CN110358791A - 绿豆遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种绿豆遗传转化方法，包括：以包含子叶节的胚轴节段作为外植体，农杆菌介导法对外植体进行侵染和共培养，侵染结束后，诱导再生转基因植株；其中侵染时，侵染液为含农杆菌、0.15～0.25mg/L 6‑BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB液体培养基，OD为0.5‑0.6；共培养时，共培养培养基为含0.15～0.25mg/L6‑BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB固体培养基。本发明建立了绿豆遗传转化技术体系，可用于绿豆的遗传改良、新种质的创新培育，为绿豆的功能基因验证和基因组编辑性状改良提供基础。

Description

绿豆遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物遗传转化，尤其涉及一种绿豆遗传转化方法。
背景技术
绿豆作为一种重要的豆类作物，其含有丰富的易消化蛋白、膳食纤维、维生素和矿物质。但目前绿豆产量一般维持在1000-1500公斤/公倾的较低水平，为了提高绿豆产量和抵御生物及非生物胁迫的能力，通过将外源目的基因按照需要在体外采用人工重组导入绿豆或直接对绿豆基因组进行精确编辑，进而补充和改进传统的杂交育种，不仅可大大缩短育种周期，更能够使育种方向更加明确。这些愿景的实现依赖快速、高效的绿豆转化技术，是绿豆转基因育种、基因编辑育种、基因克隆与功能研究的基础。
通过农杆菌介导的遗传转化系统被广泛应用于植物改良。但是遗传转化的成功与否与受体植物的基因型、农杆菌菌株、外植体选择、培养基配方及激素比例等多种因素存在关系，且关系复杂无明显规律。即使进化关系较近的植物之间，其遗传转化方法和条件也存在较大差异。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种绿豆遗传转化方法，成功建立了绿豆转化体系。
技术方案：本发明所述的绿豆遗传转化方法，包括：以包含子叶节的胚轴节段作为外植体，农杆菌介导法对外植体进行侵染和共培养，侵染结束后，诱导再生转基因植株；其中侵染时，侵染液为含农杆菌、0.15～0.25mg/L 6-BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB液体培养基，OD为0.5-0.6；共培养时，共培养培养基为含0.15～0.25mg/L6-BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB固体培养基。
本发明中采用含子叶节的胚轴节段作为外植体易形成丛生芽，而子叶为外植体不易形成。所述外植体取自绿豆种子接种于含TDZ的培养基所培养的绿豆幼苗。添加TDZ(噻苯隆)激素，有效促使绿豆胚轴膨大，显著降低了操作难度，优选的，TDZ的浓度为0.6～1.5mg/L，更优选为1mg/L。具体的，沿子叶着生部位以上1-2mm和以下3-4mm处横切，保留包含子叶节的胚轴节段作为外植体，转化效果好。
侵染液中含有一定量的6-BA可以增加侵染效率，促进植株再生，优选的，所述侵染液为含农杆菌、0.2mg/L 6-BA、100mg/L乙酰丁香酮的MSB液体培养基。侵染时，使外植体处于所述的侵染液中，20～24℃避光孵育15～40min，优选22℃避光孵育30min。
用于侵染的农杆菌菌株为EHA105，所述农杆菌菌株含具有目标外源基因的重组植物表达载体，其中基础质粒包括但不限于pCAMBIA3301-GFP、pBIN-GFP2，这些质粒可以从商业途径购买，也可以人工构建。
侵染结束后用共培养液冲洗外植体2-3次(避免农杆菌过多污染)后放置于共培养培养基，共培养基上最好放灭菌滤纸，将外植体置于滤纸上，防止农杆菌过度生长。共培养可使农杆菌充分侵染，并促进愈伤组织的形成；优选条件，共培养培养基中，6-BA浓度优选为0.2mg/L、乙酰丁香酮优选为100mg/L；所述共培养于20～24℃黑暗条件下共培养4～6天，优选22℃黑暗条件下共培养5天。
外植体共培养后，置于芽诱导培养基诱导不定芽，不定芽转到芽伸长培养基上培养后再进行生根培养，获得再生转基因植株。本发明对组织培养过程中所需培养基配方为适应绿豆遗传转化进行了优化，有效提高了愈伤组织形成和再分化，并有效避免愈伤组织褐化和玻璃化。
其中，芽诱导培养基组成包括：MSB固体培养基+6-BA 0.8～1.2mg/L+KT0.8～1.2mg/L+IBA 0.1～0.15mg/L+AC 0.8～1.2mg/L；优选的，芽诱导培养基组成包括：MSB+6-BA1mg/L+KT1mg/L+IBA0.1mg/L+AC1mg/L。活性炭(AC)可以减少植株的玻璃化。
芽伸长培养基组成包括：MSB固体培养基+BA0.2～0.25mg/L；优选的，芽伸长培养基组成包括：MSB+BA0.2mg/L。
生根培养的培养基包括：1/2MS固体培养基+IBA0.8～1.2mg/L；优选的，生根培养的培养基组成包括：1/2MS+IBA1mg/L。
显然的，在上述芽诱导培养基、芽伸长培养基、生根培养基中根据质粒、农杆菌的抗性添加相应的抗生素。
所述绿豆的品种包括冀绿2号、冀绿7号。
有益效果：
本发明以绿豆胚轴组织为转化受体，通过农杆菌介导进行遗传转化，成功建立的绿豆遗传转化体系，转化率可达2％，通过本发明建立的绿豆遗传转化技术体系，可用于绿豆的遗传改良、新种质的创新培育，也为绿豆功能基因组学研究提供了技术支撑。
附图说明
图1为本发明获得制备外植体的绿豆幼苗和正常生长幼苗对比；
图2为绿豆外植体；
图3为绿豆愈伤组织，部分开始分化成芽；
图4为绿豆愈伤组织分化为不定芽；
图5为不定芽GFP绿色荧光观察筛选；
图6为荧光幼苗生根；
图7为再生植株移栽；
图8为转基因植株的PCR鉴定；M：DNA Marker，1-3：荧光株系；4：质粒阳性对照；5：野生型株系阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
一种绿豆遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：挑选颗粒饱满，种皮光滑无裂缝瑕疵的绿豆冀绿2号种子大约100粒，置于无菌广口玻璃瓶中用75％乙醇(质量分数)浸泡灭菌2min，之后用质量分数0.1％HgCl溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3-4次；灭菌处理后的种子种植于含1mg/LTDZ的1/2MS培养基，在25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养4天(图1)。
(2)外植体制备：取步骤(1)中幼苗，用长鼻镊剥落种皮，并小心扯掉两片子叶，然后用手术刀沿子叶着生部位以上1-2mm处和以下3-4mm处横切，保留包含子叶节的胚轴节段作为外植体(图2)。
(3)农杆菌侵染菌液制备：将含有pBIN-GFP2质粒的EHA105农杆菌在添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养48h后挑取单菌落，接入到含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃220rpm摇48h。吸取2ml菌液加入到200ml新鲜的含上述相同抗生素的LB液体培养基中(1L锥形瓶)28℃220rpm，摇至OD0.6-0.8。离心收集菌体并用0.2mg/L 6-BA的MSB液体培养基悬浮，调节OD至0.5-0.6，添加乙酰丁香酮至100mg/L，即为侵染液，备用。
(4)农杆菌侵染和共培养：将步骤(2)制备好的外植体浸没于步骤(3)制备的侵染液中，在70rpm，22℃条件下避光孵育30min；侵染结束后，倒掉菌液，用共培养液(即共培养培养基除去琼脂)润洗2-3次后将外植体转到灭菌滤纸上吸走多余的液体；之后将外植体均匀的放置于共培养基上(共培养基上放1张灭菌滤纸，防止农杆菌过度生长，外植体置于共培养基的滤纸上)，在黑暗、25℃共培养条件下培养5天；共培养培养基配方：MSB固体培养基+BA0.2mg/L+AS100mg/L。
(5)芽诱导：将完成共培养的外植体转移到芽诱导培养基上继续培养(25℃，16h光照/8小时黑暗)，每两周继代一次，期间利用变倍宏观显微镜观察不定芽是否具有GFP荧光，将具有荧光的不定芽转移到伸长培养基中继续培养(25℃，16h光照/8小时黑暗)，每两周继代一次，至绿豆幼苗长度达到3-5cm，有茎，顶端有生长点(图3、图4、图5)；其中芽诱导培养基配方：MSB固体培养基+BA1mg/L+KT1mg/L+IBA0.1mg/L+AC1mg/L+carb500mg/L；伸长培养基配方：MSB固体培养基+BA0.2mg/L+carb500mg/L；carb为抗生素头孢。
(6)生根培养：将步骤(5)中具有GFP荧光的绿豆幼苗取出，切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行生根(25℃，16h光照/8小时黑暗)，至绿豆幼苗至少长出3根根系(图6)；其中生根培养基：1/2MS固体培养基+IBA1mg/L+carb500mg/L。
(7)移栽：待转基因苗的根长到3-5cm后，将根部培养基划碎，加入适量无菌水进行炼苗(25℃，16h光照/8小时黑暗)，并将瓶口揭开；移栽时，先用清水洗去根部培养基，以免移栽后根部细菌大量繁殖污染植株；移栽完成后，用喷壶向塑料瓶内喷水以保持移栽苗生长环境的湿润，将处理好的豆苗置于较暗光线下恢复1-2天，再移至正常光线下生长(图7)。
(8)转基因植株抗性及PCR检测：选择转化苗的新叶，涂抹筛选剂卡那霉素，观察叶片表型；同时剪取新叶提取DNA，利用载体上特异引物进行PCR检测，筛选阳性转基因幼苗(图8)。
图1显示了本发明绿豆种子种植于含1mg/LTDZ的1/2MS固体培养基所获得的幼苗状况，以不添加TDZ的1/2MS培养基作为对照，可见，添加适宜浓度的TDZ，可以有效促使绿豆胚轴膨大，降低了后续操作难度。
PCR和荧光观察的结果显示农杆菌质粒中GFP基因在绿豆再生植株中稳定表达。本实施例不定芽形成率为36％，遗传转化率为2％。

Claims (9)

1.一种绿豆遗传转化方法，其特征在于，包括：以包含子叶节的胚轴节段作为外植体，农杆菌介导法对外植体进行侵染和共培养，侵染结束后，诱导再生转基因植株；其中侵染时，侵染液为含农杆菌、0.15～0.25mg/L 6-BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB液体培养基，OD为0.5-0.6；共培养时，共培养培养基为含0.15～0.25mg/L6-BA、100～200mg/L乙酰丁香酮的MSB固体培养基。
2.根据权利要求1所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，所述外植体取自绿豆种子接种于含TDZ的培养基所培养的绿豆幼苗。
3.根据权利要求2所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，TDZ的浓度为0.6～1.5mg/L。
4.根据权利要求1所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，侵染时，使外植体处于所述的侵染液中，20～24℃避光孵育15～40min。
5.根据权利要求1所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，所述共培养于20～24℃黑暗条件下共培养4～6天。
6.根据权利要求1所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，外植体共培养后，置于芽诱导培养基诱导不定芽，不定芽转到芽伸长培养基上培养后再进行生根培养，获得再生转基因植株。
7.根据权利要求6所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，芽诱导培养基组成包括：MSB固体培养基+6-BA0.8～1.2mg/L+KT0.8～1.2mg/L+IBA0.1～0.15mg/L+AC0.8～1.2mg/L。
8.根据权利要求6所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，芽伸长培养基组成包括：MSB固体培养基+BA0.2～0.25mg/L。
9.根据权利要求6所述的绿豆遗传转化方法，其特征在于，生根培养的培养基组成包括：1/2MS固体培养基+IBA0.8～1.2mg/L。
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