CN102907313A - 一种构建百合杂交后代无性系群体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种构建百合杂交后代无性系群体的方法，将经过筛选后的百合目标亲本经切割柱头、杂交、采集后，经萌芽、增殖和结球等胚挽救，由一株扩繁至上百株，待籽球生长后进行春化处理，处理结束后籽球栽培到温室土壤中，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。采用该方法，年限大大缩短，由十一年减少至五年，加快了百合育种速度，提高了培育百合新品种的效率，本发明流程简单，对于百合远缘杂交后代的获得及杂种无性系群体的快速创制具有明显的效果，群体内各个植株的性状表现一致性较好。

Description

一种构建百合杂交后代无性系群体的方法

技术领域

本发明涉及一种构建杂交后代无性系群体的方法，尤其涉及一种构建百合杂交后代无性系群体的方法，属于植物育种技术领域。

背景技术

欧美国家在20世纪初即对百合新品种选育技术开展了大量研究，至2008年全球官方登记的百合品种数量已达9465个。欧洲百合育种强国荷兰每年能推出近200个百合新品种。目前，我国的百合栽培品种几乎都来自荷兰，国内百合育种业近年虽有较大进步，但是培育出的百合品种数量仍然无法与国外强国相比。由于我国百合育种起步晚，而百合杂交后代种球的培育周期较长，仅从杂交种子到开花的周期就长达4～5年，选育一个品种至少需要11年时间，如此长的育种周期严重制约着百合花卉育种行业的规模化、产业化发展，难于满足市场对自育百合新品种的需求。因此，必须加快百合品种的育种进程，对现有的育种技术进行改进，以缩短百合新品种的培育时间。 

发明内容

为缩短百合育种周期、加快百合新品种的培育速度、规模化地推出百合新品种，本发明提供一种构建百合杂交后代无性系群体的方法。

本发明提供的是这样一种构建百合杂交后代无性系群体的方法，其特征在于经过下列各步骤：

将经过筛选后的百合目标亲本经过切割柱头杂交，于杂交后30～120天之内视果实的生长状况采集杂交果实进行胚挽救，胚挽救获得的杂种胚不定芽扩繁至100株以上再进行结球培养，当籽球围径生长到3～4cm左右时，出瓶春化处理40～60天，然后把籽球栽培到温室中连续生长2年，冬季不挖种球，到第5年时，百合杂种后代即形成一个有100株以上个体的正常开花无性系群体。

上述杂种胚无性系群体由于在杂种胚不定芽同步扩繁及温室栽培冬季不起球两个环节的共同处理下，形成杂种无性系的时间大大缩短，只需5年即可获得一个性状稳定可靠的杂种无性系。

上述方法的具体步骤如下：

A、切去母本百合花柱上部连接柱头，保留子房以上0.5～1cm的部分，把父本新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉；

B、经步骤A授粉后30～120天内，当果实发育停止或缓慢时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果进行消毒清洗；

D、从步骤C处理的蒴果中取出种子，挤出幼胚，接种到MS+NAA(0.01～0.05)mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为20～25℃，光照强度为2000～5000Lx，光照时间8～12小时/天的条件下，培养30～80天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA(0.5～1)mg/L+NAA(0.1～0.5)mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养，直至不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E所得植株从基部切下，转至MS+IBA(0.5～1)mg/L、pH=5.8～6.0的培养基上，在温度为18～25℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养150～180天，取出、清洗后，于4～8℃下进行40～60天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

所述步骤C的消毒清洗是：用体积浓度为70～75%的酒精擦拭百合蒴果表面三次，再用体积浓度为70～75%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡15分钟，最后用无菌水清洗二次。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述方案，可使百合杂种后代无性系群体的获得年限大大缩短，由11年减少至3年，加快了百合育种速度，提高了培育百合新品种的效率，本发明流程简单，对于百合远缘杂交后代的获得及杂种无性系群体的快速创制具有明显的效果。另外，克服了假杂种（即由子房壁、种皮等部位长出的不定芽）出现的可能，确保了杂种的真实性，且群体种球的生长较整齐，群体内各个植株的性状表现一致性较好，能够满足百合新品种申报时对一致性和稳定性的要求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

A、将母本东方百合‘Sorbonne’的花柱用刀片切去上部连接柱头的部分，保留子房以上0.5cm的部分，把父本‘兰州百合’的新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉，再用锡箔纸包裹住切口；

B、步骤A授粉后90天内，当果实发育停止且开始萎缩时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果用体积浓度为75%的酒精擦拭果实表面3次，再用体积浓度为75%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中处理15分钟，最后用无菌水清洗2次；

D、将经过步骤C处理的百合蒴果剖开，捡出有胚种子并在解剖镜下用镊子尖撕去种皮，在胚乳上轻划一下，挤压出白色半透明状的幼胚，接种到MS+NAA0.01mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光照时间12小时/天的条件下，培养4天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA1mg/L+NAA0.3mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养138天，使不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E中得到的植株从基部切下后转至MS+IBA0.8mg/L、pH=6.0的培养基上，在温度为18℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养150天，待籽球围径达到3～4cm时，进行清洗后置于温度5℃下，经40天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

实施例2

A、将母本东方百合‘Casa Blanca’的花柱用刀片切去上部连接柱头的部分，保留子房以上0.8cm的部分，把父本亚洲百合‘Brunello’的新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉，再用锡箔纸包裹住切口；

B、步骤A授粉后57天内，当果实发育缓慢开始发黄时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果用体积浓度为72%的酒精擦拭果实表面3次，再用体积浓度为72%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中处理15分钟，最后用无菌水清洗2次；

D、将经过步骤C处理的百合蒴果剖开，捡出有胚种子并在解剖镜下用镊子尖撕去种皮，在胚乳上轻划一下，挤压出白色半透明状的幼胚，接种到MS+NAA0.02 mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为20℃，光照强度为3000Lx，光照时间10小时/天的条件下，培养45天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养160天，直至不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E中得到的植株从基部切下后转至MS+IBA1mg/L、pH=5.8的培养基上，在温度为20℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养165天，待籽球围径达到4cm时，进行清洗后置于温度4℃下经60天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

实施例3

A、将母本OT百合‘Manissa’的花柱用刀片切去上部连接柱头的部分，保留子房以上1cm的部分，把父本东方百合‘Bernini’的新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉，再用锡箔纸包裹住切口；

B、步骤A授粉后30天内，当果实发育缓慢时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果用体积浓度为70%的酒精擦拭果实表面3次，再用体积浓度为70%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中处理15分钟，最后用无菌水清洗2次；

D、将经过步骤C处理的百合蒴果剖开，捡出有胚种子并在解剖镜下用镊子尖撕去种皮，在胚乳上轻划一下，挤压出白色半透明状的幼胚，接种到MS+NAA0.05 mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为22℃，光照强度为5000Lx，光照时间8小时/天的条件下，培养80天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养180天，直至不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E中得到的植株从基部切下后，转至生根培养基：MS+IBA0.5mg/L、pH=5.9上，在温度为25℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养180天，待籽球围径达到3cm时，进行清洗后置于温度8℃下经58天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

实施例4

A、将母本东方百合‘Casa Blanca’的花柱用刀片切去上部连接柱头的部分，保留子房以上0.8cm的部分，把父本亚洲百合‘Brunello’的新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉，再用锡箔纸包裹住切口；

B、步骤A授粉后120天内，当果实发育停止时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果用体积浓度为75%的酒精擦拭果实表面3次，再用体积浓度为75%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中处理15分钟，最后用无菌水清洗2次；

D、将经过步骤C处理的百合蒴果剖开，捡出有胚种子并在解剖镜下用镊子尖撕去种皮，在胚乳上轻划一下，挤压出白色半透明状的幼胚，接种到MS+NAA0.02 mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为20℃，光照强度为2000Lx，光照时间12小时/天的条件下，培养45天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养160天，直至不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E中得到的植株从基部切下后转至MS+IBA1mg/L、pH=5.8的培养基上，在温度为23℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养165天，待籽球围径达到4cm时，进行清洗后置于温度4℃下经60天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

以下通过具体实验阐述本发明。

1、将相同的百合杂交组合（母本均为OT百合‘Manissa’， 父本均为东方百合‘Bernini’）分为A、B两组，A、B两组的授粉方法都采用同样的切割柱头授粉法；

2、A组用本发明的方法构建百合杂交后代无性系群体，共用时5年，获得的百合杂交后代无性系群体的长势旺盛，群体开花时间一致，所有的观赏性状表现整齐，并能较好地表现出与父母本的差异，具有明显的花部性状特异性。

3、B组用常规方法构建百合杂交后代无性系群体，共耗时11年，并且会因群体内植株生长速度不相同而导致高矮不一致。

4、A组与B两组相比，获得的后代无性系群体的时间缩短了6年。说明本发明的方法对百合杂交后代无性系的构建有较明显的加快促进作用。根据百合杂交后代的胚挽救方法及不定芽群体的增殖情况看，常规的胚挽救把子房切片或直接剥出未成熟的种子放在培养基上诱导丛生芽，导致出现假杂种的几率较高，而且是否为假杂种，则需要通过后代单株开花后才能判定。另外常规方法需要每年冬季都挖出种球并进行冷藏，必然缩短了百合在土壤中吸收养分的时间，导致种球生长速度慢，最终使构建无性系群体的时间延长。而本发明利用剥胚胚挽救结合籽球冬季在土壤中自然越冬的做法，经过5年时间就获得了稳定、可靠的百合杂种无性系群体，这对百合的育种是非常有利的，具有明显的经济利益。

Claims (2)

1.一种构建百合杂交后代无性系群体的方法，其特征在于经过下列各步骤：

A、切去母本百合花柱上部连接柱头，保留子房以上0.5～1cm的部分，把父本新鲜花粉涂抹于切口处进行授粉；

B、经步骤A授粉后30～120天内，当果实发育停止或缓慢时，采下由子房发育而成的百合蒴果；

C、将步骤B所得百合蒴果进行消毒清洗；

D、从步骤C处理的蒴果中取出种子，挤出幼胚，接种到MS+NAA(0.01～0.05)mg/L、pH=5.8的培养基上，在培养温度为20～25℃，光照强度为2000～5000Lx，光照时间8～12小时/天的条件下，培养30～80天，得到幼苗；

E、将步骤D的幼苗转接到MS+BA(0.5～1)mg/L+NAA(0.1～0.5)mg/L、pH=5.8的培养基上，在与D步骤相同的培养条件下，进行不定芽群体同步增殖培养，直至不定芽增殖数量达到100株以上，得植株；

F、将步骤E所得植株从基部切下，转至MS+IBA(0.5～1)mg/L、pH=5.8～6.0的培养基上，在温度为18～25℃、避光、全黑暗条件下，进行结球和生根培养150～180天，取出、清洗后，于4～8℃下进行40～60天的低温春化，得到籽球；

G、将步骤F的籽球于当年8月份栽培到温室土壤中，按常规管理，连续越二个冬季，在第三个冬季来临前挖出种球，即获得有上百株个体的开花无性系群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤C的消毒清洗是：用体积浓度为70～75%的酒精擦拭百合蒴果表面三次，再用体积浓度为70～75%的酒精浸泡1分钟，然后在质量浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡15分钟，最后用无菌水清洗二次。