CN108419674A - 一种绿豆子叶节为外植体的丛生芽诱导方法 - Google Patents

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张勤雪
袁星星
陈景斌
林云
张红梅
陈华涛
崔晓艳
刘晓庆
顾和平
普拉给特宋塔
披拉沙斯乃文
陈新
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract

本发明公布了一种绿豆子叶节为外植体的丛生芽诱导方法，属于植物组织培养技术领域，该方法首先对绿豆种子进行灭菌处理，然后接种到种子萌发培养基中培养4天，以两边子叶节为外植体接种到丛生芽诱导培养基。培养基组成成分包括大量元素、微量元素、植物生长调节剂及其他添加物等。本发明外植体操作方便，丛生芽诱导率快，培养条件不受外界天气变化和病虫害的影响。

Description

一种绿豆子叶节为外植体的丛生芽诱导方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种植物外植体丛生芽诱导方法的改良。
背景技术
绿豆营养丰富，医食同源，是现代功能性食品开发的重要作物，也是普通民众获取高质量蛋白质的重要来源，其多种加工品是我国人民喜爱的传统美食。我国绿豆遗传研究相对滞后，新品种绿豆育种缓慢，急需加快技术研究进度。转基因作为绿豆研究和育种的重要方法之一，需要有一个高效的再生体系，而再生体系的建立，最为关键的是前期丛生芽的诱导步骤。虽然同为豆科的物种大豆在丛生芽诱导的研究有很大的突破，但同样的培养基对绿豆的诱导效果仍不理想。
因此，如何提高绿豆再生过程中丛生芽诱导的效率是突破绿豆遗传转化体系的关键。但目前相关报告并不多见。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物外植体丛生芽诱导方法的改良，该方法外植体操作方便，丛生芽诱导率快。
本发明采用以下技术方案：
一种绿豆丛生芽诱导方法，所述的绿豆丛生芽诱导方法包括以下步骤：
(1)种子筛选；
(2)灭菌消毒；
(4)丛生芽诱导：将制备的外植体，下胚轴向下，轻轻插入诱导培养基中，保持子叶节在培养基上方；
(5)芽增殖培养：生长10～15天后，选择愈伤组织生长较好的外植体，切除底部褐化的组织，移入新的芽增殖培养基；其中芽增殖培养基含有0.01-0.1mg/L的Vc；
所述的步骤除步骤(1)外，其余均采用无菌环境，步骤(2)、(4、(5))中绿豆在培养基上生长的步骤环境条件为光照强度1500～2000lx，光照时间16h/d，温度维持在25±2℃。
其中，所述的种子筛选优选包括：选择再生能力强的绿豆品种，对每个种子进行表面观察，选择表面光滑且没有破皮的绿豆种子。
所述的灭菌消毒优选包括：以步骤(1)选择的绿豆种子为材料，用乙醇消毒后，然后用0.1％HgCl消毒，无菌水冲洗；再用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种到pH为5.8～6.0的1/2MS培养基上生长。
所述的外植体优选保留部分下胚轴和很少量上胚轴的子叶结。
所述的诱导培养基优选添加BA 1mg/L+KT 1mg/L+IBA 0.05mg/L的1/2MS培养基，pH为5.8～6.0。
所述的芽增殖培养基优选添加BA 1mg/L+KT 1mg/L+IBA 0.01mg/L+Vc 0.02mg/L的1/2MS培养基，pH为5.8～6.0。
有益效果：
本发明提供了一种专用于绿豆的丛生芽诱导方法，通过选择子叶结作为外植体，外植体操作方便，配合特定配方的诱导培养基和芽增殖培养基，极大加快了丛生芽诱导率，且培养条件不受外界天气变化和病虫害的影响。
附图说明
图1是用于用于切外植体的绿豆无菌苗
图2是切好后的绿豆外植体
图3是绿豆外植体插入培养基
图4是长出丛生芽的绿豆外植体
具体实施方式
本发明实施例所用的试剂，如未特别说明，市售的均可实现本发明，所涉及的技术方案，如未特别说明，均可采用本领域的常规技术。
实施例1
1)种子筛选：选择绿豆品种苏绿2号，对当年新采收的每个种子进行表面观察，挑选光泽度较高，无病害表现的种子，用纸擦干净表面，选择表面光滑且没有破皮的绿豆种子进行下一步试验。
2)灭菌消毒：以苏绿2号绿豆品种种子为材料，首先对绿豆种子用乙醇消毒5分钟后，然后用0.1％HgCl浸泡消毒15分钟，无菌水冲洗3遍；再用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种到1/2MS培养基上生长。
3)外植体制备：生长4天后，挑选生长健壮，无菌的绿豆小苗(图1)，在超净工作台内用无菌手术刀切除子叶、根和叶片，保留部分下胚轴和很少量上胚轴的子叶结(图2)。
4)丛生芽诱导：选择1/2MS培养基，其中添加BA 1mg/L，KT 1mg/L和IBA 0.05mg/L，PH为5.8，培养基灭菌后装于培养皿中。将制备完成的外植体，下胚轴向下，轻轻插入培养基中，保持子叶节在培养基上方，每个培养皿插入5～7个外植体(图3)。
5)芽增殖培养：选择1/2MS培养基，其中添加BA 1mg/L，KT 1mg/L、IBA 0.01mg/L和Vc0.02mg/L，PH为5.8，培养基灭菌后装于培养皿中，作为芽增殖培养基(增殖效果比较见表1)。外植体在培养基中生长10～15天(图4)后，选择愈伤组织生长较好的外植体，切除底部褐化的组织，移入新的芽增殖培养基中。
表1三种增殖培养基激素配方对丛生芽诱导的影响

Claims (6)

1.一种绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的绿豆丛生芽诱导方法包括以下步骤：
(1)种子筛选；
(2)灭菌消毒；
(3)外植体制备：生长4天后，挑选生长健壮，无菌的绿豆小苗，在超净工作台内用无菌手术刀切除子叶、根和叶片，保留子叶结做为外植体；
(4)丛生芽诱导：将制备的外植体，下胚轴向下，轻轻插入诱导培养基中，保持子叶节在培养基上方；
(5)芽增殖培养：生长10～15天后，选择愈伤组织生长较好的外植体，切除底部褐化的组织，移入新的芽增殖培养基；其中芽增殖培养基含有0.01-0.1mg/L的Vc；
所述的步骤除步骤(1)外，其余均采用无菌环境，步骤(2)、(4、(5))中绿豆在培养基上生长的步骤环境条件为光照强度1500～2000lx，光照时间16h/d，温度维持在25±2℃。
2.根据权利要求1所述的绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的种子筛选包括：选择再生能力强的绿豆品种，对每个种子进行表面观察，选择表面光滑且没有破皮的绿豆种子。
3.根据权利要求1所述的绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的灭菌消毒包括：以步骤(1)选择的绿豆种子为材料，用乙醇消毒后，然后用0.1％HgCl消毒，无菌水冲洗；再用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种到pH为5.8～6.0的1/2MS培养基上生长。
4.根据权利要求1所述的绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的外植体为保留部分下胚轴和很少量上胚轴的子叶结。
5.根据权利要求4所述的绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的诱导培养基为添加BA 1mg/L+KT 1mg/L+IBA 0.05mg/L的1/2MS培养基，pH为5.8～6.0。
6.根据权利要求4所述的绿豆丛生芽诱导方法，其特征在于所述的芽增殖培养基为添加BA 1mg/L+KT 1mg/L+IBA 0.01mg/L+Vc 0.02mg/L的1/2MS培养基，pH为5.8～6.0。
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