CN114532230A - 一种绿豆离体培养高效再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养技术领域，提出了一种绿豆离体培养高效再生的方法，将绿豆无菌苗的子叶节外植体放置于出芽培养基上诱导生成不定芽，继代培养一次，待不定芽长度大于3cm时，转接到生根培养基，最终得到再生苗；所述出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6‑BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；所述生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8。通过上述技术方案，解决了现有技术中绿豆离体再生培养操作步骤繁琐、成本相对较高、培养时间跨度较大的问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的，涉及一种绿豆离体培养高效再生的方法。
背景技术
植物组织离体培养技术作为细胞工程与基因工程研究的基本方法，具有实验条件人为可控、重复性强等特点，是获得基因改良植株的技术基础。绿豆[Vigna radiata(L.)Wilclzek]是温带、亚热带和热带高海拔地区广泛种植的食用豆类作物，产区主要在亚洲。绿豆生育期短、抗旱、耐瘠薄、固氮养地，其籽粒富含多种生理活性物质，具有清热解毒、保肝明目等保健功能，在我国农产品出口创汇、调整种植结构、丰富人们膳食和农产品加工利用等方面具有重要作用。相比主粮作物，绿豆在遗传研究与新品种选育等方面进展相对缓慢，通过基因工程技术创新绿豆种质和新品种具有直接、快速等优点。建立一个高效稳定的离体再生体系是绿豆转基因遗传转化体系的前提。
豆科作物中常见的再生体系包括子叶节再生体系、胚尖再生体系、愈伤组织再生体系和原生质体再生体系等。子叶节具有取材简便、诱导率高、生长快、不受季节限制等优点，目前仍是豆科作物再生体系优选的外植体，在大豆、小豆和豇豆中都有研究报道。不同作物间离体再生体系存在较大差异，迄今为止，世界上对于绿豆离体再生体系相关研究很少。
申请号为CN112167056A的发明专利申请，公开了一种绿豆子叶节再生培养方法，该方法将绿豆种子消毒处理后萌发产生无菌苗，通过去掉子叶、上胚轴和胚根获得子叶节作为外植体，转移到不定芽诱导培养基(B5培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+0.1mg/LIBA)培养10～15天，转入不定芽伸长培养基(B5培养基+0.1mg/L IBA)培养20～25天，待不定芽伸长到3～4cm后转入生根培养基(1/2MS培养基+1mg/L IBA)10～15天得到再生植株。但是，该方法存在植物激素种类较多，成本相对较高，操作步骤繁琐，培养时间跨度较大等情况。
发明内容
本发明提出一种绿豆离体培养高效再生的方法，解决了现有技术中绿豆离体再生培养操作步骤繁琐、成本相对较高、培养时间跨度较大的问题。
本发明的技术方案如下：
一种绿豆离体培养高效再生的方法，将绿豆无菌苗的子叶节外植体放置于出芽培养基上诱导生成不定芽，继代培养一次，待不定芽长度大于3cm时，转接到生根培养基，最终得到再生苗；
所述出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
所述生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8。
作为进一步的技术方案，包括以下步骤：
S1、无菌苗接种：将无菌绿豆种子接种于水琼脂培养基上培养，培养条件为：温度26±1℃、光照强度3000lx、光周期16小时光照/8小时黑暗；
S2、外植体制备：培养得到的无菌苗去掉子叶，子叶节部位上1～2mm切去真叶，下3～4mm切去下胚轴，留下的部位即为外植体；
S3、不定芽诱导：将外植体下胚轴端垂直向下插入出芽培养基中，在温度26±1℃、光照强度3000lx、光周期为16小时光照/8小时黑暗条件下培养14天，转接至新的出芽培养基中继代培养；所述出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
S4、生根培养：待不定芽长度大于3cm，从外植体上切下不定芽，转移至生根培养基，得到再生苗；所述生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8。
作为进一步的技术方案，步骤是S1所述无菌绿豆种子由绿豆种子经消毒、清洗、晾干得到。
作为进一步的技术方案，所述消毒为在无菌条件下，将绿豆种子先用75％的乙醇表面消毒0.5min，再用质量浓度为1％的NaClO溶液消毒15min，所述清洗为用灭菌蒸馏水冲洗。
作为进一步的技术方案，步骤S4中转移至生根培养基，得到再生苗，当再生苗基部生成3-5条主根且每条主根长度均大于3cm后，练苗3天，取出幼苗植株，洗净根部的培养基，移栽至营养钵中。
作为进一步的技术方案，所述营养钵中营养基质为珍珠岩：草木灰体积比1：3的混合基质。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明的绿豆离体培养再生方法先将绿豆无菌苗的子叶节放置于出芽培养基上诱导生成不定芽，继代培养一次，伸长的不定芽转接到生根培养基，最终得到再生苗，培养方法简单、易操作、成本低，有效解决了现有技术中绿豆离体再生培养过程复杂、培养时间长等问题。
2、本发明中，从消毒方式、子叶节制备、接种方式及出芽培养基、生根培养基配方几个方面进行改进，优化绿豆离体植株再生体系，培养出来的不定芽数目多、健壮无畸形，再生率高，再生周期短，丰富了绿豆子叶节直接再生植株的方法，对利用基因工程技术创新绿豆种质和新品种将具有现实意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实验例1中冀绿20号绿豆种子离体培养时的不定芽再生情况照片，拍摄于不定芽诱导培养14天；
图2为本发明实验例1中冀绿20号绿豆种子离体培养时的不定芽伸长情况照片，拍摄于不定芽继代培养14天；
图3为本发明实验例1中冀绿20号绿豆种子离体培养时的生根情况仰视照片，拍摄于生根培养14天；
图4为本发明实验例1中冀绿20号绿豆种子离体培养时的再生苗情况主视照片，拍摄于生根培养14天；
图5为本发明实验例1中冀绿20号绿豆种子离体培养时的再生苗移栽情况照片，拍摄于移栽7天。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
一种绿豆离体培养高效再生的方法，具体步骤如下：
S1、无菌苗接种：选取健康、饱满、无破损、大小均匀的绿豆种子，在无菌条件下，先用75％的乙醇表面消毒0.5min，再用质量浓度为1％的NaClO溶液消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗5次，晾干后将无菌种子接种于水琼脂培养基上培养，培养条件：温度26±1℃，光照强度3000lx，光周期为16小时光照/8小时黑暗；
S2、外植体制备：培养3天的无菌苗去掉子叶，子叶节部位上1mm切去真叶，下3mm切去下胚轴，留下的部位即为外植体；
S3、不定芽诱导：将外植体下胚轴端垂直向下插入出芽培养基中，在温度26±1℃，光照强度3000lx，光周期为16小时光照/8小时黑暗条件下培养14天，转接至新的出芽培养基中继代培养14天；出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
S4、生根培养：待不定芽长度大于3cm，从外植体上切下再生芽，转移至生根培养基，生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；当再生苗基部生成3条主根且每条主根长度均大于3cm后，练苗3天，取出幼苗植株，洗净根部的培养基，移栽到装有珍珠岩：草木灰体积比为1:3的混合基质营养钵中，塑料膜套住保湿5天，渐渐揭掉塑料膜，10天即可复壮成活。
实施例2
一种绿豆离体培养高效再生的方法，具体步骤如下：
S1、无菌苗接种：选取健康、饱满、无破损、大小均匀的绿豆种子，在无菌条件下，先用75％的乙醇表面消毒0.5min，再用质量浓度为1％的NaClO溶液消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗5次，晾干后将无菌种子接种于水琼脂培养基上培养，培养条件：温度26±1℃，光照强度3000lx，光周期为16小时光照/8小时黑暗；
S2、外植体制备：培养3天的无菌苗去掉子叶，子叶节部位上2mm切去真叶，下4mm切去下胚轴，留下的部位即为外植体；
S3、不定芽诱导：将外植体下胚轴端垂直向下插入出芽培养基中，在温度26±1℃，光照强度3000lx，光周期为16小时光照/8小时黑暗条件下培养14天，转接至新的出芽培养基中继代培养14天；出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
S4、生根培养：待不定芽长度大于3cm，从外植体上切下再生芽，转移至生根培养基，生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；当再生苗基部生成5条主根且每条主根长度均大于3cm后，练苗3天，取出幼苗植株，洗净根部的培养基，移栽到装有珍珠岩：草木灰体积比为1:3的混合基质营养钵中，塑料膜套住保湿5天，渐渐揭掉塑料膜，10天即可复壮成活。
实验例1不同绿豆品种的离体培养再生情况
实验材料：冀绿0204、冀绿7号、冀绿8号、冀绿9号、冀绿10号、冀绿13号、冀绿15号、冀绿17号、冀绿19号、冀绿20号绿豆种子；
实验方法：按照实施例1的方法进行离体培养
实验结果：
不同品种绿豆种子培养过程中无菌苗发芽率、不定芽再生率及生长情况见下表：
表1不同绿豆品种发芽率及不定芽诱导情况
这些绿豆品种中，冀绿20号绿豆种子经过离体培养再生后无菌苗发芽率、不定芽诱导再生率均表现突出，其诱导出的不定芽较其他品种表现为长势一致、不定芽数量多，健壮无畸形。
实验例2不同出芽培养基的出芽情况
实验材料：冀绿20号绿豆种子
实验方法：
实验组采用实施例1的培养方法，其中出芽培养基配方为：MS基本培养基+0.5mg/L6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
对照组与实验组的区别在于出芽培养基配方为：B5培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/LKT+0.1mg/L IBA；
实验结果：冀绿20号绿豆种子在不同出芽培养基的出芽情况见下表：
表2不同出芽培养基的出芽情况
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，将绿豆无菌苗的子叶节外植体放置于出芽培养基上诱导生成不定芽，继代培养一次，待不定芽长度大于3cm时，转接到生根培养基，最终得到再生苗；
所述出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
所述生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/LIBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8。
2.根据权利要求1所述的一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、无菌苗接种：将无菌绿豆种子接种于水琼脂培养基上培养，培养条件为：温度26±1℃、光照强度3000lx、光周期16小时光照/8小时黑暗；
S2、外植体制备：培养得到的无菌苗去掉子叶，子叶节部位上1～2mm切去真叶，下3～4mm切去下胚轴，留下的部位即为外植体；
S3、不定芽诱导：将外植体下胚轴端垂直向下插入出芽培养基中，在温度26±1℃、光照强度3000lx、光周期为16小时光照/8小时黑暗条件下培养14天，转接至新的出芽培养基中继代培养一次；所述出芽培养基的成分为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8；
S4、生根培养：待不定芽长度大于3cm，从外植体上切下不定芽，转移至生根培养基，得到再生苗；所述生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8。
3.根据权利要求2所述的一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，步骤S1中所述无菌绿豆种子是由绿豆种子经消毒、清洗、晾干得到。
4.根据权利要求3所述的一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，所述消毒为在无菌条件下，将绿豆种子先用75％的乙醇表面消毒0.5min，再用质量浓度为1％的NaClO溶液消毒15min，所述清洗为用灭菌蒸馏水冲洗。
5.根据权利要求2所述的一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，步骤S4中转移至生根培养基，得到再生苗，当再生苗基部生成3-5条主根且每条主根长度均大于3cm后，练苗3天，取出幼苗植株，洗净根部的培养基，移栽至营养钵中。
6.根据权利要求5所述的一种绿豆离体培养高效再生的方法，其特征在于，所述营养钵中营养基质为珍珠岩：草木灰体积比1：3的混合基质。
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