CN109463282A - 一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法 - Google Patents

一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，针对现有龙牙百合快繁技术污染率高，繁殖系数低、速度慢等不足，采用龙牙百合块茎的内层鳞片作为外植体，接种于MS+6‑BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的诱导培养基，接种完成后将培养瓶放在24～26℃恒温培养室内，每日光照10～12h，光照强度为1600～2000ux，诱导出龙牙百合鳞片不定芽并培养分化出3～4cm的龙牙百合组培苗；再将所述龙牙百合组培苗接种于1/2MS+NAA 0.1～0.2mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的生根培养基上进行诱导生根。培养基中使用的灭菌中草药含大黄、黄芩、艾草、三七、丹参各20％。在生根培养基中添加杀菌中草药，有效的抑制了细菌、真菌、霉菌以及酵母菌的生长和繁殖，大大降低了污染率。

Description

一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法
技术领域
本发明涉及一种生物快繁生根技术，尤其是涉及一种龙牙百合组织培养中利用中草药杀菌进行植物组织培养的方法。
背景技术
龙牙百合（Liliumbrownii var.viridulum）是百合科百合属（Lilium）多年生鳞茎类植物，产于北至河北、山西，南至湖南、江西等地，主产于湖南邵阳、隆回和江西万载、泰和等地，近年来广西永福、资源等地也有大量栽培。龙牙百合因其鳞片肥大、形似龙牙而得名，是我国食用人工栽培的三大百合品种之一，品质优良、营养丰富，在东南亚国家和地区深受消费者青睐。人体所需的生物碱、淀粉、蛋白质、脂肪以及各种维生素和丰富的微量元素均可在龙牙百合的鳞茎中获得，百合对于四季之间热、燥等引起的心烦失眠、咽干喉痛、鼻出血以及更年期男女出现的神疲乏力、食欲不振、低热失眠、心烦口渴等症状均具有良好的治疗作用，乃四季常用的滋阴补品。
百合的传统繁殖方式为分球、分株芽、鳞片扦插、鳞片包埋等,繁殖系数低、速度慢,特别是经多代繁殖以后，常造成种性退化和病毒积累，影响百合的产量和质量。对于百合而言，通过种子繁殖获得的后代具有较强的变异性、不能保持亲代的优良特性，繁殖系数低等问题。以往遇到技术性瓶颈的如何工厂化大规模培育龙牙百合这一问题在组培快繁技术的发展下也得到解决，组织培养在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。
在植物组织培养技术研究和生产过程中主要存在的问题，如污染、玻璃化、褐变、生根难、炼苗难等，是造成组培苗生产成本偏高的原因。尤其污染是组培过程中很难控制的问题,也是组培快繁技术在商业化应用中的限制因素，但在众多研究和报道表明，除使用化学试剂进行消毒外，中草药单体具有优良的抗菌作用。
应用植物组培快繁方法在一定程度上解决了百合优质鳞茎短缺的现象，有关百合的快速繁殖技术国内多有报道。但是，在百合组织培养的初期阶段有一个共同的问题，那就是百合外植体中内生菌无法有效的去除，特别是百合鳞片。目前，百合组织培养中主要使用酒精、升汞、次氯酸等进行百合外植体表面消毒，初期培养中不断观察，凡是有污染的立即去除，往往只能保留下来很少的没有被内生菌污染外植体，这样不仅浪费了材料，而且浪费了大量的人力、物力。
发明内容
本发明针对现有龙牙百合快繁技术污染率高，繁殖系数低、速度慢等不足，提出一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，利用植物组织培养方法，筛选初代诱导→生根培养等不同时期的培养基，利用中草药优良的抗菌作用，对生根培养基成分进行优化，使生根培养达到最佳效果，短时间内在室内获得大规模繁殖粗壮的龙牙百合组培苗。
本发明采用的技术方案如下：
一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，首先，采用龙牙百合块茎的内层鳞片作为外植体，对其进行处理；然后，将所述外植体接种于MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的诱导培养基，接种完成后将培养瓶放在24～26℃恒温培养室内，每日光照10～12h，光照强度为1600～2000ux，定期进行观察，诱导出龙牙百合鳞片不定芽并培养到一定时间，分化出长3～4cm 的龙牙百合组培苗；第三，将前述分化出长度3～4cm的龙牙百合组培苗，接种于1/2MS+ NAA 0.1～0.2mg/L +活性炭0.1～0.2g/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的生根培养基上，进行诱导生根；培养基中使用的灭菌中草药制备方法如下：
（1）将大黄、黄芩、艾草、三七、丹参五种中草药清洗晾晒阴干，分别用碾压机、粉碎机碾压和粉碎，通过200目负压风筛，制取药粉；
（2）按大黄20％、黄芩20％、艾草20％、三七20％、丹参20％的质量比例称取5味中草药，用v型高效混合机将称取的中草药混合制成药粉，制得所述杀菌中草药。
所述外植体发芽诱导培养基配方为：MS、吲哚乙酸0.1～0.3mg/L、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、细胞分裂素0.5～1.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2；其中所述细胞分裂素采用6-苄基腺嘌呤、玉米素或激动素等。所述外植体诱导生根培养基配方为：1/2MS、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2。
所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，采挖可开花的成年龙牙百合鳞茎，除去最外层有病斑的鳞片，沿着鳞茎盘将内层鳞片掰下，浸泡，冲洗干净，将龙牙百合的内层鳞片切成5mm*5mm 的小块，作为诱导生根的外植体；将所述未处理的内层鳞片用清水冲洗，冲洗后用洗洁精溶液浸泡10～15min，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗三遍；鳞片晾干后依次用75% 酒精浸泡15s，然后采用1%的氯化汞浸泡消毒8～10min，其中两次消毒剂浸泡后均用灭菌水冲洗3～4次。切取5mm*5mm 的小块鳞片操作在超净工作台上完成，并采用紫外线照射进行灭菌。
发明有益效果：
1、本发明龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，龙牙百合组培的外植体优选百合内层鳞茎，组织培养的诱导培养基为：MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L；生根培养基为：1/2MS+ NAA 0.1～0.2mg/L +活性炭0.1～0.2g/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L。实验过程中是以M S 为基本培养基，对培养基成分进行优化，根据实验数据分析，加入活性炭的培养基生根效果较好，生根基部可新增带根的丛生芽，平均可达3～4 个，可见活性炭对龙牙百合根的生长有利。
2、本发明龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，根据中草药特殊的抗病原微生物机制，在诱导外植体发芽和生根时加入中草药可以降低污染率。与以往的组织培养技术相比，在生根培养基中添加杀菌中草药可以有效的抑制细菌、真菌、霉菌以及酵母菌的生长和繁殖，大大降低了污染率，且因为中草药的滋养作用，该组织培养技术可以短时间内在室内获得大规模繁殖粗壮的龙牙百合组培苗。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明技术方案做进一步的详细描述。以下各实施例仅用于说明本发明，不应当构成对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在现有技术范围内，采用惯用技术手段的置换以及和现有技术进行简单组合，均不脱离本发明保护范围。
实施例1
本发明一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，过程如下：首先，采用龙牙百合块茎的内层鳞片作为外植体，对其进行处理；然后，将所述外植体接种于MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的诱导培养基，接种完成后将培养瓶放在24～26℃恒温培养室内，每日光照10～12h，光照强度为1600～2000ux，定期进行观察，诱导出龙牙百合鳞片不定芽并培养到一定时间，分化出长3～4cm 的龙牙百合组培苗；第三，将前述分化出长度3～4cm 的龙牙百合组培苗，接种于1/2MS+ NAA 0.1～0.2mg/L +活性炭0.1～0.2g/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的生根培养基上，进行诱导生根。
培养基中使用的灭菌中草药制备方法如下：
（1）将大黄、黄芩、艾草、三七、丹参五种中草药清洗晾晒阴干，分别用碾压机、粉碎机碾压和粉碎，通过200目负压风筛，制取药粉；
（2）按大黄20％、黄芩20％、艾草20％、三七20％、丹参20％的质量比例称取5味中草药，用v型高效混合机将称取的中草药混合制成药粉，制得所述杀菌中草药。
实施例2
本实施例的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，与实施例1不同的是，进一步的，所述外植体发芽诱导培养基配方为：MS、吲哚乙酸0.1～0.3mg/L、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、细胞分裂素0.5～1.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2；所述细胞分裂素采用6-苄基腺嘌呤、玉米素或激动素。
实施例3
本实施例的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，与实施例1或实施例2不同的是，进一步的，所述外植体诱导生根培养基配方为：1/2MS、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2。
实施例4
本实施例的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，与前述各实施例不同的是，进一步公开了选用龙牙百合的内层基部鳞片切成5mm*5mm 的小块，作为诱导生根的外植体前期处理方法：采挖可开花的成年龙牙百合鳞茎，除去最外层有病斑的鳞片，沿着鳞茎盘将内层鳞片掰下，浸泡，冲洗干净，将龙牙百合的内层鳞片切成5mm*5mm 的小块，作为诱导生根的外植体；将所述未处理的内层鳞片用清水冲洗，冲洗后用洗洁精溶液浸泡10～15min，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗三遍；鳞片晾干后依次用75% 酒精浸泡15s，然后采用1%的氯化汞浸泡消毒8～10min，其中两次消毒剂浸泡后均用灭菌水冲洗3～4次。
本发明龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，龙牙百合组培各个阶段培养流程包括：
1、取外植体：龙牙百合的鳞茎→灭菌消毒→选取内层鳞茎的不同部位→无菌外植体；
2、诱导培养：无菌外植体→诱导发芽的培养基上培养；
3、生根培养：3～4cm幼芽的龙牙百合苗→生根培养基培养→生根的幼苗；
4、出瓶移栽：生根的幼苗→移栽到小花盆里。栽种的当年不进行采收，让其自然越冬和春化，待次年植株出土后进行中耕管理，直至11月种球成熟后进行采收，筛选分级获得合格的种球。
下面通过实验的方式，对本发明技术方案进行分析。选用龙牙百合的内层鳞片作实验材料诱导生根，切成5mm*5mm 的小块。
龙牙百合的材料和筛选统计方法
材料：实验用的龙牙百合取自兰州龙牙百合组培种球；
统计计算公式：
成活率＝( 有生活力的外植体数/ 接种的外植体总数)×100％
不定芽诱导率＝( 出芽的外植体数/ 接种的外植体总数)×100％
污染率＝( 污染的外植体数/ 接种的外植体总数)×100％
生根率= ( 生根的外植体数/ 接种的外植体总数)×100％。
实验1：鳞片部位对龙牙百合不定芽诱导的影响
将鳞片分为外层、中层和内层三组，接种于MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的诱导培养基上，第30天分别统计不定芽的诱导率，结果如表1所示；
表1：诱导培养基中外植体鳞片不同位置的诱导情况统计表
实验2：中草药对龙牙百合不定芽诱导污染率的影响
将处理好的外植体培养的MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药的诱导培养基中，设置浓度梯度，将中草药成分的浓度设置为1.0 mg/L、0.7 mg/L、0.4 mg/L、0.1 mg/L等5组，编号为A、B、C、D、E按量加入配置的培养基中，每组分别培养50瓶，第30天分别统计组织培养的污染率，结果如表2所示；
表2：中草药对龙牙百合诱导出芽的情况统计表
实验3：生根培养基的选择
实验3.1不同浓度的MS培养基对龙牙百合生根的影响
将分化出的长3cm左右的龙牙百合苗，分别接种于添加活性炭0.1～0.2g和NAA0.1～0.2mg/L的MS、1/2MS和1/4MS培养基，进行诱导生根，探讨不同浓度的MS培养基对龙牙百合生根的影响，第20天观察其生根情况，结果如表3所示；
表3：不同浓度的MS培养基对龙牙百合生根的影响
实验3.2中草药对生根培养基生根情况的影响
在3.1实验的基础上研究中草药对生根培养基生根情况的影响，即将初代培养中分化出的长3cm左右的龙牙百合苗，接种于浓度为0.1～1.0 mg/L的中草药培养基中，并设置不含中草药空白对照实验。生根培养基为1/2MS+NAA0.1～0.2mg/L+活性炭0.1～0.2g/L，每组实验有30瓶组培苗。第20天观察其生根情况，结果如表4所示；
表4：中草药对龙牙百合诱导出芽的情况统计表
实验3.3活性炭对龙牙百合生根的影响
将分化出长度3cm左右的龙牙百合组培苗，分别接种于添加活性炭0.1～0.2g和NAA0.1～0.2mg/L的1/2MS和未添加活性炭1/2MS培养基，进行诱导生根，第十天开始每日观察，记录其生根情况，结果如表5所示；
表5：活性炭对龙牙百合鳞片生根的影响
培养基种类 开始生根时间/天 生根率/% 生长情况
1/2MS 17 80.5 数量少，较粗壮
活性炭+1/2MS 14 90.7 数量多，粗壮

Claims (6)

1.一种龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：
首先，采用龙牙百合块茎的内层鳞片作为外植体，对其进行处理；
然后，将所述外植体接种于MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的诱导培养基，接种完成后将培养瓶放在24～26℃恒温培养室内，每日光照10～12h，光照强度为1600～2000ux，定期进行观察，诱导出龙牙百合鳞片不定芽并培养到一定时间，分化出长3～4cm 的龙牙百合组培苗；
第三，将前述分化出长度3～4cm 的龙牙百合组培苗，接种于1/2MS+ NAA 0.1～0.2mg/L +活性炭0.1～0.2g/L+杀菌中草药0.1～1.0mg/L的生根培养基上，进行诱导生根；
培养基中使用的灭菌中草药制备方法如下：
（1）将大黄、黄芩、艾草、三七、丹参五种中草药清洗晾晒阴干，分别用碾压机、粉碎机碾压和粉碎，通过200目负压风筛，制取药粉；
（2）按大黄20％、黄芩20％、艾草20％、三七20％、丹参20％的质量比例称取5味中草药，用v型高效混合机将称取的中草药混合制成药粉，制得所述杀菌中草药。
2. 根据权利要求1所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：所述外植体发芽诱导培养基配方为：MS、吲哚乙酸0.1～0.3mg/L、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、细胞分裂素0.5～1.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2；所述细胞分裂素采用6-苄基腺嘌呤、玉米素或激动素。
3. 根据权利要求1或2所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：所述外植体诱导生根培养基配方为：1/2MS、琼脂10～13g/L、蔗糖30g/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、杀菌中草药0.1～1.0mg/L、pH值为5.8～6.2。
4. 根据权利要求3所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：采挖可开花的成年龙牙百合鳞茎，除去最外层有病斑的鳞片，沿着鳞茎盘将内层鳞片掰下，浸泡，冲洗干净，将龙牙百合的内层鳞片切成5mm*5mm 的小块，作为诱导生根的外植体；将所述未处理的内层鳞片用清水冲洗，冲洗后用洗洁精溶液浸泡10～15min，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗三遍；鳞片晾干后依次用75% 酒精浸泡15s，然后采用1%的氯化汞浸泡消毒8～10min，其中两次消毒剂浸泡后均用灭菌水冲洗3～4次。
5. 根据权利要求1或2所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：采挖可开花的成年龙牙百合鳞茎，除去最外层有病斑的鳞片，沿着鳞茎盘将内层鳞片掰下，浸泡，冲洗干净，将龙牙百合的内层鳞片切成5mm*5mm 的小块，作为诱导生根的外植体；将所述未处理的内层鳞片用清水冲洗，冲洗后用洗洁精溶液浸泡10～15min，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗三遍；鳞片晾干后依次用75% 酒精浸泡15s，然后采用1%的氯化汞浸泡消毒8～10min，其中两次消毒剂浸泡后均用灭菌水冲洗3～4次。
6. 根据权利要求1、2或4所述的龙牙百合小鳞茎快繁生根方法，其特征在于：切取5mm*5mm 的小块鳞片操作在超净工作台上完成，并采用紫外线照射进行灭菌。
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