CN116508652B - 一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，涉及鸡头黄精组培技术领域，包括以下步骤：(1)外植体的预处理及消毒；(2)初代培养；(3)愈伤组织及不定根诱导培养；(4)微根茎诱导；(5)微根茎增殖。本发明方法微根茎增殖系数高、繁殖速度快，通过诱导产生大量不定根，然后切去根尖诱导产生微根茎，起始数量多；本发明方法总增殖系数高达11.45，极大加快了繁殖速度、提高了增殖效率，为短期内生产大量优质鸡头黄精苗及日后规模化生产提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及鸡头黄精组培技术领域，更具体的说是涉及一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法。
背景技术
鸡头黄精(Polygonatum sibiricum Redoute.)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum Mill.)多年生药用草本植物。其野生资源以子午岭、黄龙山、乔山灌丛中分布较多，又名鸡头参。鸡头黄精根茎横走，圆柱状，结节膨大，药用部位是根茎。历代本草在记述其药理作用的同时，也记载了其食用价值。保健意识也随之增强，对黄精的认识越来越全面，黄精不但药用价值非常高，而且由于稀缺，导致市场价格不断上涨，同时具有丰富的营养成分、人们在其产品加工工艺等各方面进行了相关的研究，开发出营养保健食品--鸡头参果脯、黄精红枣酸奶等。因此对野生药材需求量也越来越大，大量挖掘野生资源，导致生态环境严重破坏，给野生药材的开发和利用带来了不利影响，只有大规模人工种植才可满足人类的需求。
黄精通常通过种子育苗和根茎切块2种方式增殖，由于种子在萌发时有较长的休眠期，导致育苗时间较长，而根茎切块繁殖系数较低，易携带病害。因此，黄精种苗问题成为制约黄精产业发展的主要因素之一，也成为黄精人工大规模种植的瓶颈。鸡头黄精为黄精属的植物，目前，关于组织培养张智慧等对滇黄精组织培养快速繁殖技术体系进行了研究；陆静等对四川大叶黄精组培快繁技术的研究；还有多花黄精的研究等。由于不同物种(甚至同一物种不同部位)组培时对外源激素的需求不同，因此无法转用于鸡头黄精的组织培养，而鸡头黄精组织培养的报道，仅见李莺以鸡头黄精的根状茎作为外植体，获得丛生芽，并展开了快速繁殖技术研究。但是该研究仅通过丛生芽方式进行鸡头黄精的增殖，且增殖系数较低，对大量扩繁仍有制约。
因此，如何实现鸡头黄精的组织培养的高效扩繁是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法。本发明方法用鸡头黄精根状茎为材料，利于组织培养技术，研究不同因子对无性系建立、微根茎诱导及增殖的影响，确定鸡头黄精微根茎增殖的最佳培养方案，为短期内生产大量优质鸡头黄精苗及日后规模化生产提供科学依据。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的预处理及消毒；
(2)初代培养：将鸡头黄精根茎切成小段，接种于初代培养基中培养，所述初代培养基为MS+0.2mg/L6-BA+(0.2～0.5)mg/LNAA或MS+0.2mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LIBA；
(3)愈伤组织及不定根诱导培养：将初代培养获得的材料切成小段，接种于诱导培养基中培养至不定根生成，所述诱导培养基为MS+(0.5～1.0)mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LNAA；
(4)微根茎诱导：将不定根剪去根尖转入微根茎诱导培养基中，不定根切口愈伤化产生新的不定根或者膨大后形成微根茎；所述微根茎诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LNAA+(0.5～2.0)mg/LIBA；
(5)微根茎增殖：将上步骤诱导产生的微根茎转入微根茎增殖培养基上培养获得微根茎或丛生苗；所述微根茎增殖培养基为MS+(1.0～2.0)mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+(0.5～1.0)mg/LIBA；
且，步骤(2)～(5)均为21±1℃遮光培养，湿度70％～80％。
作为优选的技术方案，步骤(1)外植体的预处理及消毒方法为以根状茎为外植体，用75％酒精消毒6～8s，无菌水漂洗3次，再用0.1％HgCl2处理8min，无菌水漂洗5次。
作为优选的技术方案，步骤(2)初代培养将根茎切成0.5～1.0cm小段，所述初代培养基为MS+0.2mg/L6-BA+(0.2～0.5)mg/LNAA。
作为优选的技术方案，步骤(3)愈伤组织及不定根诱导培养将材料切成0.5～1.0cm小段，所述诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。
作为优选的技术方案，步骤(4)微根茎诱导中剪去根尖的不定根为幼嫩不定根，剪去长度为0.3cm～0.5cm；
所述微根茎诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+0.5mg/LIBA。
作为优选的技术方案，步骤(5)微根茎增殖培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIBA
作为优选的技术方案，步骤(2)～(5)中MS培养基均含7.6g/L琼脂和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
作为优选的技术方案，还包括移栽定植步骤，具体操作为用水洗净丛生苗上的培养基，再用2‰甲基托布津冲洗1min，然后移栽苗床，覆土深度2～4cm，浇水定植，最后外搭塑料拱棚，并加黑色遮阳网，控制光照；保持空气湿度70％～80％，温度23～25℃；
待新芽抽出后，移栽大田定植。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法。具有以下有益效果：
1、微根茎增殖系数高、繁殖速度快：通过诱导产生大量不定根，然后切去根尖诱导产生微根茎，起始数量多；本发明方法总增殖系数高达11.45，极大加快了繁殖速度、提高了增殖效率。
2、微根茎增殖、生根一步完成：增殖的微根茎和无菌苗均可直接移栽，节约成本。将诱导产生的微根茎或切去根尖的较嫩不定根，接种于筛选的MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIBA培养基中，在增殖产生大量微根茎的同时产生不定根，或产生大量丛生苗，一次成苗。增殖的微根茎和无菌苗均可直接移栽，成活率高，减少炼苗环节，节约成本，提高了经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例不同激素浓度下愈伤组织及不定根诱导效果图，其中1A、1B、1C分别为MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA下顶芽萌发状态、粗壮不定根、粗壮不定根；1D为MS+1mg/L6-BA+1mg/LNAA下大量簇生的不定根及顶端愈伤组织。
图2为不同幼嫩程度的不定根诱导微根茎的效果，其中2A为非常幼嫩不定根切口产生的愈伤组织，2B为较老发绿根段切口褐化，2C为较幼嫩根段切口形成微根茎。
图3为MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIBA培养基微根茎增殖效果，其中3A为根尖切口膨大，3B为增殖产生大量微根茎，3C为微根茎体积增大，3D为微根茎表面产生芽，3E和3F为获得的增殖苗。
图4为温度及光照对鸡头黄精无性系建立及微根茎繁殖的影响，其中a为25℃暗培养，根茎切口褐化；b为21℃光照培养5d，根茎切口褐化；c为25℃光照培养，不定根褐化；d为25℃光照培养，根茎切口褐化；e为21℃暗培养产生的不定根；f为21℃暗培养，根茎生长良好。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，所用到的材料和试剂均为市售可得，试验所用到的方法，如无特别提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
本发明所涉及鸡头黄精根状茎，来源于子午岭林区；所涉及MS培养基成分(pH值5.8)见表1：
表1
实施例1
一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的预处理及消毒:以根状茎为外植体，用75％酒精消毒6～8s，无菌水漂洗3次，再用0.1％HgCl2处理8min，无菌水漂洗5次。
(2)初代培养：将鸡头黄精根茎切成小段，接种于初代培养基中培养，所述初代培养基为MS+0.2mg/L6-BA+(0.2～0.5)mg/LNAA或MS+0.2mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LIBA。
(3)愈伤组织及不定根诱导培养：将初代培养获得的材料切成小段，接种于诱导培养基中培养至不定根生成，所述诱导培养基为MS+(0.5～1.0)mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LNAA。
(4)微根茎诱导：将不定根剪去根尖转入微根茎诱导培养基中，不定根切口愈伤化产生新的不定根或者膨大后形成微根茎；所述微根茎诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+(0.5～1.0)mg/LNAA+(0.5～2.0)mg/LIBA。
(5)微根茎增殖：将上步骤诱导产生的微根茎转入微根茎增殖培养基上培养获得微根茎或丛生苗；所述微根茎增殖培养基为MS+(1.0～2.0)mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+(0.5～1.0)mg/LIBA。
(6)移栽定植步骤，具体操作为用水洗净丛生苗上的培养基，再用2‰甲基托布津冲洗1min，然后移栽苗床，覆土深度2～4cm，浇水定植，最后外搭塑料拱棚，并加黑色遮阳网，控制光照；保持空气湿度70％～80％，温度23～25℃；
待新芽抽出后，移栽大田定植。
其中，步骤(2)～(5)均为21±1℃遮光培养，湿度70％～80％。
实施例2
1、外植体的预处理及消毒
将鸡头黄精根状茎去除根须，表面泥土用自来水冲洗干净，较大较长的材料分为小段，在加洗洁精的自来水中用软毛刷清洗表面杂物，重复换水清洗三次，最后用自来水持续冲洗1.5～2h，随后转移至超净工作台内无菌三角瓶中。
首先用75％的酒精浸泡消毒6～8s后，无菌水漂洗三次(1min/次)，再用0.1％的HgCl2浸泡消毒7～10min(分别为7、8、9、10min四个时间段)，最后用无菌水漂洗五次(1min/次)，其中最后一次用无菌水浸泡1～2min，彻底去除表面升汞残留，然后取出放置于含滤纸的无菌培养皿中沥干水分，用手术刀切成小段，接入初代培养基中。最后通过污染率进行对比分析，筛选最适合的HgCl2处理时间。
结果表明，根状茎经0.1％的HgCl2消毒7min，培养1～2d后，霉菌污染较严重；将消毒时间延长至10min，外植体变黑，甚至死亡；而消毒8min污染相对较轻，经15d培养，不但顶芽抽出，且个别外植体的芽基部膨大。因此，认为75％酒精消毒6～8s---无菌水漂洗3次---0.1％HgCl2消毒8min---无菌水漂洗5次为鸡头黄精根状茎最佳消毒方式。
2、初代培养
将已消毒鸡头黄精根茎切成小段(0.5～1cm)，接种于初代培养基(以MS培养基为基础配方添加不同激素)中培养(见表2)，每瓶接种2～3块，设6组处理，每组5瓶共接种30瓶，培养并观察，定期记录、拍照和统计。定期观察根状茎生长及出芽情况。
表2
结果表明，6-BA与NAA、IBA、IAA三种不同生长素组合，虽然根状茎均未诱导产生愈伤组织，但20d左右均长出不定根。比较发现，0.2mg/L的6-BA分别与NAA或IBA配合，不定根诱导效果均优于6-BA与IAA配合，说明6-BA+NAA或IBA，更适合诱导产生不定根，以MS+0.2mg/L6-BA+(0.2～0.5)mg/LNAA效果最佳。
3、愈伤组织及不定根诱导培养
将初代培养获得的材料接入诱导培养基(以MS培养基为基础配方添加不同激素)中培养(见表3)。每瓶接种两块根状茎，共设6组处理，每组5瓶，共30瓶。定期观察愈伤组织及不定根诱导情况。
表3
结果表明，6-BA+IBA配合，产生的不定根细弱，且生长缓慢，而一定浓度的6-BA(0.5～1.0)mg/L+NAA(0.5～1.0)mg/L配合诱导效果明显优于6-BA+IBA，其中，0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA配合，20d左右顶芽最早萌发生长，芽健壮，状态良好(参见附图1A)，同时，产生粗壮的不定根(参见附图1B、1C)，1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA组合下，产生大量簇生、粗壮的不定根(参见附图1D)，且顶端部分出现愈伤化，生长状态良好，而高浓度的2.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA组合，诱导效果下降。
故，MS+6-BA(0.5～1.0)mg/L+NAA(0.5～1.0)mg/L产生大量粗壮的不定根，利于后期微根茎的诱导。在此培养基上继代培养15d左右的不定根，达到诱导小球茎的最佳状态，同时，在此培养基上继代2～3代，可分化获得少量微根茎。
4、微根茎诱导
(1)不定根状态对微根茎诱导的影响
将不同幼嫩程度的不定根直接剪去根尖或长约0.3cm～0.5cm的根段，接种于筛选的MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培养基中培养。结果(参见附图2)发现，新诱导产生的、培养不超过一周的不定根，其根尖切口易产生愈伤组织(附图2A)，培养时间较长、颜色发绿的根切口不易脱分化、且易褐化(附图2B)，而培养15d左右的根段，幼嫩程度适宜，培养15d左右切口首先膨大，进而形成微根茎(附图2C)；同时发现，根段仅在近地端切口处脱分化形成微根茎。因此，认为不定根的幼嫩程度决定愈伤组织或微根茎的产生，而培养15d左右的不定根是诱导微根茎的适宜材料。
(2)培养基中不同激素及浓度对微根茎诱导的影响
将增殖产生的、状态良好的不定根转入微根茎诱导培养基(见表4)中，设置6-BA(0、0.2、0.5mg/L)、NAA(0.5、1.0、2.0mg/L)、IBA(0.5、1.0、2.0mg/L)作为三因子三水平设置试验，试验共有9个处理。每个处理接种6瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次。接种20d后统计其愈伤化率。
表4
结果发现，20d后部分不定根切口开始愈伤化，继而或者产生新的不定根，或者膨大后形成微根茎。其中，8号0.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+0.5mg/LIBA处理下，不定根愈伤化率最高，达73％，且最早产生微根茎；其次是7号0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+2.0mg/LIBA。根据正交试验数据分析结果表明，6-BA、NAA、IBA因素的极差值由大到小依次为6-BA＞IBA＞NAA，说明6-BA对愈伤化率的影响最大，其次为IBA，NAA对愈伤化率的影响最小。筛选出微根茎诱导培养基的配方为MS+0.5mg/L6BA+(0.5～1.0)mg/LNAA+(0.5～2.0)mg/LIBA。
5、微根茎增殖
将上步骤诱导产生的微根茎转入微根茎增殖培养基(见表5)上培养获得微根茎或丛生苗，设置6-BA(0.5、1.0、2.0mg·L-1)、NAA(0、0.2、0.5mg·L-1)、IBA(0、0.5、1.0mg·L-1)进行三因子三水平试验，试验共9个处理。每个处理接种6瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次。统计实验结果并计算增殖系数。
增殖系数＝增殖根茎总数/接种根茎总数
总增殖系数＝第1代增殖系数ⅹ第2代增殖系数ⅹ第3代增殖系数
表5
结果表明，MS+6-BA(1.0～2.0)mg/L+NAA0.5mg/L+IBA(0.5～1.0)mg/L配合，不定根切口较早脱分化，膨大后产生微根茎。其中，以MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIBA效果最优(参见附图3)，20～30d切口首先膨大，形成微根茎(附图3A)，2～3代后增殖产生大量微根茎(附图3B)，且根茎生长迅速，体积明显增大(附图3C)，呈黄白色，表面产生大量芽点(附图3D)，培养50～60d后产生大量丛生苗(附图3E、附图3F)，经此培养基增殖，3代总增殖系数达11.45，且生长迅速。
6、步骤1-5中培养温度及光照
培养条件直接影响植物的生长状况。培养中发现，温度和光照影响鸡头黄精根状茎的生长(参见附图4)。其中，(25±2)℃温度下鸡头黄精根状茎较易褐化，而(21±1)℃，长势较好；遮光培养，根状茎生长良好，但转入12h·d-1光照培养5d后，根状茎严重褐化。究其原因可能与鸡头黄精原生境为林下，且植物根部一般在地下生长相关。结果表明，鸡头黄精无性系建立最佳培养条件为(21±1)℃、遮光培养。
7、移栽定植
用水洗净丛生苗上的培养基，再用2‰甲基托布津冲洗1min，然后移栽苗床，覆土深度2～4cm，浇水定植，最后外搭塑料拱棚，并加黑色遮阳网，控制光照；保持空气湿度70％～80％，温度23～25℃；
待新芽抽出后，移栽大田定植，移栽成活率可达78％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的预处理及消毒；
（2）初代培养：将鸡头黄精根茎切成小段，接种于初代培养基中培养，所述初代培养基为MS＋0.2mg/L 6-BA＋（0.2~0.5）mg/L NAA或MS+0.2mg/L 6-BA+（0.5~1.0）mg/L IBA；
（3）愈伤组织及不定根诱导培养：将初代培养获得的材料切成小段，接种于诱导培养基中培养至不定根生成，所述诱导培养基为MS +（0.5~1.0）mg/L 6-BA +（0.5~1.0）mg/L NAA；
（4）微根茎诱导：将幼嫩不定根剪去根尖转入微根茎诱导培养基中，不定根切口愈伤化产生新的不定根或者膨大后形成微根茎；所述微根茎诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA +（0.5~1.0）mg/L NAA+（0.5~2.0）mg/L IBA；
（5）微根茎增殖：将上步骤诱导产生的微根茎转入微根茎增殖培养基上培养获得增殖的微根茎或丛生苗；所述微根茎增殖培养基为MS+(1.0～2.0)mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+(0.5～1.0)mg/L IBA；
且，步骤（2）~（5）均为21±1℃遮光培养，湿度70%~80%。
2.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（1）外植体的预处理及消毒方法为以根状茎为外植体，用75%酒精消毒6～8s，无菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl
2处理8min，无菌水漂洗5次。
3.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（2）初代培养将根茎切成0.5~1.0cm小段，所述初代培养基为MS＋0.2mg/L 6-BA＋（0.2~0.5）mg/L NAA。
4.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（3）愈伤组织及不定根诱导培养将材料切成0.5~1.0cm小段，所述诱导培养基为MS +1.0mg/L 6-BA +1.0mg/L NAA。
5.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（4）微根茎诱导中根尖剪去长度为0.3 cm～0.5cm；
所述微根茎诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L NAA+0.5mg/L IBA。
6.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（5）微根茎增殖培养基为MS+2.0mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA+0.5mg/L IBA。
7.根据权利要求1所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，步骤（2）~（5）中MS培养基均含7.6g/L琼脂和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
8.根据权利要求1~7任一所述的鸡头黄精无性系建立及微根茎快速繁殖方法，其特征在于，还包括移栽定植步骤，具体操作为用水洗净微根茎或丛生苗上的培养基，再用2‰甲基托布津冲洗1min，然后移栽苗床，覆土深度2～4 cm，浇水定植，最后外搭塑料拱棚，并加黑色遮阳网，控制光照；保持空气湿度70%～80%，温度23~25℃；
待新芽抽出后，移栽大田定植。
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