하며 상기 유도율은 98.6 ％이다.
마찬가지로 Y3560을 부본으로 하고 개채형 유채 GW(사배체 유채, 2n = 36)와 제웅 혼성화시켜, 혼성화된 F1식물체 124개를 얻고, 123개의 F1형태는 GW와 완전히 동일하며, 각 단주가 자가 수분한 후 F2세대의 형태는 모두 사배체이고, 외형은 YH와 일치한 것은, Y3560을 GW와 혼성화시키는 과정에서 GW가 단성생식을 발생하도록 유도한 것을 설명하며, 생성된 F1은 단성생식 자가 수분된 것이고, GW와의 형태는 완전히 동일하며, 상기 유도율은 99.2 ％이다.
최종적으로, 우성 난쟁이 대 팔배체 식물체Y3560은 유채 배가 반수체 유도계로 확인된다.
도 3, 도 6, 도 10, 도 11을 참조하면, 초기 세대 안정계P3-2 방법은 하기와 같다.
양배추형 유채 F009(사배체, 염색체2n = 38)를 배추형 유채 YH(이배체, 아안황 유채, 염색체2n = 20)를 새싹을 벗겨 인위적으로 제웅 혼성화시켜 F1세대 혼성화된 종자를 획득한다. F1세대 혼성화된 종자는 배지에서 콜히친으로 인위적인 염색체 증식을 진행한다. 증식된 F1세대 식물체를 자가 수분시켜(또는 강제적으로 자가 수분시킴) F2세대를 획득하고, F2세대를 논밭 재배 관찰하며, 육성 감식 즉 아세토카민(acetocarmine)을 통해 화분을 염색하고, 화분 육성을 판단하면, 세가지 상황이 나타난다(1. 반수체 식물체는 화분이 극히 적고, 육성이 극히 낮으며; 2. 배수체 식물체는 완전 불임이고, 꽃 기관 발육이 저해되어, 정상적으로 개화할 수 없으며, 화분이 없고; 3. 정상 가임 식물체는 화분량이 많고 화분 육성이 95 ％ 이상임). F2세대의 정상 가임 단주를 자가 수분시켜 F3세대를 획득한다. F3세대에 대하여 동형 접합성 감식을 진행하여, F3세대 단주 계통을 재배하고, 32 ％의 가임 계통 단주 식물체는 일치하며, 개화 결실이 정상이다. 일치한 계통에 대하여 세포학 감식을 진행하고, 염색체 개수는 일치하고(38개), 염색체형태는 이상이 나타나지 않는다. SSR 분자 마커는 DNA 중합 효소 연쇄 반응을 통해, 전기 영동으로 각 특이적 프라이머 증폭하의 단주 DNA 밴드 패턴을 관찰하고, 각 단주가 모두 F009을 YH와 혼성화시킨 후대인 것을 나타내며, 각 단주 DNA 증폭 개수 및 밴드 패턴은 일치하고, 이러한 계통이 동형 접합계, 즉 초기 세대 안정계인 것을 판단할 수 있다. 여기서 잎이 비교적 크고, 갈라진 잎이 없으며, 잎이 치밀하고, 함유율이 55 ％인 하나의 양배추(염색체 38개) 유채 초기 세대 안정계를 P3-2로 지칭한다.
본 실시예에서 F1세대 혼성화된 종자를 배지에서 콜히친을 사용하여 인위적으로 증식시키는 구체적인 방법은 하기와 같다.
1) 순도가 75 ％인 알코올로 종자 표면을 25초 동안 소독하고, 0.1 ％의 염화수은(II)으로 12분 동안 소독한 후, 무균수로 종자 표면의 염화수은(II)을 깨끗하게 세척하며 무균 종이로 종자 표면의 수분을 흡수한 후 종자를 제1 배지(염색체 증식 유도 배지)에 접종시키고;
2) 종자를 제1 배지에 뿌리 내리고 발아시키며, 배양 조건은 온도가 25 ℃이고, 낮 조명이 16시간이며, 조명 강도가 2000럭스이고, 야간 배양이 8시간이며, 식물체가 1 ~ 2개의 진잎으로 자라면, 하부 배축에서 식물체를 절단하여 계속하여 제2 배지에 성장시키고;
3) 절단한 식물체를 계속하여 제2 배지에 삽입시켜 계속하여 배양시키고, 측싹을 분화시킨 후, 측싹 및 식물체를 제3 배지(뿌리 내리는 배지)에 옮겨 뿌리 배양시키며;
4) 뿌리 배양 2주 후, 식물체에서 튼실한 뿌리가 자라난 후, 식물체를 실온에서 3일 동안 배양하고 식물체를 꺼내어 식물체의 배지를 깨끗하게 세척하며 침지 완충액에 15분 동안 침지시킨 후 온실로 이식하고 온실 온도는 25 ℃이며 상대습도는 60 ％이고 이식 생존율을 95 ％ 이상으로 보장할 수 있다.
상기 제1 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 mg
콜히친: 30 mg
자당: 20 g
아가: 8 g이며,
제1 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
MS배지는 무라시게(Murashige)과 스쿠그(Skoog)가 발명하였으므로 MS로 약칭하며 이의 배합은 첨부 표1을 참조하고,
상기 제2 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
MS 배지: 1 L
6-벤질 아데닌: 0.5 mg
콜히친: 20 mg
자당: 30 g
아가: 8 g이고,
제2 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이며,
상기 제3 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
MS 배지: 1 L
α-나프탈렌 아세트산: 0.03 mg
염색체 증식 유도제: 5 mg
자당: 20 g
아가: 8 g이며,
제3 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
상기 침지 완충액은 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
물: 1 L
이바오 또는 커루: 0.6 g
α―나프탈렌 아세트산: 0.5 mg이다.
Figure 112018107267567-pct00001
실시예2:
도 1, 도 2, 도 4, 도 5, 도 8을 참조하면, 원래의 양배추 불임계를 개선하고, 불임계의 매칭력 질병 저항성 및 내저장 특성을 향상시키기 위하여, 양배추 자가 수분 불친화계(높은 배합력 품종계)인 감121을 내보존성 품종계인 감051과 혼성화시키고, 혼성화된 F1세대를 개화기에 인위적으로 제웅하며, 유채 배가 반수체 유도계Y3560로 수분 유도하고, F2세대(유도 1세대)에서 15개의 단주를 획득하며, 조사를 거쳐 확인한 결과, 15개 단주는 모두 양배추 외형이고, 모두 이배체이며, 15개 단주를 주머니를 씌워(새싹을 벗김) 자가 수분시키고, 화분을 취하여 양배추 불임계(무우 세포질 불임)인 룽루어A019와 검정 교배시키며, 자가 수분된 후대를 계통 내의 안정성 및 일치성 감식을 진행하고, 검정 교배된 후배는 일치성, 불임도 감식을 진행하며, 그 결과 자가 수분된 후대의 계통 내부는 모두 일치하고, 모두 이배체이며, 검정 교배된 후대도 고도로 일치하며 모두 불임이지만, 하나의 계통105만 내보존성, 머리 부분이 편평한 특성을 구비하고 검정 교배된 후대의 수율이 높고 질병 저항성이 우수하다. 유채 배가 반수체 유도계Y3380을 사용하여 계속하여 105계통에 대응되는 검정 교배된 후대에 단주 수분하고, 격리시켜 단주 종자를 수확한다. 105개의 검정 교배된 식물체의 유도된 후대를 논밭 재배하여, 45개의 식물체를 획득한 결과, 42개의 식물체가 완전히 양배추의 특성을 구비하고 이배체이며 3개의 식물체의 외관은 유채 혼성화된 식물체의 특성과 같고, 배수성은 3배체이며, 42개의 단주는 고도로 불임이고, 계속하여 Y3560을 사용하여 내보존성, 머리 부분이 편평한 특성을 구비하는 불임 단주를 수분하며, 주머니를 씌워 격리시키켜, 단주에서 종자를 수확하고, 30개의 계통 식물체 종자를 획득하며, 30개의 계통에 대해 외관 형태, 재배 특성, 분자 마커(SRAP)로 계통 내의 일치성 및 안정성 감식을 진행하고, 여기서 10개의 계통, 계통 내의 일치성 및 안정성을 고도로 일치하며, 여기서 2개의 계통은 내보존성, 질병 저항성, 높은 수율성을 구비하고, 2개의 계통의 각 계통에서 10개를 선택하여 Y3560과 Y3380로 각각 5개를 수분하며, 주머니를 씌워 격리시키고, 5개의 계통을 혼합 수분하여, 두 개의 유도계가 안정한 불임계에 대한 유도 효율을 감식한 결과, Y3560이 하나의 불임계에 대한 유도 효율은 100 ％이고, 다른 하나의 불임계 유도 효율은 97 ％이며, Y3380이 두 개의 불임계에 대한 유도 효율은 각각 97 ％와 96 ％이므로, 최종적으로 하나의 새로운 불임계인 양배추 무의 세포질 불임계 용감A105를 형성하고, 상기 불임계는 Y3560로 상기 불임계를 수분 번식할 수 있다.
실시예3:
도 1, 도 2, 도 4, 도 5, 도 9에서, 원형 백색 무우Y23을 한국 무우H22와 혼성화시키고, F1세대를 개화기에 인위적으로 제웅하며, 유채 배가 반수체 유도계Y3380으로 수분시켜, F2세대 유도된 후대를 묘기(苗期)에서 유세포 분석기로 유도된 후대의 배수성을 감식한 결과, 10개의 단주에서, 1개의 단주는 반수체이고, 9개는 이배체이며, 외형은 모두 무우 특성이고, 9개의 단주를 개화기에 주머니를 씌워 자가 수분시키며, 자가 수분된 후대에 대해 계통 내의 일치성 및 안정성 감식을 진행하고, 9개의 계통에서, 계통 내는 고도로 일치하고 안정하며, 9개의 계통 화분을 사용하여 무우 불임계 룽루어A001와 검정 교배시키고, 검정 교배된 후대에 대하여 일치성, 배수성 감식을 진행하며, 9개의 검정 교배된 후대는 모두 불임이고, 그 중, 7호 계통의 질병 저항성, 수율 특성이 가장 높으며, 계속하여 유채 배가 반수체 유도계Y3560 화분을 사용하여 7호 계통으로 검정 교배된 후대를 수분 유도하고, 주머니를 씌워 격리시키며, 유도된 후대는 형태가 분리되고, 7호 계통의 특성을 구비하는 4개의 불임 단주를 선택하여 계속하여 Y3380을 사용하여 수분 유도하여, 4개의 계통을 형성하며, 4개의 계통에 대해 계통 내의 일치성, 안정성 감식을 진행한 결과, 각 계통 내가 고도로 일치하고 안정하며, 각 계통 사이에 약간의 재배 특성 차이가 존재하고, 주로 잎의 색상과 식물체의 키에 나타나며, 4개의 안정한 계통을 Y3560과 Y3380을 사용하여 각각 5개의 단주를 선택하여 수분하고, 주머니를 씌워 격리시키며, 5개의 계통을 혼합 수확하여, 유도계가 안정한 불임계에 대한 유도 효과를 감식한 결과, Y3560의 유도 효율은 94 ~ 99.8 ％ 사이이고, 여기서 1개의 계통의 유도 효율은 99.8 ％이며, 상기 계통은 Y3560을 사용하여 불임성 유지를 진행하고, Y3380의 유도율은 93 ~ 99.7 ％ 사이이며, 여기서 1개의 계통의 유도 효율은 99.7 ％이고, Y3380을 사용하여 불임성 유지를 진행할 수 있으며, 최종적으로 이러한 두 개의 높은 유도 효율의 불임계는 동일한 불임계인 것을 확인하고, 상기 불임계는 Y3560과 Y3380을 사용하여 불임을 유지할 수 있고, 새로운 불임계는 무우 세포질 불임계이며, 이의 유전자형은 상기 선별 육종된 7호 안정한 계통(유전자형은 원형 백색 무우Y23과 한국 무우H22에서 유래됨)와 룽루어A001로부터 유래되고, 무용A007이라고 지칭한다.
본 실시예2, 실시예3에서 유채 배수 유도계의 선별 육종 방법은 실시예1과 같다.
본 발명의 방법은 육종에서 또는 연구에서 적용 가치를 구비하는 십자화과 채소 재료를 신속(3대)하고, 고효율적이며, 규모적으로 획득할 수 있고; 상기 특허 기술의 적용 범위는 넓으며, 양배추, 콜리플라워(브로콜리), 배추(배추, 애배추), 무우, 개채류 십자화과 채소 (청채, 갓, 양배추, 동갓 등)을 포함하는 전체 십자화과 농작물에 적용되고, 이의 적용 면적이 넓으며, 십자화과 채소 농작물의 고수율, 품종 육종에 긍정적인 촉진 작용을 구비한다.
상기 실시예는 본 발명의 상기 내용을 더 설명하지만, 본 발명의 상기 주지의 범위가 상기 실시예에 한정되는 것으로 이해하여서는 아니된다. 상기 내용에 기반하여 구현된 기술은 모두 본 발명의 범위에 속한다.

Claims (3)

  1. 십자화과 채소 육종 자원을 수집하고 자원 재료의 특성을 감식하며, 유래가 상이하고 재배 특성 유전 차이가 큰 자원 재료를 분류하고 넘버링하며, 개화 시간을 조사하고, 개화 시간에 따라 유채 배가 반수체 유도계의 파종을 지연시키는 단계로서, 통상적으로 유채 배가 반수체의 파종 시간이 전년 10월 20일 ~ 11월 5일 사이이므로 유채 배가 반수체 유도계가 다음해에 십자화과 채소 개화기를 맞출 수 있도록 확보하는 단계1);
    상기 단계1)에서 수집한 십자화과 채소 자원 재료를 초기 개화기에 인위적으로 제웅하고, 불임 자원은 직접 수분하며 주머니를 씌워 격리시키며 2 ~ 4일 후, 유채 배가 반수체 유도계로 수분시키고, 단주에 주머니를 씌워 유도된 후대를 수확하는 단계2);
    상기 단계2)에서 수확한 유도된 후대를 재배하고, 묘기(苗期)에서 유세포 분석기로 유도된 후대의 배수성을 감식하며, 배수체, 반수체 및 유채 특성을 구비하는 식물체를 도태시키고, 육성이 정상이며 배수성이 정상인 단주를 선택하여 주머니를 씌워 자가 수분시키거나 새싹 시기에 새싹을 벗겨 강제적으로 자가 수분시키는 단계3);
    상기 단계3)에서 유도된 후대의 정상적으로 자가 수분된 후대를 계통 재배하고 계통 내의 안정성과 일치성을 감식하며, 계통 내의 일치성을 분자 마커로 감식하고, 안정한 계통을 부본으로 하고 안정한 세포질 불임계를 모본으로 하여 검정 교배시키며, 검정 교배된 후대 종자를 수확하는 단계4);
    상기 단계4)에서 검정 교배된 후대 종자를 재배하고, 검정 교배된 후대 식물체의 육성을 감식하는 단계로서, 검정 교배된 후대가 완전한 불임인 경우, 단계4)의 부본에 대응되는 것은 상기 불임 유형의 유지계인 것으로 간주하여, 동시에 상기 유지계에 대하여 자가 결실률 감식을 진행하고; 검정 교배된 후대가 완전 가임인 경우, 단계4)의 부본에 대응되는 것은 상기 불임 유형의 복원계이기 때문에, 대응되는 복원계는 도태되고; 검정 교배된 후대가 불임이 불완전한 경우, 단계4)의 부본에 대응되는 것은 복원계도 아니고 유지계도 아니기 때문에 도태되거나 교배시켜 새로운 유지계로 전환 육종하는 단계5);
    상기 단계5)에서 선별 육종된 유지계를 동일한 유형의 불임계와 검정 교배시키고, 수율, 품질, 질병 저항성을 구비하는 새로운 혼성화된(hybrid) 조합 또는 품종을 선별 육종하는 단계6);
    상기 단계5)에서 선별 육종된 유지계를 동일한 유형의 불임계와 검정 교배시킨 후, 검정 교배된 후대의 재배 특성에 따라, 상기 유지계를 이용하여 검정 교배된 후대와 역교배시키거나 다중 세대 역교배시키거나 검정 교배 1세대에서 유채 배가 반수체 유도계를 이용하여 검정 교배, 역교배 또는 다중 세대 역교배 불임 단주에 수분시키고, 주머니를 씌워 격리시키는 단계7);
    상기 단계7)에서 수확한 단주 종자를 재배하고 개화기에 육성을 감식하며, 불임 단주를 계속하여 유채 배가 반수체 유도계로 수분 유도하고 단주를 주머니를 씌워 격리시키며 단주로 수확하는 단계8);
    상기 단계8)에서 2차 유도된 불임 단주 후대는 재배 특성, 분자 마커를 통해 계통 내의 안정성, 일치성 감식을 진행하고, 재배 특성이 일치하며, 계통 내가 안정한 불임 계통에 대해 십자화과 채소의 새로운 세포질 불임계를 형성하고, 유채 배가 반수체 유도계로 상기 불임 계통을 3차 유도 수분시켜 유도 효율을 감식하는 단계9);
    상기 단계9)에서 3차 유도된 후대 감식 유도계는 상기 불임 계통의 유도 능력을 감식하고, 3차 유도된 후대 계통 내의 재배 특성, 불임도가 매우 일치하며, 계통 내의 재배 특성 및 높은 불임도 식물체가 전체 유도된 후대에서 차지하는 비율인 유도 능력이 98 ％ 이상이면, 최종적으로 유채 배가 반수체 유도계로 새롭게 형성된 불임 계통 또는 안정한 불임계의 유전 특성과 불임 상태를 유지하는 단계10);
    상기 단계8)에서 2차 유도 후 형성된 불임 계통을 유채 배가 반수체 유도계로 수분시켜 이의 불임 형태를 유지하는 단계로서, 상기 불임 계통 또는 안정한 불임계의 유전 특성은 유채 배가 반수체 유도계와 관련이 없으며, 상기 불임 계통은 상기 단계7)의 유지계인 임시 유지계의 특성을 유지하고, 상기 유지계인 임시 유지계가 일정한 유전적 차이를 구비하거나 50 ％ ~ 99 ％의 유지계인 임시 유지계 핵 유전자를 함유하며, 유지계인 임시 유지계 핵 유전자를 어느 정도 함유하는 것은 유지계인 임시 유지계와 불임 단주의 역교배 대수에 따라 결정되며, 상이한 정도의 유지계인 임시 유지계의 핵 유전자를 함유하는 외에 단계4)의 안정한 세포질 불임계의 핵 유전자를 더 함유하는 것인 단계11);
    상기 단계9)에서 형성된 상이한 유전 차이의 안정한 세포질 불임계는 유채 배가 반수체 유도계가 세포질 불임계에 대한 유도 능력이 98 ％보다 큰 것에 따라 동일한 유지계인 유채 배가 반수체 유도계로 유지하는 단계로서, 유채 배가 반수체 유도계는 세포질 불임계의 만능 유지계가 되는 동시에 하나의 유지계로 복수개의 유전적으로 안정하며 상이한 유전적 배경을 갖는 안정한 세포질 불임계를 유지하는 단계12);
    단계1)의 상이한 유래, 재배 특성 및 유전적 차이의 재료 특성 및 대응되는 유래에 기초하여 유도된 안정한 유지계를 단계12)에서 형성된 안정한 새로운 복수개의 세포질 불임계와 검정 교배시켜 수율 잠재력, 질병 저항성, 항역(stress resistance)을 구비하는 새로운 십자화과 채소 품종을 선별 육종하여 십자화과 채소의 2계통 매칭에 의한 혼성화된 새로운 품종을 선별 육종하는 단계13)
    을 포함하고;
    상기 유채 배가 반수체 유도계의 선별 육종 방법은,
    두 개의 유채 친본 재료의 혼성화된 F1세대 종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시켜 증식된 F1세대 식물체를 획득하는 단계①;
    증식된 F1세대 식물체를 자가 수분시키거나 강제적으로 자가 수분시켜 F2세대를 획득하고 F2세대를 논밭 재배 관찰하며, 각 단주의 육성을 감식하고, 가임 후대를 선택하여 자가 수분시켜 F3세대를 획득하며, 형태, 세포학 및 분자 마커 감식을 통해 F3세대의 동형 접합성을 감식하고, 후세대 DNA를 중합효소 연쇄 반응 증폭시키고 전기영동으로 각 특이적 프라이머에 의해 증폭된 단주의 DNA 밴드 패턴 및 스트립 개수를 관찰하며, 각 단주는 모두 두 개의 친본의 혼성화된 후대를 표시하고, 각 단주 사이의 분자 마커 그래프 패턴은 일치하며 이는 이러한 단주가 동형 접합계인 초기 세대 안정계인 것을 나타내는 단계②;
    획득한 초기 세대 안정계는 적어도 10개의 유채 일반 동형 접합 안정계와 상반교배하고, F1세대, F2세대는 초기 세대 안정계의 유전 특성인 단성생식 특성을 구비하는 지의 여부를 감식하며; 상기 상반교배에서 F1분리가 존재하고, F2세대에서 부분적으로 안정한 계통이 나타나면, 대응되는 초기 세대 안정계는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계인 단계③
    을 포함하는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 선별 육종하는 단계(1);
    단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 우성 형질을 구비하는 유채와 교배시켜 혼성화된 F1세대 종자를 얻고 혼성화된 F1종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시켜 우성 형질을 갖는 증식된 F1식물체를 획득하는 단계①;
    우성 형질을 갖는 증식된 F1식물체를 현미경으로 관찰하거나 유세포 분석기로 염색체 배수성을 감식하여 우성 형질을 갖는 배수체의 식물체를 선택하고, 비정상적인 배수체, 이수 배수체 식물체 및 우성 형질을 갖지 않는 배수체 식물체를 도태시키며; 우성 형질의 배수체 식물체는 배수성 유전이 안정하고 결실성이 좋으며 단성생식 유전 특성을 구비하고 우성 형질을 갖는 육배체 또는 팔배체 유채 식물체인 단계②
    를 포함하는 우성 유전적 형질을 갖고, 단성생식 유전 특성을 구비하며 배수성 유전이 안정한 배수체 유채를 선별 육종하는 단계(2);
    배수성 유전이 안정하고, 단성생식 유전 특성을 구비하며, 우성 형질을 갖는 배수체 식물체의 우성 형질은 검정 교배된 후대에서 생성된 혼성화된 식물체를 제거할 수 있고, 만약 검정 교배된 후대에서 우성 형질 식물체, 또는 이수 배수체 식물체가 나타나면 상기 식물체가 배수체 식물체와 모본이 교배되어 생성된 것을 나타내므로 상기 식물체를 제거하는 단계①;
    상기 단주 검정 교배된 후대는 완전 불임이 나타나고, 정상적인 배수성인 이배체 또는 사배체 유채이며, 우성 형질을 갖지 않고, 이는 상기 검정 교배된 후대에 대응되는 부본 유전자는 검정 교배된 후대에 진입하지 않으며 우성 배수체 식물체가 유채 배가 반수체 유도계인 것을 나타내는 단계②
    를 포함하는 유채 배가 반수체 유도계 감식하고 유도 능력을 측정하는 단계(3)
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    유채 배가 반수체 유도계에서 선별 육종하는 것은 두 개의 친본 재료 혼성화된 F1세대 종자 또는 단성생식 유전 특성을 구비하는 초기 세대 안정계를 우성 형질을 구비하는 유채 혼성화시켜 얻은 혼성화된 F1세대 종자를 배지에서 염색체 증식 유도제로 인위적으로 염색체 증식시키는 것이고, 구체적인 방법은,
    순도가 75 ％인 알코올로 종자 표면을 25 ~ 40초 동안 소독하고 0.1 ％의 염화수은(II)으로 12 ~ 17분 동안 소독한 후, 무균수로 종자 표면의 염화수은(II)을 깨끗하게 세척하며 무균 종이로 종자 표면의 수분을 흡수한 후 종자를 제1 배지에 접종시키는 단계1);
    종자를 제1 배지에 뿌리 내리고 발아시키며, 배양 조건은, 온도가 23 ~ 25 ℃이고, 낮 조명이 12 ~ 16시간이며, 조명 강도가 2000 ~ 3000럭스이고, 야간 배양이 8 ~ 12시간이며, 식물체가 1 ~ 2개의 진잎으로 자라면, 하부 배축으로부터 식물체를 절단하여 계속하여 제2 배지에 성장시키는 단계2);
    절단한 식물체를 계속하여 제2 배지에 삽입시켜 계속하여 배양시키고, 측싹을 분화시킨 후, 측싹 및 식물체를 제3 배지에 옮겨 뿌리 배양시키는 단계3);
    뿌리 배양 2주 후, 식물체에서 튼실한 뿌리가 자라난 후, 식물체를 실온에서 3 ~ 7일 동안 배양하고 식물체를 꺼내어 식물체의 배지를 수돗물로 깨끗하게 세척하며 침지 완충액에 15 ~ 30분 동안 침지시킨 후 온실로 이식하고 온실 온도는 16 ℃ ~ 25 ℃이며 상대습도는 60 ~ 80 ％이고 이식 생존율을 95 ％ 이상으로 보장할 수 있는 단계4)
    를 포함하고,
    상기 제1 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
    MS 배지: 1 L
    6-벤질 아데닌: 0.5 ~ 1.5 mg
    염색체 증식 유도제: 30 ~ 70 mg
    자당: 20 ~ 30 g
    아가: 8 ~ 10 g이고,
    제1 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이며,
    상기 제2 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
    MS 배지: 1 L
    6-벤질 아데닌: 0.5 ~ 1 mg
    염색체 증식 유도제: 20 ~ 40 mg
    자당: 20 ~ 30 g
    아가: 8 ~ 10 g이며,
    제2 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이고,
    상기 제3 배지는 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되며,
    MS 배지: 1 L
    α-나프탈렌 아세트산: 0.03 ~ 0.5 mg
    염색체 증식 유도제: 5 ~ 20 mg
    자당: 20 ~ 30 g
    아가: 8 ~ 10 g이고,
    제3 배지의 pH = 5.8 ~ 6.0이며,
    상기 침지 완충액은 하기 배합 비율의 조성성분으로 구성되고,
    물: 1 L
    파목사돈(famoxadone) 또는 사이목사닐(cymoxanil): 0.6 ~ 1.2 g
    α―나프탈렌 아세트산: 0.5 ~ 1 mg인 것을 특징으로 하는 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    염색체 증식 유도제는 콜히친, 트리플루랄린, 오리자린 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 유채 배가 반수체 유도계에서 십자화과 채소 재료 및 품종을 선별 육종하는 방법.
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