CN102599052B

CN102599052B - 一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用

Info

Publication number: CN102599052B
Application number: CN 201110408111
Authority: CN
Inventors: 曹慧颖; 夏润玺; 张立军; 吕淑霞; 崔振海; 张宁; 张少斌
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102599052A

Abstract

本发明属于生物学和生物技术领域，公开了一种植物原位再生及农杆菌转化的方法。本方法是将农杆菌涂抹在植物砧木伤口上，再将植物离体组织在培养基上诱导产生的愈伤组织作为接穗，劈接法嫁接到砧木上。砧木伤口细胞在外源愈伤组织的诱导下，可以实现原位器官再生，从而得到转基因再生芽。与传统的结合组培的植物遗传转化相比，本发明避免了逐一基因型摸索组培条件，为植物的遗传转化提供了新的技术平台，同时本发明也建立了一种新的植物再生体系，为植物发育生物学研究提供了研究系统。

Description

一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用

技术领域

本发明属于生物学和生物技术领域，涉及了一种植物细胞原位器官再生结合农杆菌侵染的遗传转化方法。

背景技术

植物离体器官再生（organ regeneration）是在细胞全能性的理论基础上建立的，是把植物的器官、组织以至单个细胞，在人工控制的无菌条件下培养，使其生长、分化成完整植株的过程。这种组培技术经过上百年的完善与发展，已实现了上千种植物的培养，在植物无性系的快速繁殖、无病毒种苗培育、新品种的选育、人工种子和种质保存、药用植物和次生物质的工业化生产等方面已广泛应用。

在植物基因工程研究领域，植物离体器官再生也是一项重要的实验技术。植物基因工程需要将目的基因转化进入植物细胞，这个过程可以通过农杆菌介导法、基因枪法等操作完成，但无论哪一种方法，都主要依靠转化细胞的再生，即组织培养过程获得转基因植株。结合组培的遗传转化途径有很多优点，如重复性较好，基本不受季节限制，适应性较广，转化率较高等。但是这种转化途径也有其局限性，主要是转化细胞的再生受基因型的影响较大，同一物种的某些基因型易于组培，而另外一些基因型很难组培成功。况且有些物种，目前还难于进行组织培养。因此植物再生体系是限制植物遗传转化进一步发展应用的瓶颈。

解决这一植物遗传转化发展的瓶颈，可以有两个途径。一个途径是进行大量的正交试验，逐一物种摸索组培条件。但由于组培再生涉及培养基的种类、植物生长调节剂的种类和浓度、温度、光照等多种复杂条件，即使是大豆这样重要的经济作物，经过多年的探索仍是世界公认的组培难，因此这个途径短时间内很难有所突破。另一个途径就是开发全新的植物再生体系，使植物再生不再依赖组织培养。

发明内容

为解决上述问题,本发明的目的在于提供一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用,，采用农杆菌原位转化植物，避免了细胞再生的组培过程，应用本方法可以快速建立各种植物的遗传转化体系。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的植物原位再生的方法，其特征是：

A、接穗的获得

选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于25℃光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；

B、嫁接

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接；

C、砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

本发明提供的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，特征是：

A、接穗的获得

B、农杆菌的准备

将农杆菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固体培养基上划线培养，28℃培养72小时；在平板上挑取单克隆，接种到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液体YEB培养基，28℃，250rpm培养1-2d直至OD600为0.6；按照1:100的稀释比例将上述少量培养液继续扩繁培养到OD600为0.5；

C、农杆菌侵染

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口，在伤口上涂抹农杆菌菌液，进行植物侵染；

D、嫁接

将接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入侵染过的砧木中嫁接，诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽；

E、转化的砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导侵染过的砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

上述农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101或G58，优选EHA105；包含的质粒为PBI121，PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。

本发明提供的一种植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，其特征是：用于原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑树、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷、油菜、黄瓜和拟南芥。

本发明的积极效果：通过非组培的方法，实现了植物的原位再生，并使之与农杆菌介导法相结合实现了植物的遗传转化，避免了传统组培方法的繁琐组培条件，为实现各种植物快速、工厂化的再生与转化提供了一条捷径。

附图说明

图1 为番茄辽园多丽外植体诱导的愈伤组织。

图2 为愈伤组织接穗嫁接于番茄砧木。

图3 为辽园多丽砧木伤口生长愈伤组织。

图4 为辽园多丽砧木伤口的再生芽。

图5 为盆栽番茄砧木伤口的再生芽。

图6 为部分再生芽的PCR检测结果。

图7 为部分再生芽的southern blot结果。

具体实施方式

实施例1：植物原位再生的方法

步骤1、接穗的获得

选取番茄品种辽园多丽（Solanum lycopersicum L，购自辽宁园艺种苗有限公司）作为试验材料。取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，用洗衣粉水浸泡1h，冲洗干净；于超净工作台上用75%酒精浸泡30s；用10%的NaClO溶液消毒20 min，再用无菌水冲洗5次；接种于MS培养基中，MS培养基配方为通用配方（见表1），于25℃光照培养箱中日光照16h，培养7天获得无菌苗。

步骤2、嫁接

取长有6-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接。令二者紧密贴合，用塑料膜覆盖嫁接部位并紧密包扎。去除所有腋芽，以后萌发的腋芽也要及时去除。嫁接苗置于温室中，日温25℃/夜温18℃，进行正常的苗期管理。避免强光直射。嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。再生芽大于1.0 cm后，方可逐渐去除包膜。

实施例2：植物原位再生的方法在遗传转化中的应用实例一

步骤1、接穗的获得

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切0.5cm的小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中日光照16h诱导愈伤组织。30d左右获得淡绿色、菜花状、结构致密的新鲜愈伤组织作为接穗（图1）。

步骤2、农杆菌的准备

农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101或G58，优选EHA105。农杆菌菌株采用EHA105，包含的质粒为PBI121。菌株及质粒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPTⅡ，由CAMV 35S启动子驱动。将-70℃保存的农杆菌，在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固体培养基（标准配方：牛肉浸膏， 5g/L；酵母膏，1g/L；蛋白胨，5g/L；蔗糖，5g/L；MgSO4.7H₂O，0.04g/L；琼脂，1.5%；pH 7.4）上划线培养，28℃培养72小时。在平板上挑取单克隆，接种到2ml液体YEB培养基（含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素），28℃，250rpm培养1-2d直至OD600为0.6。按照1:100的稀释比例将上述少量培养液继续扩繁培养到OD600为0.5。农杆菌含有携带报告基因和/或外源基因的质粒。所述的报告基因为NPTⅡ基因。

步骤3、农杆菌侵染

取长有6-10片叶子的健壮辽园多丽作为砧木。在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。用无菌棉棒在伤口上涂抹步骤2准备好的农杆菌菌液，进行植物侵染。

步骤4、嫁接

将诱导培养基上获得的辽园多丽新鲜愈伤在无菌条件下切成楔形作为接穗，插入侵染过的辽园多丽砧木中嫁接（图2），令二者紧密贴合，用塑料膜覆盖嫁接部位并紧密包扎。去除所有腋芽，以后萌发的腋芽也要及时去除。嫁接苗置于温室中，日温25℃/夜温18℃，进行正常的苗期管理。避免强光直射。经过20-30d可见砧木伤口表面长出大量紫色瘤状的愈伤组织（图3），随后萌发丛生芽（图4）。再生芽大于1.0 cm后，方可逐渐去除包膜。通风过急将导致再生苗失水干枯。

步骤5、再生芽的卡那霉素检测

对砧木原位再生芽叶片进行卡那霉素抗性筛选，用毛笔将500ppm的卡那霉素溶液涂抹在再生芽的叶片上， 3d后叶片没有发黄，可初步确定为转基因芽，予以保留。摘除叶片发黄的芽。15株原位再生番茄的再生芽中，共保留了27个抗性芽。

步骤6、再生芽的PCR检测

随机取4片再生叶片，CTAB法提取总DNA，用35s启动子的引物进行检测，上游引物为GCTCCTACAAATGCCATCA，下游引物为GATAGTGGGATTGTGCGTCA。PCR反应程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

PCR检测结果如图6，其中1-4为本实施例检测样品，5为未转化辽园多丽的阴性对照，12为质粒阳性对照，13为DNA maker。4个检测样本都扩增出194bp条带，可初步说明本发明的方法可以实现外源基因的转化。

步骤7、再生芽的Southern 杂交检测

为进一步确证PCR检测结果的可靠性，以质粒pBI121为模板，用CAMV 35s的引物进行PCR扩增，制备DIG标记的探针。提取PCR检测呈阳性再生芽叶片

,HindⅢ酶切进行Southern杂交分析。常规试剂购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DIG标记试剂盒PCR DIG Probe Synthesis Kit购于Roche公司。

Southern 杂交结果见图7。其中1、12是质粒对照，7是未转化植物的对照，8-11是PCR检测结果呈阳性的样品。4个检测样品全部出现杂交条带，说明外源基因已经整合进入番茄基因组，本方法可以实现番茄的遗传转化。

本发明提供的农杆菌转化方法用于非组培的原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑树、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷、油菜、黄瓜和拟南芥。

实施例3：植物原位再生的方法在遗传转化中的应用实例二

步骤1的接穗的获得和步骤2的农杆菌的准备均同实施例2。

步骤3：农杆菌侵染

取长有5-6片叶子的健壮盆栽番茄作为砧木。在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。用无菌棉棒在伤口上涂抹步骤2准备好的农杆菌菌液，进行植物侵染。

步骤4：嫁接

将诱导培养基上获得的辽园多丽新鲜愈伤在无菌条件下切成楔形作为接穗，插入侵染过的盆栽番茄砧木中嫁接（图2），令二者紧密贴合，用塑料膜覆盖嫁接部位并紧密包扎。去除所有腋芽，以后萌发的腋芽也要及时去除。嫁接苗置于温室中，日温25℃/夜温18℃，进行正常的苗期管理。避免强光直射。经过20-30d可见砧木伤口分化出丛生芽（图5）。再生芽大于1.0 cm后，方可逐渐去除包膜。通风过急将导致再生苗失水干枯。

步骤5：再生芽的卡那霉素检测

对砧木原位再生芽叶片进行卡那霉素抗性筛选，用毛笔将500ppm的卡那霉素溶液涂抹在再生芽的叶片上，3d后叶片没有发黄，可初步确定为转基因芽，予以保留。摘除叶片发黄的芽。16株原位再生番茄的再生芽中，共保留了21个抗性芽。

步骤6 ：再生芽的PCR检测

随机取5片再生叶片，CTAB法提取总DNA，用35s启动子的引物进行检测，上游引物为GCTCCTACAAATGCCATCA，下游引物为GATAGTGGGATTGTGCGTCA。PCR反应程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

PCR检测结果如图6，其中6-10为检测样品，11为未转化番茄的阴性对照，12为质粒阳性对照，13为DNA maker。5个检测样本都扩增出了194bp条带，可初步鉴定为转化芽。

步骤7：再生芽的Southern 杂交检测

为进一步确证PCR检测结果的可靠性，以质粒pBI121为模板，用CAMV 35s的引物进行PCR扩增，制备DIG标记的探针。提取5个PCR检测呈阳性再生芽叶片

Southern 杂交结果见图7。其中1、12是质粒对照，7是未转化植物的对照，其余2-6是PCR检测结果呈阳性的样品。鉴定的5个样品中，都出现杂交条带，说明外源基因已经整合进入番茄基因组，本方法可以实现番茄的遗传转化。

Claims

1.一种植物原位再生的方法，其特征是：

A、接穗的获得

B、嫁接

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口,将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接；

C、砧木原位再生

2.一种如权利要求1所述的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，特征是：

A、接穗的获得

B、农杆菌的准备

C、农杆菌侵染

D、嫁接

将接穗切成楔形，插入侵染过的砧木中嫁接；

E、转化的砧木原位再生

嫁接后，接穗诱导侵染过的砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

3.根据权利要求2所述的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，其特征是：农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101；包含的质粒为PBI121，PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。