CN113907005A

CN113907005A - 一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法

Info

Publication number: CN113907005A
Application number: CN202111240461.2A
Authority: CN
Inventors: 梁喜龙; 李晓驹; 方淑梅; 韩文革; 王庆艳; 鞠世杰; 胡瑞学
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN113907005B

Abstract

本发明涉及一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，包括绿豆无菌苗的获得、绿豆外植体的获得、绿豆丛生芽的获得、绿豆再生植株的获得、绿豆再生苗的移栽五个步骤。本发明还公开了能诱导不定芽生长和伸长的培养基，同时在培养基中添加天冬氨酸与马铃薯汁液，提高不定芽诱导率。本发明公开了绿豆直接再生体系的建立方法，试验结果表明绿豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生芽，再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高，直接再生周期短，直接再生易于操作，重现性好。

Description

一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，涉及一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法。

背景技术

绿豆(Vigna radiate L.)作为一种重要的豆科作物起源于亚洲，并在亚洲、欧洲与非洲地区的许多国家及澳大利亚均有栽培。由于富含维生素、蛋白质及各种矿物质元素，绿豆具有“食中佳品，济世长谷”之称，属于医食兼用类保健食品，在我国至今已有2000多年的种植历史。

绿豆作为一种严格闭花授粉作物，其种性退化严重，再加之人工杂交成功率低及绿豆现代遗传基础理论研究薄弱，因此优良品种更新极为缓慢。当前随着分子生物学技术的快速发展及其他豆科作物转基因技术的不断成熟和突破，在今后的绿豆创新育种中，利用分子标记、基因编辑和转基因手段，发掘优异功能基因，打破有利性状与不利基因之间的连锁，提升优异基因在新品种培育中的利用效率，进而提升绿豆育种水平，就成为一种必然。然而若想开展相关研究，实现上述目标，急需简便快速高效的绿豆组培技术出现。

目前虽然有成熟的大豆组培技术，但由于绿豆与大豆在起源、遗传基础及生理生化方面存在较大差异，使大豆组培技术不能经简单调配后使用，尤其是其中的培养基配方及组培条件。因此，需要构建一种绿豆的组培体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，克服目前的大豆组培技术不适用于绿豆组培，需要专用于绿豆的组培体系的问题。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，该方法包括以下步骤：

(1)绿豆无菌苗的获得：将绿豆种子消毒、清洗，接种在萌发培养基上，在25±2℃条件下弱光培养，光照条件3000-6000lux，16h/8h光周期，获得无菌苗；

(2)绿豆外植体的获得：选取生长良好，子叶肥大的绿豆无菌苗，切除顶端生长点及胚根，留下带有2-3mm胚轴的子叶作为外植体，且在胚轴部分用无菌刀轻划3-5次，伤口深约为0.5mm；

(3)绿豆丛生芽的获得：将步骤(2)获得的外植体接种在不定芽诱导及伸长培养基上，在25±2℃条件下光照，光照条件15000-20000lux，16h/8h光周期，培养14-18天，待不定芽伸长到4-5cm；

(4)绿豆再生植株的获得：将步骤(3)获得的优势苗直接接种在生根培养基中；

(5)绿豆再生苗的移栽：将步骤(4)获得的再生植株，开盖炼苗3天，洗净根系上的培养基，再将植株移栽到花盆内，透灌后至于相对湿度60％，25±2℃，12h/12h光周期条件下，进行正常的盆栽管理即可。

进一步的，步骤(1)中萌发培养基的成分为：MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ0.5-5.0mg/L pH＝5.6-6.0。

进一步的，步骤(3)中不定芽诱导伸长培养基的成分：MSB+马铃薯液100-500mL/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.5-4.00mg/L+IBA0.1-1.0mg/L+GA31.0-4.0mg/L，pH＝5.8-6.0。

进一步的，步骤(4)中生根培养基的成分为：1/2MSB+马铃薯液100-500ml/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 0.1-1.0mg/L+活性炭0.1-1.0g/L，pH＝5.6-5.8。

进一步的，步骤(4)中如果只有弱势苗，则可先接种在MSB培养基中培养至苗长4-5cm，再接种在生根培养基中，在25±2℃条件下光照，光照条件15000-20000lux，16h/8h光周期，培养7-10天，待生长至主根8-12条，根长3-5cm。

进一步的，所述的马铃薯液是将200g去皮的马铃薯切成块，煮沸30min，过滤后定容至500mL。

采用上述技术方案的积极效果：本发明公开了绿豆直接再生体系的建立方法，试验结果表明绿豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生芽，再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高，直接再生周期短，直接再生易于操作，重现性好；本发明将传统培养方法中不定芽诱导培养基与不定芽伸长培养基优化为一个能诱导不定芽生长和伸长的培养基，同时在培养基中添加天冬氨酸与马铃薯汁液，提高不定芽诱导率，简化操作步骤，缩短培养周期，同时还减少因反复操作造成污染的可能性，为绿豆组培及基因工程育种提供了可靠的技术支持。

附图说明

图1是分步式培养与复合培养基绿豆不定芽的状态(左图为经过传统的芽诱导培养基诱导14天后移栽至伸长培养基中12天的状态，共26天；右图是经过改良后的复合培养基直接诱导不定芽及伸长14天后的状态。相比与传统的分布式培养，复合培养基周期更短、长势均一、茎粗较大、操作简便)；

图2是绿豆组织培养离体再生过程(图A绿豆种子萌发；图B绿豆种子萌发5-7天；图C大小均一肥厚的子叶节外植体；图D子叶节5天后诱导出不定芽；图E 7天后不定芽伸长至3-4cm；图F弱势不定芽更换培养基培养；图G丛生芽7-12天生根；图H再生苗移栽，正常管理)；

图3是主流培养基对丛生芽诱导的影响(图A为用本专利内容中的复合培养基诱导绿豆子叶节，丛生芽的生长状态；图B为用大豆主流培养基诱导绿豆子叶节，丛生芽的生长状态；图C为用绿豆主流培养基诱导绿豆子叶节，丛生芽的生长状态。图片均拍摄于接种至诱导培养基后的18天。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1

(1)绿豆无菌苗的获取方法及培养基配方：

挑选籽粒均匀、饱满，表面无病斑的绿豆种子，置于容器内，将绿豆种子完全浸泡在浓度为0.10％的氯化汞溶液中，持续20min，期间摇动3-4次，使种子表面与溶液充分接触，提高杀菌效果。然后再将浸泡好的种子置于浓度为70％的酒精中，持续5min，期间摇动1-2次。消毒方法的选择如表1。

表1绿豆种子消毒方法的选择

注：氯气、次氯酸钠、升汞消毒法是种子消毒常用的方法，步骤及用量都是己知的；启动时间指80％绿豆种子长出胚根的天数；升汞+浸泡20min是指用升所述的消毒方法为采用0.10％的氯化汞溶液浸泡20min，期间摇动3-4次。然后再用浓度为70％的酒精处理，持续5min，期间摇动1-2次。最后用无菌水清洗4-5次，其中在清洗第3次时需用无菌水浸泡绿豆种子20min。

最后将灭菌消毒后的绿豆种子用无菌水清洗4-5次，在清洗第3次时，需要用无菌水浸泡绿豆种子20min，有助于清除种皮表面的消毒剂，使种子吸胀，加快种子萌发，并提高种子发芽率，最后再用无菌水清洗1-2次。整个灭菌消毒过程均需在超净工作台内完成。将绿豆种子均匀的放在萌发培养基上(MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ0.5-5.0mg/L pH＝5.6-6.0)上。萌发培养基中添加TDZ会抑制根的生长，促进子叶节膨大，方便后期划伤处理，即减少了子叶用于根系发育的营养损失，同时促进子叶节附近的芽原基细胞的启动。种子萌发的环境温度为25±2℃，16h/8h光周期，培养时间5-7天。结果如表2。

表2萌发培养基中添加TDZ对丛生芽诱导的影响

注：丛生芽诱导培养基是指MSB+马铃薯液100-500ml/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.5-4.00mg/L+IBA 0.1-1.0mg/L+GA31.0-4.0mg/L，pH＝5.6-6.0。

(2)不定芽诱导伸长培养基配方及操作方法

本培养基是一种既能诱导不定芽还能促进不定芽伸长的双功能培养基。将萌发5-7天的绿豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，垫上无菌滤纸，切除顶端生长点及胚根，留下子叶上下各1±0.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带下胚轴的子叶，同时将胚轴部分用无菌刀轻划3-5次，伤口深约为0.5mm；再将处理好的子叶背面三分之一向下插入芽诱导培养基，并置于组培室中培养，培养环境温度为25±2℃，16h/8h光周期；培养14-18天后可获得株高3-5cm的再生苗。所述不定芽诱导伸长培养基为MSB+马铃薯液100-500ml/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.5-4.00mg/L+IBA0.1-1.0mg/L+GA₃1.0-4.0mg/L，pH＝5.6-6.0。通过筛选各种功能培养基中不同激素种类、配比及植物源营养汁液，最终获得一种能同时诱导生芽和伸长的复合培养基，使传统的4步式组织培养(外植体获得-诱导不定芽-不定芽伸长-不定芽生根)简化成3步式培养(外植体获得-不定芽的诱导及伸长-不定芽生根)，简化操作步骤，减少培养时间，同时解决单一使用GA₃造成植株茎细，后期移栽易折损的问题，图1为分步式培养与复合培养基绿豆不定芽的状态。添加天冬氨酸可促进芽原基细胞分裂，添加马铃薯液可解决丛生芽基部褐化问题，同时能提供营养改善丛生芽的生长状态，使丛生芽茎部增粗，叶面积增大，表3为不同培养基配方对丛生芽生长的影响。

表3不同培养基配方对丛生芽的影响

注：MSB+激素培养基是指MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA0.5-4.0mg/L+IBA0.1-1.0mg/L+GA3 1.0-4.0mg/L；天冬氨酸是指含量天冬氨酸50-500mg/L，马铃薯液是指马铃薯液100-500ml/L；优势苗指芽长超过2cm，劣势苗是指芽长不超过2cm，可用芽数是指丛生芽长出至少一片复叶。

(3)再生芽的生根培养基配方及操作方法

将长到4-5cm的不定芽沿基部从外植体上切下，将其插入生根培养基内，密封好后置于组培室内培养，培养环境温度为25±2℃，16h/8h光周期，7-10天可顺利生根；所述培养基为1/2MSB+马铃薯液100-500ml/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 0.1-1.0mg/L+活性炭0.1-1.0g/L，pH＝5.6-5.8；活性炭能吸附根系释放的有害物质，也为根生长提供了黑暗环境，更利于根系的生长。表4为不同培养基配方对生根的影响。

表4不同培养基配方对生根的影响

注：1/2MSB指浓度为标准MSB培养基浓度的一半；激素指IBA浓度为0.1-1.0mg/L；活性炭指活性炭浓度0.1-1.0g/L。

(4)组培苗的移栽方法

将再生苗轻轻取出，用清水将根部培养基清洗干净，然后放到无菌水中培3-4天，接着将组培苗移栽到灭过菌的基质(蛭石：花土＝3：1)中保湿培养，温度控制在25±2℃，相对湿度为60％，生长1周后移至温室环境继续培养；

(5)成活的组培苗在温室可同其他植物一样进行正常管理。

本发明所述的绿豆直接再生体系的建立方法，其中的绿豆品种指的是“绿丰2号”。

实施例2

萌发培养基：MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ 0.5mg/L pH＝5.6；

不定芽诱导伸长培养基：MSB+马铃薯液100ml/L+天冬氨酸50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.50mg/L+IBA 1.0mg/L+GA₃1.0mg/L，pH＝5.8；

生根培养基：1/2MSB+马铃薯液100ml/L+天冬氨酸50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 1.0mg/L+活性炭0.1g/L，pH＝5.6。

实施例3

萌发培养基：MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ 5.0mg/L pH＝6.0；

不定芽诱导伸长培养基：MSB+马铃薯液500ml/L+天冬氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 4.00mg/L+IBA 0.1mg/L+GA₃4.0mg/L，pH＝6.0；

生根培养基：1/2MSB+马铃薯液500ml/L+天冬氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 0.1mg/L+活性炭1.0g/L，pH＝5.8。

实施例4

萌发培养基：MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ 1.0mg/L pH＝5.7；

不定芽诱导伸长培养基：MSB+马铃薯液300ml/L+天冬氨酸300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 2.00mg/L+IBA 0.5mg/L+GA₃2.0mg/L，pH＝5.9；

生根培养基：1/2MSB+马铃薯液300ml/L+天冬氨酸300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 0.5mg/L+活性炭0.5g/L，pH＝5.7。

该方法绿豆种子消毒效果达100％、发芽率达99％，不定芽诱导率96％，可再生不定芽再生频率为7.8个/外植体，不定芽生根率达到98％，生根数量为8-12根/株，组培苗移栽成活率达100％。与主流的大豆培养基相比，主流大豆培养基接种外植体，茎粗壮，但其可再生不定芽再生频率为2个/外植体，且丛生芽长势不一致；与目前已有的绿豆培养基相比，在相同时间下，该方法可再生不定芽再生频率为7.8个/外植体，明显高于目前已有的绿豆培养基可再生不定芽再生频率为3.7个/外植体，且生长一致，周期短，如图3。表5为已有主流培养基对丛生芽诱导的影响。

表5主流培养基对诱导丛生芽的影响

注：本专利所用培养基指MSB++蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA0.5-4.0mg/L+IBA0.1-1.0mg/L+GA3 1.0-4.0mg/L+天冬氨酸50-500mg/L+马铃薯液；主流大豆培养基指B5+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L+6-BA1.0mg/L；已有培养基指B5+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+IBA0.1mg/L。

本发明公开了绿豆直接再生体系的建立方法，试验结果表明绿豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生芽，再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高。直接再生周期短，直接再生易于操作，重现性好；本发明将传统培养方法中不定芽诱导培养基与不定芽伸长培养基优化为一个能诱导不定芽生长和伸长的培养基，同时在培养基中添加天冬氨酸与马铃薯汁液，提高不定芽诱导率，简化操作步骤，缩短培养周期，同时还减少因反复操作造成污染的可能性，为绿豆组培及基因工程育种提供了可靠的技术支持。

Claims

1.一种简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(3)绿豆丛生芽的获得：将步骤(2)获得的外植体接种在不定芽诱导伸长培养基上，在25±2℃条件下光照，光照条件15000-20000lux，16h/8h光周期，培养14-18天，待不定芽伸长到4-5cm；

2.根据权利要求1所述的简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：步骤(1)中萌发培养基的成分为：MSB+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，TDZ 0.5-5.0mg/L pH＝5.6-6.0。

3.根据权利要求1所述的简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：步骤(3)中不定芽诱导伸长培养基的成分：MSB+马铃薯液100-500mL/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.5-4.00mg/L+IBA 0.1-1.0mg/L+GA3 1.0-4.0mg/L，pH＝5.8-6.0。

4.根据权利要求1所述的简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：步骤(4)中生根培养基的成分为：1/2MSB+马铃薯液100-500ml/L+天冬氨酸50-500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+IBA 0.1-1.0mg/L+活性炭0.1-1.0g/L，pH＝5.6-5.8。

5.根据权利要求1所述的简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：步骤(4)中如果只有弱势苗，则可先接种在MSB培养基中培养至苗长4-5cm，再接种在生根培养基中，在25±2℃条件下光照，光照条件15000-20000lux，16h/8h光周期，培养7-10天，待生长至主根8-12条，根长3-5cm。

6.根据权利要求3或4所述的简便快速高效的绿豆直接再生组培方法，其特征在于：所述的马铃薯液是将200g去皮的马铃薯切成块，煮沸30min，过滤后定容至500mL。