CN113841613A - 一种兰州百合种苗高效繁育方法 - Google Patents

一种兰州百合种苗高效繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兰州百合种苗高效繁育方法，是以兰州百合实生种子为外植体，将实生种子经过种子收集、脱菌、萌发、至少一次增殖培养、壮苗培养及鳞茎膨大培养步骤，制备得到百合种苗。本发明的有益效果为：本发明以种子萌发代替鳞片扦插生产种苗，阻断了因鳞片扦插引起的病毒代际传播和积累，与现有技术相比，显著降低了百合种苗病毒载量，提高了种苗群体的异质性，有效解决了兰州百合种苗繁殖中因采用无性繁殖方式引起的病毒积累和遗传背景狭窄等缺陷。本繁育方法可用于兰州百合种质资源保存和种苗的工厂化繁育，有利于兰州百合新品种选育、优良品种的快速推广、种质资源的保存和创新，以及提高兰州百合的产量和品质。

Description

一种兰州百合种苗高效繁育方法
技术领域
本发明涉及百合种苗种球繁育技术领域，具体涉及一种兰州百合种苗高效繁育方法。
背景技术
兰州百合长期以鳞片扦插、茎生小鳞茎的方式繁殖种球，存在因病毒积累和传播严重引起的种性退化问题，严重影响了兰州百合的品质和产量，制约了兰州百合产业的发展。据调查，虽然兰州百合自然座果率平均只有7.15%，但兰州百合蒴果内种子数量大，每个蒴果内含约200～250粒种子，且饱满率为30～67.6%。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种兰州百合种苗高效繁育方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述繁育方法是以兰州百合实生种子为外植体，将实生种子经过种子收集、脱菌、萌发、至少一次增殖培养、壮苗培养及鳞茎膨大培养步骤，即可得到百合种苗。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，包括以下步骤：
1)实生种子收集：收集花后的兰州百合蒴果，去除果皮，得到实生种子；
2)实生种子脱菌：将步骤1）得到的含有胚的实生种子洗净后，分别以乙醇溶液和次氯酸钠溶液浸泡，再以无菌水清洗，并以无菌滤纸吸干水分，即得到脱菌实生种子；
3)诱导胚萌发：将步骤2）得到的脱菌实生种子以植物激素浸泡后，以无菌蒸馏水清洗，再接种至萌发培养基中培养，即可得到胚萌发实生苗；
4)增殖培养：将步骤3）得到的胚萌发实生苗切根后分株接种至增殖培养基中进行种苗繁育培养，即可到的丛生苗；所述增殖培养过程至少进行一次；
5)壮苗培养：将步骤4）得到的丛生苗分株接种至壮苗培养基中培养，得到试管苗；
6)鳞茎膨大培养：将步骤5）得到的试管苗接种到鳞茎膨大培养基上培养，即可得到百合种苗。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤1）中，所收集的兰州百合蒴果为花后50天以上的蒴果。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤2）中，实生种子先以清水冲洗9-11min，洗净后以体积百分比为70%浓度的乙醇溶液浸泡40-50s，再以质量体积比为2%的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后以无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干水分，即可到的脱菌实生种子。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤3）中，所用激素为100-500mg/L的赤霉素GA3，浸泡时间为22-26h；无菌蒸馏水清洗3次，萌发培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为10-30 d；光照条件为先以暗培养方式，待胚萌发后再采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤4）中，增殖培养基组成为：MS培养基+6-BA 1.0-1.5mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂，pH=5.8；增殖培养温度为24-26℃，培养时间为30-60 d；光照条件：采用光周期为16-20h光/4-8h暗的方式；后续的增殖培养采用将第一次增殖培养得到的丛生苗接种至同样的增殖培养基中再次进行增殖培养。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤5）中，壮苗培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为30-50 d；采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述步骤6）中，鳞茎膨大培养基组成为：MS培养基+活性炭0.5-1.5g/L+矮壮素0.25-0.5mg/L+蔗糖80g/L+琼脂0.5%，pH=5.8，培养时间为85-95d，培养温度为18-22℃，采用光周期为16-20h光/4-8h暗的光照条件进行。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 1650，KNO3 1900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4 170，KI0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0。
进一步的，上述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，所述1/2MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 825，KNO3 950，CaCl2·2H2O 220，MgSO4·7H2O 185， KH2PO4 85，KI0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25， CuSO4·5H2O0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100， 烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0。
本发明的有益效果为：本发明以种子萌发代替鳞片扦插生产种苗，阻断了因鳞片扦插引起的病毒代际传播和积累，而且以实生种子为外植体获得种苗具有病毒载量低、异质性高的特点，与现有技术相比，显著降低了百合种苗病毒载量，提高了种苗群体的异质性，有效解决了兰州百合种苗繁殖中因采用无性繁殖方式引起的病毒积累和遗传背景狭窄等制约兰州百合产业发展的瓶颈。本繁育方法可用于兰州百合种质资源保存和种苗的工厂化繁育，有利于兰州百合新品种选育、优良品种的快速推广、种质资源的保存和创新，以及提高兰州百合的产量和品质。
附图说明
图1 显示为经脱菌处理后的兰州百合实生种子。
图2 显示为兰州百合实生种子的萌发。
图3显示为兰州百合实生苗及其根系。
图4显示为兰州百合实生苗增殖培养产生的丛生苗。
图5显示为壮苗培养。
具体实施方式
实施例1：
一种兰州百合种苗高效繁育方法，包括以下步骤：
1)实生种子收集：收集花后的兰州百合蒴果，去除果皮，得到实生种子；所收集的兰州百合蒴果为花后50天以上的蒴果；
2)实生种子脱菌：将步骤1）得到的含有胚的实生种子洗净后，分别以乙醇溶液和次氯酸钠溶液浸泡，再以无菌水清洗，并以无菌滤纸吸干水分，即得到脱菌实生种子；实生种子先以清水冲洗9-11min，洗净后以体积百分比为70%浓度的乙醇溶液浸泡40-50s，再以质量体积比为2%的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后以无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干水分，即可到的脱菌实生种子；
3)诱导胚萌发：将步骤2）得到的脱菌实生种子以植物激素浸泡后，以无菌蒸馏水清洗，再接种至萌发培养基中培养，即可得到胚萌发实生苗；所用激素为100-500mg/L的赤霉素GA3，浸泡时间为22-26 h；无菌蒸馏水清洗3次，萌发培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为10-30 d；光照条件为先以暗培养方式，待胚萌发后再采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养；
4)增殖培养：将步骤3）得到的胚萌发实生苗切根后分株接种至增殖培养基中进行种苗繁育培养，即可到的丛生苗；所述增殖培养过程至少进行一次；增殖培养基组成为：MS培养基+6-BA 1.0-1.5mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂，pH=5.8；增殖培养温度为24-26℃，培养时间为30-60 d；光照条件：采用光周期为16-20h光/4-8h暗的方式；后续的增殖培养采用将第一次增殖培养得到的丛生苗接种至同样的增殖培养基中再次进行增殖培养；
5)壮苗培养：将步骤4）得到的丛生苗分株接种至壮苗培养基中培养，得到试管苗；壮苗培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为30-50 d；采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养；
6)鳞茎膨大培养：将步骤5）得到的试管苗接种到鳞茎膨大培养基上培养，即可得到百合种苗；鳞茎膨大培养基组成为：MS培养基+活性炭0.5-1.5g/L+矮壮素0.25-0.5mg/L+蔗糖80g/L+琼脂0.5%，pH=5.8，培养时间为85-95d，培养温度为18-22℃，采用光周期为16-20h光/4-8h暗的光照条件进行；
所述MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 1650，KNO3 1900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4 170，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0；
所述1/2MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 825，KNO3 950，CaCl2·2H2O220，MgSO4·7H2O 185， KH2PO4 85，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25， CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100， 烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0。
实施例2：
如图1至图5所示，为本发明中以兰州百合实生种子为外植体经脱菌处理、胚萌发、增殖培养、壮苗培育和小鳞茎膨大培养的过程图。
一、兰州百合实生种子脱菌处理及萌发诱导：
将种子进行除菌处理：首先用流水冲洗20 min，70%（v/v）乙醇浸泡1 min，接着用2%（v/v）NaClO溶液浸泡20 min，最后用无菌水清洗3次，得到无菌种子。将无菌种子平均分为3份，分别用浓度为0、250 mg·L-1、500 mg·L-1（w/v）的赤霉素（GA3）溶液浸泡24 h后，接种到1/2 MS培养基上进行暗培养（23～25℃），每个处理设3次重复。13 d后统计发芽率。表1显示为GA3对兰州百合实生苗发芽率的影响。
表1
Figure 135769DEST_PATH_IMAGE001
表1中：＊标注列数据为3次重复的均值±标准差；同行不同字母之间差异显著（p＜0.05， LSD 测验）。
GA3对兰州百合种子的萌发具有促进作用。7 d后胚开始萌动，胚根萌发，胚轴伸长生长，8～10 d 进入胚萌动盛期，13 d萌动种子数量基本不再增长，此时统计发芽率。由表1可以看出，GA3促进百合胚萌发具有一定的浓度效应，用浓度为250 mg/L可以将兰州百合种子的发芽率提高近1倍，达49.17%。
二、实生苗增殖培养：
将获得的实生苗切去根，分株接种到增殖培养基（MS + 6-BA 1.0～1.5 mg/L +NAA 0.05～0.5 mg/L + 3% 蔗糖 + 0.5 %琼脂，pH=5.8）上培养60 d，培养温度为25℃，光周期为16 h光/8 h暗）。
根据所需种苗数量，诱导出来的丛生苗可继续接种到增殖培养基进行增殖培养。一般第一次增殖培养增殖率为200-300%，第二次增殖率为500-800%。
三、壮苗及鳞茎膨大培养：
经增殖培养诱导出来的丛生苗分株接种到1/2 MS培养基进行壮苗培养（培养温度为25±1℃，光周期为16 h光/8 h暗）30～40 d。
壮苗培养结束后的试管苗切去根和叶片，剪至株高约为2～3 cm时接种到鳞茎膨大培养基（MS + 活性炭 0.5～1.5 g/L + 2-氯乙基三甲基氯化铵（矮壮素）0.25～0.5 mg/L +蔗糖 80 g/L +琼脂 0.5 %，pH=5.8）上培养90 d，培养温度为20℃，光周期为16～20 h光/4～8 h暗）。
MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 1650，KNO3 1900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4 170，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0。
1/2MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 825，KNO3 950，CaCl2·2H2O 220，MgSO4·7H2O 185， KH2PO4 85，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25， CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100， 烟酸0.5，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5，盐酸硫胺素（维生素B1）0.1，甘氨酸 2.0。
四、由实生种子获得种苗与鳞片扦插苗的脱毒率比较
分别提取15株由实生种子或鳞片扦插获得种苗RNA，采用RT-PCR检测黄瓜花叶病毒（CMV）、百合无症病毒（LSV）和百合斑驳病毒（LoMV）基因，两种不同来源的兰州百合种苗脱毒率比较见表2。
表2
Figure 395454DEST_PATH_IMAGE002
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述繁育方法是以兰州百合实生种子为外植体，将实生种子经过种子收集、脱菌、萌发、至少一次增殖培养、壮苗培养及鳞茎膨大培养步骤，即可得到百合种苗。
2.根据权利要求1所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
实生种子收集：收集花后的兰州百合蒴果，去除果皮，得到实生种子；
实生种子脱菌：将步骤1）得到的含有胚的实生种子洗净后，分别以乙醇溶液和次氯酸钠溶液浸泡，再以无菌水清洗，并以无菌滤纸吸干水分，即得到脱菌实生种子；
诱导胚萌发：将步骤2）得到的脱菌实生种子以植物激素浸泡后，以无菌蒸馏水清洗，再接种至萌发培养基中培养，即可得到胚萌发实生苗；
增殖培养：将步骤3）得到的胚萌发实生苗切根后分株接种至增殖培养基中进行种苗繁育培养，即可到丛生苗；所述增殖培养过程至少进行一次；
壮苗培养：将步骤4）得到的丛生苗分株接种至壮苗培养基中培养，得到试管苗；
鳞茎膨大培养：将步骤5）得到的试管苗接种到鳞茎膨大培养基上培养，即可得到百合种苗。
3.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤1）中，所收集的兰州百合蒴果为花后50天以上的蒴果。
4.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤2）中，实生种子先以清水冲洗9-11min，洗净后以体积百分比为70%浓度的乙醇溶液浸泡40-50s，再以质量体积比为2%的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后以无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干水分，即可到的脱菌实生种子。
5.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤3）中，所用激素为100-500mg/L的赤霉素GA3，浸泡时间为22-26h；无菌蒸馏水清洗3次，萌发培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为10-30 d；光照条件为先以暗培养方式，待胚萌发后再采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养。
6.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤4）中，增殖培养基组成为：MS培养基+6-BA 1.0-1.5mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂，pH=5.8；增殖培养温度为24-26℃，培养时间为30-60 d；光照条件：采用光周期为16-20h光/4-8h暗的方式；后续的增殖培养采用将第一次增殖培养得到的丛生苗接种至同样的增殖培养基中再次进行增殖培养。
7.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤5）中，壮苗培养基为1/2MS培养基，培养温度为24-26℃，培养时间为30-50 d；采用光周期为16h光/8h暗的方式进行光照培养。
8.根据权利要求2所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述步骤6）中，鳞茎膨大培养基组成为：MS培养基+活性炭0.5-1.5g/L+矮壮素0.25-0.5mg/L+蔗糖80g/L+琼脂0.5%，pH=5.8，培养时间为85-95d，培养温度为18-22℃，采用光周期为16-20h光/4-8h暗的光照条件进行。
9.根据权利要求1-8任一所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 1650，KNO3 1900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O370，KH2PO4 170，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100，烟酸0.5， 盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.1，甘氨酸 2.0。
10.根据权利要求1-8任一所述的一种兰州百合种苗高效繁育方法，其特征在于，所述1/2MS培养基的基本组成以mg/L计为：NH4NO3 825，KNO3 950，CaCl2·2H2O 220，MgSO4·7H2O185， KH2PO4 85，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O0.25， CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100， 烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.1，甘氨酸 2.0。
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