CN109315290A - 一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法 - Google Patents

一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法 Download PDF

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向海英
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张建铎
李雪梅
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Abstract

本发明是一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，通过种子消毒、种子培养、烟草外植体预培养、发根农杆菌培养、侵染与共培养、清洗与发状根培养、发状根愈伤组织培养、分化芽培养、再生植株生根培养等步骤完成。本发明针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。

Description

一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地说是一种发根农杆菌诱导烟草品种红花大金元外植体产生毛状根，并完成植株再生的方法。
背景技术
发根农杆菌是根瘤菌科（Rhizobiaceae）农杆菌属（agrobacterium）的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ri质粒是一种具有侵染性的大质粒，位于发根农杆菌染色体外。在实验室条件下，发根农杆菌可以侵染人为划伤的外植体伤口，以使Ri质粒上的T-DNA中含有的rolB基因能够插入植物细胞核特定的基因当中，在宿主细胞内借助植物本身的DNA复制完成自身的复制与表达，合成特定的蛋白，从而诱导植株产生发状根。发根农杆菌诱导植物细胞产生发状根不仅能在无外源激素的培养基上快速自主生长，而且具有易通过组织培养途径获得再生植株等优势。
ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC（美国模式培养物集存库/American typeculture collection），为发根农杆菌原始菌株（wild strain），含有pRi15834农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（禾本科、豆科、烟草等）。Ar.Qual发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、番茄、柑橘等），同时具有链霉素、氯霉素抗性。MSU440发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、茶树、青蒿等），同时具有链霉素抗性。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi12659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（葫芦科、豆科、茄科等），同时具有链霉素抗性。
目前已有许多利用发根农杆菌诱导或转化烟草的相关研究，然而，针对不同品种烟草的培养条件和步骤仍需探索改进，筛选合适的培养基和培养条件能有效提高获得再生植株的效率。
发明内容
本发明的目的是公开一种发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用不同发根农杆菌菌种诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法，包括如下步骤：
步骤（1），红花大金元种子消毒；
步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；
步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；
步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用，
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；
步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；
步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基；
步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；
步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d。
进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1%AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
进一步地，步骤（2）、（3）、（4）、（5）中，MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，固体培养基中添加4g/L琼脂，pH值为5.7。
进一步地，步骤（4）中YEB培养基的制备方法如下：牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，固体培养基添加15g/L琼脂；可选用的发根农杆菌菌种有：ATCC15834、Ar.Qual、MSU440和K599，用于培养菌种Ar.Qual、K599和MSU440的YEB培养基需添加链霉素50mg/L。
进一步地，步骤（6）、（8）、（9）中的MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，4g/L琼脂，pH值为5.7，添加羧苄青霉素250mg/L。
进一步地，步骤（7）中的MS培养基的制备方法如下：所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时，添加(A)、萘乙酸（NAA）0.5mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：4的培养基；或添加（B）、萘乙酸（NAA）0.2mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：10的培养基。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例是基于发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根并植株再生的方法，包括如下步骤：
步骤（1），红花大金元种子消毒：取饱满的红花大金元种子，在超近工作台中，用75%酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1%AgNO3溶液消毒10min，水清洗4-5次，最后将种子在灭菌滤纸上吸干水分后进行接种，其中使用的水及配制溶液的水均为高压灭菌的超纯水；
步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在500mL培养瓶中倒入100mL培养基，冷却后备用；
步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，25℃，黑暗培养3d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（4），发根农杆菌菌种ATCC15834培养，将菌种ATCC15834发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600=0.6-0.8，供感染使用。所述YEB培养基为牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后备用；
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）ATCC15834悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的灭菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时添加250mg/L羧苄青霉素（过滤灭菌），摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时，添加(A)、萘乙酸（NAA）0.5mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：4的培养基；以上激素和抗生素均过滤灭菌后使用；
步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养10d左右，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时添加250mg/L羧苄青霉素（过滤灭菌），摇匀后在500mL培养皿中倒入100mL培养基，冷却后备用；
步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d即可生根。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时添加250mg/L羧苄青霉素（过滤灭菌），摇匀后在250mL培养皿中倒入50mL培养基，冷却后备用。
本实施例中，ATCC15834菌种侵染叶盘发根率为92.96%（14d），植株再生率为58.33%（激素比1:4），再生植株生根率可达95%以上。
实施例2
本实施例是基于发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根并植株再生的方法，包括如下步骤：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），发根农杆菌菌种Ar.Qual培养，将菌种Ar.Qual发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用。所述YEB培养基为牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，121℃灭菌15min，灭菌冷却到不烫手时添加链霉素50mg/L（过滤灭菌），在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后添加链霉素50mg/L（过滤灭菌）备用；
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）Ar.Qual悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（6）-（9）与实施例1相同。
本实施例中，Ar.Qual菌种侵染叶盘发根率为89.19%（14d），植株再生率为54.29%（激素比1:4），再生植株生根率可达95%以上。
实施例3
本实施例是基于发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根并植株再生的方法，包括如下步骤：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），发根农杆菌菌种K599培养，将菌种K599发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用。所述YEB培养基为牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O ）0.5g/L，琼脂15g/L，121℃灭菌15min，灭菌冷却到不烫手时添加链霉素50mg/L（过滤灭菌），在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后添加链霉素50mg/L（过滤灭菌）备用；
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）K599悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（6）、（8）（9）与实施例1相同；
步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时，添加(B)、萘乙酸（NAA）0.2mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：10的培养基；以上激素和抗生素均过滤灭菌后使用。
本实施例中，K599菌种侵染叶盘发根率为47.46%（14d），植株再生率为88%（激素比1:10），再生植株生根率可达95%以上。
实施例4
本实施例是基于发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根并植株再生的方法，包括如下步骤：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），发根农杆菌菌种MSU440培养，将菌种MSU440发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用。所述YEB培养基为牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，121℃灭菌15min，灭菌冷却到不烫手时添加链霉素50mg/L（过滤灭菌），在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后添加链霉素50mg/L（过滤灭菌）备用；
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）MSU440悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d。所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用；
步骤（6）-（9）与实施例3相同。
本实施例中，MSU440菌种侵染叶盘发根率为89.71%（14d），植株再生率为61.9%（激素比1:10），再生植株生根率可达95%以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1），红花大金元种子消毒；
步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；
步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；
步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用；
步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；
步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；
步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基；
步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；
步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d。
2.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1%AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
3.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（2）、（3）、（4）、（5）中，MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，固体培养基中添加4g/L琼脂，pH值为5.7。
4.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（4）中YEB培养基的制备方法如下：牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，固体培养基添加15g/L琼脂；用于培养菌种Ar.Qual、K599和MSU440的YEB培养基需添加链霉素50mg/L。
5.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（4）中MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后添加链霉素50mg/L，过滤灭菌，备用。
6.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（6）、（8）、（9）中的MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，4g/L琼脂，pH值为5.7，添加羧苄青霉素250mg/L。
7.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（7）中的MS培养基的制备方法如下：所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时，添加(A)、萘乙酸（NAA）0.5mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：4的培养基；或添加（B）、萘乙酸（NAA）0.2mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：10的培养基。
8.根据权利要求1所述的诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：步骤（4）中可选用的发根农杆菌菌种为：ATCC15834、Ar.Qual、MSU440和K599。
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