CN101260410B - 一种用农杆菌生产瓜类转基因植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用农杆菌生产瓜类转基因植物的方法，它包括：让农杆菌在10-30℃下与瓜类植物外植体侵染培养5-30分钟。在一个优选的实施方式中，侵染温度为10-15℃之间，培养时间为10-15分钟。利用该方法可以有效防止在后续培养中农杆菌对植物外植体所造成的污染，缩短获得转基因植物的周期，提高获得转基因植物的几率，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于植物转基因领域，具体的讲，就是在用农杆菌侵染瓜类作物的外植体的时候如何防止在以后培养过程中农杆菌菌株污染这些外植体的方法。
背景技术
用农杆菌菌株在一定条件下侵染受伤植物组织，通过改造的农杆菌菌株能把自身的T-DNA或其它外源基因插入到目标植物组织中的基因组中，从而产生新的再生植株，这项技术在植物基因工程中被大量运用。但是，用农杆菌菌株和植物组织共培养后，必然要经过一段时间的培养而分化出愈伤组织及转基因小苗，在浸染后的抗性芽筛选培养过程中，农杆菌污染是影响植物基因转化成功率的一个重要方面。农杆菌污染不仅影响植物组织的生长，甚至导致抗性转基因苗的死亡，同时不断的继代培养也增加工作量，加剧了真菌污染的机会。本发明提供一种新的方法，可以有效防止或减少在以后农杆菌菌株和植物组织共培养中造成对植物组织的污染而使转基因获得成功。
发明内容
为了解决现有的技术问题，本发明提供一种新的方法，可以减少农杆菌在共培养或侵染培养后的污染，从而大大提高转化效率和成功率。
本发明提供的方法包括让农杆菌在10-30℃下与瓜类植物外植体侵染培养5-30分钟后再进行共培养和分化培养。
在一个优选的实施方式中，农杆菌与瓜类的子叶侵染培养的温度为10-20℃，时间为10-15分钟。在此温度下的让农杆菌侵染瓜类植物的子叶可以大大降低对外植体的污染，提高转化效率，增加成活率。较优的，侵染培养的温度为10-15℃。
在一个优选的实施方式中，植物组织为西瓜子叶，或部分子叶组织，这些子叶最好是先经过一段时间的预培养，然后再把带有伤口的子叶与农杆菌一起进行侵染培养。较优选的，农杆菌的浓度为OD＝0.5-0.8，较优的，农杆菌的浓度为OD＝0.5。
在一个优选的实施方式中，侵染培养的时间为10-15分钟，农杆菌为悬浮状溶液，与西瓜子叶或部分子叶处于运动状态中，在进行侵染培养后，除去子叶表面附着的农杆菌菌液。除去的方法可以使用滤纸吸干表面的液体。
农杆菌是产生转基因植物有效的载体工具之一，通过增加或减少一些基因片断构建不同功能的质粒，并把质粒转化到农杆菌中去。一般本领域内技术人员都可以根据不同的要求来构建含有特殊基因片段的农杆菌菌株。许多构建成功的质粒已经商品化或在学术交流中无偿通用。关于如何把质粒转化到农杆菌中去以及如何构建质粒不是本发明的重点，该技术为本领域一般技术人员公知的技术。外植体是指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官，可以是子叶，根，花等等。
有益效果：本发明所提供的方法可以有效减少农杆菌对瓜类植物外植体在侵染后培养过程中的污染，从而减少外外植体在后续培养或转化过程的死亡，增加获得转基因植物的机会，降低生产成本，提高转化效率。
附图说明
图1，本发明实验所用农杆菌菌株EHA105所含双元载体PBI121质粒的结构。
具体实施方式
实验
为了进一步说明本发明的效果和实施方式，现以实验加以说明。这些具体的实施例子仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。
实验一：用农杆菌侵染西瓜子叶(10℃)
一，材料
培养基配方：按照下表配置MS基本固体培养基(表一)。
MS基本液体培养基。与固体培养基相比，液体培养基不含有琼脂。
YEB基本培养基的准备。
分别称取牛肉浸膏(Beef extract)5g，酵母提取物(Yeast extract)1g，多聚蛋白胨(Polypeptone)5g，蔗糖5g，琼脂5g，加水定容至1000mL，调pH至7.2，灭菌后待用。使用时再加1M MgSO4·7H2O 2mL/L。
西瓜品种：早佳
农杆菌菌株：EHA105
如图1所示为本实验所使用的农杆菌菌株EHA105，它含有双元载体PBI121质粒，包含植物抗性选择标记新霉素磷酸转移酶基因Npt II，和报告基因β-葡糖苷(gusA)。
二，方法
1)西瓜种子消毒并培养无菌苗
取籽粒饱满的种子去壳后用70％的酒精消毒1min，用无菌水洗3次，再用20％的次氯酸钠消毒10-15min，无菌水洗3次，然后在无菌水里25℃振荡1-2h。消毒后的种子在MS(蔗糖的浓度为2％)培养基上25℃黑暗培养2-3天，待90％露白后，放入16/8光照/黑暗2000lx的光照培养箱培养2天左右直到子叶变成淡绿色。
2)预培养(启动培养)
取出无菌苗切取其子叶，切除小部分叶顶，子叶较大时也可切除子叶叶缘，制造伤口，然后沿子叶柄纵切成两半，用刀尖在叶片上制造适量伤口，叶背朝下放在预培养培养基(MS+6-BA 1.0mg/L)上黑暗培养2天，叶片变黄绿色，柄部及伤口处膨大时，准备待用。
3)农杆菌的培养
-70℃冷冻保存的农杆菌EHA105∷PBI121活化后，在试管中加入含有50mg/L卡那霉素(Km)，50mg/L链霉素的YEB培养基5ml，28℃进行少量摇菌，至OD600＝0.8-1.0，然后吸取1ml菌液加入不含抗生素的YEB培养基上大量培养至OD600＝0.5。取10ml的菌液1000rpm离心10min，弃上清，用液体MS培养基(除了无琼脂外，其它配方与表一的MS配方相同，)清洗沉淀2次，再用等体积的液体MS培养基悬浮沉淀，加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为200μg/L。待用。
4)转化步骤
侵染培养：预培养后外植体与含有AS的农杆菌悬浮液混合，在摇床上(转速为120r/min)10℃振荡培养10min，弃多余农杆菌，用无菌滤纸吸干外植体上多余菌液，
共培养：然后放入固体共培养培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+AS 200μg/L)，28℃黑暗培养2-3天，然后转入芽筛选培养基(MS+BA 3.0mg/L+IAA 0.1mg/L+Km 100mg/L)诱导抗性丛芽。植物生长调节剂：6-BA(6-苄氨基嘌呤)，IAA(3-吲哚乙酸)
5)抗性丛芽和生根
把经过共培养的外植体放入芽筛选培养基中，25℃培养16/8光照/黑暗2000lx。培养2周后继代培养，每继代一次减少培养基中6-BA含量1.0mg/L，减少芽的玻璃化，并统计产生芽的个数。产生多个小芽后可转入芽生长培养基中(MS+BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+Km 100mg/L)，促进芽的生长。当芽长约1-3cm时，从基部切下1-3个芽，基部插入生根培养基诱导生根(1/2MS+IAA 0.4mg/L)。
西瓜子叶外植体转入抗性芽筛选培养基后1-2d开始观察农杆菌的污染情况。污染的外植体周围逐渐长出一圈浑浊的细菌圈。
实验二，与实验一相比，除了转化步骤中，摇床上培养的温度为15℃之外，所用子叶个数不相同外，其他条件都相同。
实验三，与实验一相比，除了转化步骤中，摇床上侵染培养的温度为20℃之外，所用子叶个数不相同外，其他条件都相同。
实验四，与实验一相比，除了转化步骤中，摇床上侵染培养的温度为25℃之外，所用子叶个数不相同外，其他条件都相同。
实验五，与实验一相比，除了转化步骤中，摇床上侵染培养的温度为30℃之外，所用子叶个数不相同外，其他条件都相同。
实验结果
| 侵染温度(℃) | 子叶个数 | 污染个数 | 转化率(％) | 污染率(％) | |
| 实验一 | 10 | 120 | 0 | 0.8 | 0 |
| 实验二 | 15 | 114 | 2 | 8.7 | 1.7 |
| 实验三 | 20 | 120 | 23 | 5 | 19 |
| 实验四 | 25 | 116 | 32 | 4.3 | 27.6 |
| 实验五 | 30 | 121 | 45 | 1.6 | 37.2 |
实验结论
从上表可以看出，随着侵染温度的升高，污染率逐渐增高。侵染温度从10升高到30℃，污染率从0增加到37.2％。但是转化率却在15℃的时候最高，同时污染率比较底。所以，在本实验中，侵染温度保持在10-15℃之间，可以有效防止农杆菌污染西瓜子叶，同时保持较高的转化率。实验六：用农杆菌侵染甜瓜子叶(10℃)。与实验一相比，除了所用的材料为甜瓜外，所用子叶个数不相同外，其它的条件都相同。
实验七：与实验六相比，除了在侵染培养中温度为15℃外，所用子叶个数不相同外，其它条件都相同。
实验八：与实验六相比，除了在侵染培养中温度为20℃外，所用子叶个数不相同外，其它条件都相同。
实验九：与实验六相比，除了在侵染培养中温度为25℃外，所用子叶个数不相同外，其它条件都相同。
实验十：与实验六相比，除了在侵染培养中温度为30℃外，所用子叶个数不相同外，其它条件都相同。
实验结果
| 侵染温度(℃) | 子叶个数 | 污染个数 | 转化率(％) | 污染率(％) | |
| 实验六 | 10 | 125 | 2 | 0.8 | 1.6 |
| 实验七 | 15 | 119 | 3 | 9.7 | 2.5 |
| 实验八 | 20 | 121 | 17 | 6.2 | 14 |
| 实验九 | 25 | 120 | 42 | 3.3 | 35 |
| 实验十 | 30 | 121 | 55 | 1.5 | 45.4 |
本实验六到十所用的甜瓜种子来源于市场购买的晴网品种。
实验结论
从上表可以看出，随着侵染温度的升高，污染率逐渐增高。侵染温度从10升高到30℃，污染率从1.6增加到45.4％。但是转化率却在15℃的时候最高，同时污染率比较底。所以，在本实验中，侵染温度保持在10-15℃之间，可以有效防止农杆菌污染西瓜子叶，同时保持较高的转化率。
Claims (8)
1.一种运用在农杆菌生产瓜类转基因植物的方法，其特征在于，它包括：让农杆菌在10-15℃下与瓜类植物外植体侵染培养5-30分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的瓜类植物外植体为西瓜子叶或甜瓜子叶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌的浓度为OD＝0.5-0.8。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括侵染培养后的共培养。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括在侵染培养后除去外植体表面多余的农杆菌。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的侵染培养的时间为10-15分钟。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌处于悬浮状态，并且与所述的瓜类植物外植体处于运动状态。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的西瓜或甜瓜子叶在被农杆菌侵染前先经过预培养。
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