CN1125878C - 一种建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种建立玉米转基因受体体系的方法及应用。将玉米茎尖接种在附加不同激素组合的诱导培养基上，诱导茎尖培养物直接产生丛生芽或丛生芽组织块。取继代培养后处于旺盛生长期的丛生芽和丛生芽组织块为受体，采用农杆菌介导法、基因枪轰击法等将外源基因转入培养细胞，经过恢复、筛选等步骤获得转基因植株。本发明能从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且频率高，再生植株性状变异小。

Description

一种建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用，属于农业生物技术领域或植物基因工程领域。

(二)背景技术

玉米是重要的粮食兼饲料作物，通过遗传工程技术改良玉米具有重大的意义。采用转基因技术培育具有特异性状的优良玉米的工作已取得很大进展，转基因抗虫玉米也在北美和拉丁美洲大面积种植，但玉米基因工程育种的效率仍然很低，转基因技术及受体体系仍待改进。

国内外学者已用多种遗传转化技术获得了玉米转基因植株，但主要工作集中在以原生质体为受体的遗传转化、基因枪轰击法和以农杆菌为中介的遗传转化方面，部分技术已达到成熟。

80年代中后期，随着玉米原生质体培养再生植株的成功，以原生质体为受体的遗传转化工作蓬勃发展。到80年代底和90年代初，用电激法和PEG(聚乙二醇)诱导法分别获得了玉米转基因植株，用阳离子诱导法将外源基因转入玉米原生质体的工作也取得成功。选用原生质体为受体进行遗传转化，虽具有操作简单、转化率较高，转基因植株产生于单细胞克隆和协同转化率较高等特点，但由于原生质体再生植株受基因型限制很大，很难用生产上所用的骨干自交系为材料，以致无法普遍采用。

萨伏特(Sanford)等于1987年用基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞获得成功后，这一技术很快用于玉米遗传转化。1990年，戈登-凯姆(Gordon-Kamm)等用基因枪轰击法将报告基因和选择基因转入玉米悬浮培养细胞并再生出植株。在这之后，先后有近20个实验室采用该技术获得了玉米转基因植株。目前，这种方法在玉米转基因中用得较多。该方法受体广泛，可以是外植体(幼穗、幼胚或成熟胚等)、愈伤组织或悬浮培养细胞等，操作也相对简单，效果较好。在国内，王国英等(1995)用该方法将带有Bt毒蛋白基因的质粒导入玉米(获白×莱1029)悬浮培养细胞、愈伤组织和幼胚，并由转化愈伤组织再生出植株，部分再生植株对玉米螟有强的抗性，现已用于向骨干自交系导入抗虫基因。但该方法成本高，转化频率欠佳，转基因植株后代的分离世代多，且发生基因沉默的频率高。

从八十年代期起，许多学者致力于采用农杆菌介导法转化玉米茎尖、幼胚和培养细胞，取得了很大进展。1987年，格瑞姆斯利(Grimsley)等将玉米条纹病毒基因插入去毒Ti质粒的T-DNA区，用带有这种Ti质粒的农杆菌感染玉米成功，得到了出现病毒感染症状的植株。1991年，顾德(Gould)等用农杆菌介导法转化玉米茎尖，获得转化植株。1992年，米歇尔(Micheal)等用同样方法感染玉米幼胚，也得到类似的结果。1996年，日本学者石田(Ishida)等报道了用农杆菌高频率转化玉米幼胚的工作，自交系A188转化频率达5-30％，而A188与其它5个自交系的杂种，转化频率只有0.4--4.5％。

尽管玉米转基因研究已有大量的报道，转基因抗虫玉米已大面积推广，但以自交系为材料再生大量转基因植株的工作仍是玉米基因工程育种的制约环节。从大批获得转基因植株的角度出发，尚需建立起经济有效的技术体系。以我国生产上骨干自交系为材料，多数自交系的组织和细胞培养难度大，不易再生出大量植株，且再生植株自交结实更难。因此，克服基因型障碍，发展高效的玉米培养体系和转基因技术尤为重要，是玉米基因工程育种能否高效的关键步骤。

(三)发明内容

针对上述方法的不足，本发明要解决的问题是，提供一套建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用，它可有效地克服基因型制约，而从绝大多数基因型玉米的培养细胞再生出转基因植株，且转化频率高，再生植株体细胞无性系变异小，取材不受季节限制。

本发明建立玉米转基因受体体系的方法及应用包括如下步骤：

(1)种子萌发程序及技术，(2)茎尖培养技术，(3)丛生芽组织块诱导、继代和分化技术及培养基，(4)丛生小芽诱导、继代和分化技术及培养基，(5)以丛生芽组织块或丛生小芽为受体的转化、恢复培养、(抑菌)和筛选程序及技术，(6)小苗生根和移栽技术。

本发明中，玉米转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生小芽和丛生芽组织块及其扩增和继代培养物。

本发明中，茎尖是指十到几十微米的茎尖分生组织(shoot meristem)和大到几十毫米的茎端(shoot tip)；而茎尖分生组织是指顶端生长锥及其邻近的叶原基。丛生小芽是指离体培养茎尖在无2，4--D(2，4--二氯苯氧乙酸)培养基上产生丛生小芽和其继代培养物。丛生芽组织块是指离体培养茎尖在含2，4--D培养基和6-BA(6-苄基嘌呤)上产生的由丛生小芽和胚状体构成的组织块和其继代培养物，转入无2，4--D培养基上可再生出大量植株。

本发明中，基因枪轰击法(particle bombardment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。最初是美国康乃尔大学萨伏特(Sanford)等研制成功的火药基因枪及转化技术，此后有不同学者研制出的多种基因枪及不断改进的转化技术。本发明研究中所用的基因枪为美国Bio-RAD公司产品，型号为：Biolistic PDS--1000/He Particle Delivery System。按使用说明书操作。轰击参数为：可裂圆片与载体的距离为2.5厘米，载体与阻挡网的距离为0.8厘米，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在3--9厘米间取值。

本发明中，农杆菌(A..tumefaciens)介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida)等报道的。在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚类化合物和中性单糖(葡萄糖、木糖)，玉米丛生小芽和丛生芽组织块放在悬浮农杆菌的转染液中浸染3--8分钟，然后在培养基上共培养7--12天。转化体在含有适宜的抗生素培养基上抑菌，在加有选择剂的培养基上筛选，然后在分化培养基上分化。

本发明中，基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

本发明中，所用培养基及其配方：

种子萌发培养基：        KNO₃         1900mg/l，       NH₄NO₃        1650mg/l，CaCl₂·2H₂O  440mg/l，   MgSO₄·7H₂O  370mg/l，     KH₂PO₄·H₂O   170mg/l，FeSO₄·7H₂O  27.8mg/l，  ZnSO₄·7H₂O  10mg/l，      MnSO₄·4H₂O   22.3mg/l，H₃BO₃        10mg/l，      KI            0.83mg/l，    Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，GuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，   CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，    盐酸硫胺素         10.0mg/l，盐酸吡哆醇     1.0mg/l，      烟酸            1.0mg/l，      甘氨酸             2.0mg/l，肌醇           100.0mg/l，    生物素          0.05mg/l，     酪蛋白水解物       500mg/l，蔗糖           30g/l，        琼脂粉          7g/l，         pH5.8--6.0。

种子萌发液体培养基则在上述配方中去掉琼脂粉。

丛生芽诱导培养基：种子萌发培养基附加6-苄基嘌呤(6-BA)4.5--18.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖直接产生丛生小芽。

A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5～9.0μmol/l和2，4--二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0～3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8～3.6μmol/l，用于无根小苗生根。

种子萌发程序及技术是指：套袋获得的玉米骨干自交系和杂交种的种子，灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30～40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23～30℃)下1～2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

茎尖培养技术是指：萌发种子的胚芽伸长至3～5厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基或丛生芽诱导培养基上于黑暗下(24～27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。

丛生芽组织块诱导、继代和分化技术是指：接种在A培养基上的上胚轴及茎尖在黑暗下培养，3～4天时于弱光下切去伸长的胚轴。5～6天时，茎尖开始膨大，有些长出幼叶。幼叶的存在减慢了茎尖膨大速度，导致幼茎形成，需及时剥离。6～10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。茎尖膨大生长后，结构致密，质地柔韧，呈浅黄色，局部有密集的纤毛生长。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。不定芽数目因玉米基因型而差异大。从形态上看，不定芽可分成二种类型：一种具有生长点和叶原基分化，基部有短茎于原组织相连；另一种具有苞叶，生长点及叶原基被苞叶围拢，往往成丛分布。在这种培养基上，多数丛生小芽不能继续发育，其分生组织继续膨大后产生次生小芽。将丛生芽组织块仍在A培养基上继代培养，分生组织块持续生长，亦不规则膨大，浅黄色，解剖镜下可见到胚状体和不定芽大量形成，增生迅速，继续产生瘤状和指状突起。一般每4周继代培养一次。继代后培养13～20天的组织块作为转基因受体最为适宜。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2--3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5--6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。愈伤组织化的组织块产生胚状体和丛生小芽的数量较少。

丛生小芽诱导、继代和分化技术是指：接种在丛生芽诱导培养基上的上胚轴及茎尖，暗培养3天后，胚轴有所伸长，未剥离的叶原基发育为幼叶，应即时切去伸长的胚轴并剥去幼叶。剥离幼叶时应尽量减轻对顶端分生组织和叶原基的损伤。6～10天后，茎尖顶端生长锥周围和/或叶原基产生不定芽，每部位可产生2～5个小芽不等，一般聚集成丛。这种结构可在多个分生组织部位发生，每芽尖培养物能产生数十个小芽。丛生小芽数量随着培养时间延长而增多。不同基因型玉米，通过这条途径产生丛生小芽的能力差异很大，只有部分基因型的玉米茎尖可产生较多的丛生小芽。

以丛生芽组织块和丛生小芽为受体的转化、恢复培养、(抑菌)和筛选程序及技术是指：取继代后培养13～20天的丛生芽组织块或继代后培养10～18天的丛生小芽作为转基因受体。用基因枪轰击法或农杆菌介导法转化丛生芽组织块或丛生小芽，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7～12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3～4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大多数丛生小芽或丛生芽组织块逐渐变褐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的A培养基或丛生芽诱导培养基上产生丛生芽组织块或丛生小芽。

小苗生根和移栽技术是指：将丛生芽块切开，每块有小芽2～3个，放在成苗培养基上生长。小芽在照光下生长，光强2000-3000lx，光照14～15小时/天。小苗长到3～4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

利用本发明建立的玉米转基因受体体系进行遗传转化的程序和方法：

(I)、以农杆菌为中介进行遗传转化：

将带有双元载体(Mini--Ti质粒带有潮霉素抗性基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。

1、以丛生小芽为受体

1)、取在在丛生小芽诱导培养基上培养12天左右的丛生小芽，剥去幼叶，分割后放入含乙酰丁香酮100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮的菌液中浸染3～5分钟。

2)、浸染后的丛生小芽用无菌滤纸吸干，放在丛生芽诱导培养基上于黑暗中培养10天。培养温度为22～26℃。

3)、将丛生小芽转入加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的丛生芽诱导培养基上于黑暗中培养10～15天，抑制细菌生长。

4)、将抑菌后的丛生小芽转入加有选择剂潮霉素的丛生芽诱导培养基上进行筛选培养，每12天继代培养一次，选择存活材料转移。筛选3代(36天左右)后，只有少数丛生小芽存活，且长势不佳。将它们转移到无选择剂的丛生芽诱导培养基后，才能发育成健壮小苗。

5)、小苗长到3～4片叶时转入生根培养基中生根。根系发达的植株移栽到花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。约40％左右的植株为转基因个体。

2、以丛生芽组织块为受体

1)、取在A培养基上继代后培养15天左右的丛生芽组织块，切割后浸入加有100μmol/l乙酰丁香酮的1/2浓度的液体种子萌发培养基悬浮的菌液中3～5分钟。

2)、浸染后的丛生芽组织块用无菌滤纸吸干，放在A培养基上于黑暗中培养10天。培养温度为22～26℃。

3)、将丛生芽组织块转入加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的A培养基上于黑暗中培养10～15天，抑制细菌生长。

4)、将抑菌后的丛生芽组织块转入加有选择剂潮霉素B 20mg/l的A培养基上进行筛选，12天时继代培养一次。再将存活的组织块转移到加有潮霉素B 20mg/l的B培养基上再筛选一代。在筛选培养中绝大多数组织块逐渐变褐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的B培养基上产生丛生小芽。

5)、当筛选后的组织块分化出大量的丛生小芽时，分割后转移到成苗培养基上。待小苗长到3～4厘米高时转入生根培养基中生根。根系发达的植株移栽到花盆，成活后取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。约半数组织块再生的植株为转基因个体。

(II)、采用基因枪轰击法转化丛生芽组织块

1、DNA包裹微弹和基因枪轰击

1)、从宿主菌中提取带有目标基因的质粒并进行纯化，提取和纯化采用标准程序及方法(参见《分子克隆》)。质粒质量为OD260/OD280在1.7～1.8之间。质粒DNA浓度稀释为1μg/μl，于-20℃保存备用。

2)、称取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一个离心(Eppendorf)管中，加入1ml 70％乙醇剧烈涡旋3～5分钟，然后静置15分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。

3)、加1ml无菌水，剧烈涡旋1分钟，静置1分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。此步骤重复3次。

4)、第三次洗涤后的金粉，加50μl 50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹。该制备液室温可贮存2周)。

5)、使用时涡旋5分钟打破金粉凝集。

6)、分散后金粉依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl₂、20μl0.1M亚精胺，边旋涡边加样。

7)、继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。

8)、15000rpm离心2秒后弃上清液，加140μl 70％乙醇。

9)、静置沉淀，15000rpm离心2秒后弃上清液。

10)、加48μl无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋2～3秒，然后取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

11)、在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的A培养基，然后将丛生芽组织块(0.5～0.7cm大小，继代培养后16天左右)高密度放入培养皿中。

12)、用基因枪轰击丛生芽组织块，每皿轰击1-2次。轰击参数为：可裂圆片与载体的距离为2.5厘米，载体与阻挡网的距离为0.8厘米，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在3～9厘米间取值。其它参数按使用说明书取值。

2、转化后丛生芽组织块的筛选和培养

1)、轰击后丛生芽组织块在暗中恢复培养2～3天，然后将它们转入成分不变的新培养基中培养3周。此期丛生芽组织块生长良好，转入的目标基因得到充分表达。

2)、将恢复培养后丛生芽组织块转入加有选择剂(抗生素或除草剂)的A培养基上进行筛选培养。连续筛选三代，每代15天。在第一次筛选过程中丛生芽组织块有少数不再膨大，变褐死亡；大多数继续庞大但结构疏松，颜色变暗，原来生长良好、结构致密呈浅黄色的丛生芽组织块在接触培养基的部分开始变成褐色，其它部分则继续膨大，有瘤状或指状突起形成，15天时进行第二次筛选。在以后的筛选培养过程中，死亡的组织块逐渐增多，组织块膨大速度明显减慢。继续筛选三代后，丛生芽组织块成活率为11～15％。

3、转基因植株的再生

从选择培养基上挑选出三代筛选后存活的组织块转移到B培养基上分化小苗。一些组织块在转入B培养基后20～30天时死亡，另一些组织块一月后逐渐变成绿色，但没有分化出苗，随后逐渐死亡。这些材料可能在筛选过程中丧失胚性。仅有半数组织块转入分化B培养基7～10天后分化出小芽，后者在成苗培养基上生长半月后发育成小苗。

小苗长到2～3厘米高时转入生根培养基中诱导生根。转基因小苗对诱导生根的反应同未转基因植株的。转基因植株的移栽和田间管理同普通试管苗。

本发明能大幅度减少基因型障碍，可从绝大多数骨干自交系中高效获得转基因植株，且再生植株体细胞无性系变异小，多数植株生长发育正常，能自交结实。本发明的特点在于1)能从绝大多数基因型玉米的培养细胞再生出植株，2)培养细胞的转化频率较高，3)取材不受季节限制，4)转基因植株绝大多数能保持原基因型的特征特性，若以自交系为起始材料，转基因植株无需进行多代回交就能形成优良自交系。

(四)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：实例1：农杆菌介导的玉米骨干自交系的遗传转化和抗刺吸式昆虫的植株再生

1、材料

1)、玉米骨干自交系515的自交种子。

2)、农杆菌A815(RSs-1-GNA in AGL0)。该菌株含有双元载体系统，其Mini--Ti质粒的T--DNA区含有嵌合的雪花莲凝集素(GNA)基因和潮霉素(Hygromycin)抗性基因。前者在单子叶植物中能高效表达，杀死刺蚜虫、灰飞虱等刺吸式昆虫。后者赋予植物转化细胞的选择标记。

2、受体体系的建立

1)、自交系515的自交的精选种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡12分钟，然后用无菌水洗涤5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在250毫升无菌三角瓶内，加入35毫升无菌水，封口后放在黑暗条件(28℃)下2天。取露白后种子放在种子萌发培养基上于黑暗条件下萌发。取3---5厘米长的胚芽，剥离芽鞘及2--3片幼叶，切取长约5毫米左右的茎尖切段，接种到A培养基上于黑暗下(24--28℃)培养。

2)、在A培养基上培养3天的茎尖切段，胚轴有所伸长，即时切去伸长的胚轴。5--6天时，茎尖开始膨大，及时剥离长出的幼叶，使茎尖持续膨大。8天后茎尖膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起，且增生迅速，呈浅黄色。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽。取此期丛生芽组织块仍在A培养基上继代培养，分生组织块持续生长，亦不规则膨大，产生大量的胚状体和不定芽，再次继代培养后，继续产生瘤状和指状突起。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，少数转变成愈伤组织组织块和产生不定根的组织块在继代时去掉。取继代后培养15--20天的组织块作为转基因受体。

3、农杆菌转化丛生芽组织块

1)、将农根瘤农杆菌A815在附加抗生素35mg/ml利福平霉素、50mg/ml链霉素和壮观霉素100mg/ml的LB培养基中震荡培养，震荡速率为110r/min，温度28℃，培养14小时后取对数生长期细菌在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基洗涤，离心收集，共洗涤三次。再将菌体用添加乙酰丁香酮100μmol/l的1/2浓度的液体种子萌发培养基悬浮，稀释10倍后用于转化。

2)、将丛生芽组织块切割成0.2--0.3cm大小，放入添加100μmol/l的乙酰丁香酮的1/2浓度的液体种子萌发培养基悬浮的菌液中浸泡3分钟。浸染后的组织块用无菌滤纸吸干，放在A培养基上于黑暗中培养10天。培养温度为22--26℃。

3)、将丛生芽组织块转入加有头孢霉素250mg/l的A培养基上于黑暗中培养10--15天，抑制细菌生长。

4)、将抑菌后的丛生芽组织块转入加有选择剂潮霉素20mg/l的A培养基上进行筛选，12天时继代培养一次。再将存活的组织块转移到加有潮霉素浓度不变的B培养基上筛选一代，然后将存活的丛生芽组织块转移到无潮霉素的B培养基上产生丛生小芽。

4、转基因植株的再生和移栽

1)、当筛选后的丛生芽组织块分化出较多的小芽时，.分割后转移到成苗培养基上，每块有小芽2--3个。小芽在照光下生长，光强2000---3000lx，光照14---15小时/天。小苗长止3--4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天时，40％左右的小苗产生新根。将未生根苗的基部切伤，转移到新的生根培养基上培养，10天后绝大多数产生新根。

2)、生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中。植株在自然光照下生长，日温22--28℃，夜温15--21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗根系变发达，然后定植于田间。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。转基因植株自交结实，从其后代中选择抗刺吸式昆虫的植株。实例2：采用基因枪轰击法转化玉米骨干自交系

1、材料

1)、玉米骨干自交系8112和鲁原92的自交种子。

2)、质粒p35SCaMV。该质粒长度7.7kb，含有一个Ampr基因和一个来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆(Chlorsulfron)的突变基因als，als基因位于35SCaMV启动子和TCaMV之间。质粒提取和纯化采用标准程序及方法(参见《分子克隆》)。质粒质量为OD260/OD280在1.7--1.8之间。质粒DNA浓度稀释为1μg/μl。

2、受体体系的建立

除自交系不同外，实验步骤同实例1。

3、微弹制备和基因枪轰击

1)、称取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一个Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇后剧烈涡旋3--5分钟，然后静置15分钟。室温下15000rpm离心5秒，去除上清液。

2)、加1ml无菌水，剧烈涡旋1分钟，静置1分钟，室温下15000rpm离心5秒，去除上清液。此步骤重复3次。

3)、无菌水洗涤后的金粉，加50μl 50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)。该制备液可室温贮存2周，使用时涡旋5分钟打破金粉凝集。

4)、分散后金粉依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl₂、20μl0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2--3分钟，静置1分钟。

5)、15000rpm离心2秒，弃上清液。加140μl 70％乙醇，静置，15000rpm离心2秒后弃上清液。

6)、加48μl无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋2--3秒，然后取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

7)、在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的A培养基，然后将丛生芽组织块(0.5--0.7cm大小，继代培养后18天)高密度放入培养皿中。

8)、用基因枪轰击丛生芽组织块，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。

4、转化后材料的筛选和培养

1)、轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。

2)、将材料转入加有选择剂100ppb绿黄隆(Chlorsulfron)的A培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。连续筛选三代后，丛生芽组织块成活率为11--13％。

5、转基因植株的再生

1)将连续筛选三代后存活的组织块转移到B培养基上分化小苗。一些组织块变褐死亡，另一些组织块变成绿色后逐渐死亡，少数组织块在转入B培养基7--10天后分化出小芽。后者在成苗培养基上生长半月后发育成小苗。

2)、将2-3厘米高的小苗转入生根培养基中诱导生根。其余步骤相同于实例1的对应部分。

Claims (1)

1、一种建立玉米转基因受体体系的方法，由种子萌发，茎尖培养，丛生芽组织块或丛生小芽诱导、继代和分化，以丛生芽组织块或丛生小芽为受体的转化、恢复培养、筛选程序，小苗生根和移栽步骤组成，其特征在于，

①、丛生芽组织块的诱导、继代和分化培养；

②、以丛生小芽和丛生芽组织块为受体进行遗传转化；

上述玉米转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生小芽和丛生芽组织块及其扩增和继代培养物；丛生小芽指离体培养茎尖在无2，4--二氯苯氧乙酸培养基上产生的密集小芽和其继代培养物；丛生芽组织块指离体培养茎尖在含2，4--二氯苯氧乙酸和6-苄基嘌呤的培养基上产生的由丛生小芽和胚状体组成的组织块和其继代培养物；

其中，茎尖离体培养和丛生芽组织块诱导及继代培养、丛生小芽的继代培养用A培养基，其成分为：KNO₃          1900mg/l，   NH₄NO₃         1650mg/l，  CaCl₂·2 H₂O   440mg/l，MgSO₄·7H₂O  370mg/l，    KH₂PO₄·H₂O   170mg/l，   FeSO₄·7H₂O    27.8mg/l，ZnSO₄·7H₂O  10mg/l，     MnSO₄·4H₂O    22.3mg/l，  H₃BO₃          10mg/l，KI            0.83mg/l，   Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，   CuSO₄·5H₂O    0.025mg/l，CoCl₂ 6H₂O   0.025mg/l，   盐酸硫胺素       10.0mg/l，   盐酸吡哆醇       1.0mg/l，烟酸           1.0mg/l，     甘氨酸           2.0mg/l，    肌醇            100.0mg/l，生物素         0.05mg/l，    酪蛋白水解物      500mg/l，    6-苄基嘌呤      4.5-9.0μmol/l，2，4--二氯苯氧乙酸1.0-3.0μmol/l，                          蔗糖           30g/l，琼脂粉7g/l，pH5.8--6.0；

丛生芽组织块分化成苗培养基为B培养基，其成分为：将A培养基去掉2，4--二氯苯氧乙酸，取6-苄基嘌呤浓度为4.5μmol/l，加入吲哚丁酸1.8μmol/l；

离体茎尖取之无菌萌发的种子，即将套袋获得的玉米自交系或杂交种的种子灭菌后，放在无菌三角瓶内萌发，萌动后放入种子萌发培养基，即去掉2，4--二氯苯氧乙酸和6-苄基嘌呤的A培养基上，于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长到2-5厘米时，切取上胚轴及茎尖，接种到A培养基上，于温度24--27℃黑暗条件下诱导丛生芽组织块发生；诱导培养3天后，及时切去伸长的胚轴；5--6天时，茎尖开始膨大并有幼叶形成，需及时剥去幼叶；6--10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起，20天后，在瘤状或指状突起的表面出现不定芽和胚状体，即为形成的丛生芽组织块；

将A培养基上产生的丛生芽组织块仍在A培养基上继代培养，丛生芽组织块持续生长，亦不规则膨大，浅黄色，解剖镜下可见到胚状体和不定芽大量形成，增生迅速，继续产生瘤状和指状突起；4-5周继代培养一次；对发生的不定根需及早除去；在继代培养中，丛生芽组织块若产生大量丛生小芽，2，4--二氯苯氧乙酸浓度取为3.0μmol/l；丛生芽组织块若愈伤组织化较重，2，4--二氯苯氧乙酸浓度取为1.0μmol/l；

以常规方法，将丛生芽组织块转入B培养基中培养，分化出小苗；

取继代后培养13--20天的丛生芽组织块或取继代后培养10--18天的丛生小芽作为转基因受体，进行遗传转化。