CN113584072B - 草莓的遗传转化体系构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种草莓新品种‘申琪’的遗传转化体系，通过叶片和叶柄离体再生的方法、农杆菌介导的‘申琪’叶片和叶柄遗传转化体系建立，方法包括无菌叶片准备；筛选最优外源激素浓度诱导草莓‘申琪’叶片和叶柄再生成不定芽；‘申琪’叶片再生对抗生素的敏感性分析；农杆菌活化与培养；叶片和叶柄不定芽诱导培养；农杆菌浸染叶片和共培养；抗生素筛选阳性株系；转化株系检测等。本发明利用草莓叶片和叶柄诱导不定芽，并通过农杆菌浸染叶片、共培养后通过抗生素筛选、荧光筛选和PCR检测等方法鉴定转化株系，适用于草莓‘申琪’叶片和叶柄组培高效再生和农杆菌介导的遗传转化应用，针对‘申琪’草莓新品种的基因工程具有重要意义。

Description

草莓的遗传转化体系构建方法

技术领域

本发明涉及一种‘申琪’草莓叶片再生方法和农杆菌介导的遗传转化体系建立，属于‘申琪’草莓叶片组培再生和遗传转化基因工程技术领域。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa)为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)宿根性多年生草本植物，是重要的鲜食水果作物之一，也是蔷薇科植物重要的功能基因研究的模式物种。由于草莓染色体的多倍性和高度杂合性，使传统育种受到了有益性状定向改良难、育种范围窄、耗时长等限制。上世纪80年代，国内外有很多学者开始研究草莓的转基因方法，1990年Michael等利用草莓离体再生体系，通过农杆菌介导，将外源基因成功导入到草莓体内，开始逐步推动了草莓基因工程的发展。根据之前学者的研究进展发现，不同品种草莓再生方法和效率差距很大，具体表现为不同草莓品种特性不同，叶片再生的方法所用的激素，以及激素用量等方法也不同等。申琪(Shanghai Angel)草莓新品种是2018年上海市农科院新选育的抗病品种，适合露地栽培和盆栽，产量高，连续结果能力强，是备受农户和企业青睐的新品种，连续多年已在上海市周边地区大量推广和种植。本发明通过建立由农杆菌介导的草莓‘申琪’叶盘法高效遗传转化体系，为今后针对草莓‘申琪’的基因工程具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对草莓‘申琪’茎尖快繁和遗传转化基因工程等技术问题，本发明的第一个目的是提供一种草莓‘申琪’茎尖分生组织组培快繁技术。

本发明第二个目的是提供一种由农杆菌介导的草莓‘申琪’叶片和叶柄诱导愈伤和不定芽的遗传转化体系，为草莓‘申琪’品种的基因工程研究奠定基础。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种草莓‘申琪’申琪草莓的遗传转化体系构建方法，包括如下步骤：

(1)采用茎尖快繁方法制备无菌苗；

(2)利用步骤(1)制备的无菌苗进行无菌叶片和叶柄再生愈伤和不定芽诱导培养；

(3)活化农杆菌，用农杆菌浸染草莓叶片和叶柄进行共培养，然后进行农杆菌控菌杀菌处理；

(4)用抗生素梯度筛选阳性愈伤和不定芽，然后在增值培养基中培养扩增，将扩增得到的三叶一心的单独苗转移到优选生根培养基中进行生根培养；

(5)采用H19载体上通用载体序列片段Cas9基因PCR扩增检测或荧光eGFP蛋白发光检测进行阳性转化株系检测。

其中，步骤(1)中，首先对匍匐茎消毒处理，然后依次进行茎尖诱导培养、增殖培养和生根培养，其中，茎尖诱导培养基为T1：MS+GA 0.1-0.5mg/L+6-BA 0.3-0.5 mg/L；增殖培养基为T3：MS+IBA 0.01-0.02mg/L+6-BA 0.02-0.04mg/L；生根培养基为T5：MS+IBA 0.03-0.05mg/L。

具体地，所述匍匐茎消毒处理方法：选取无病虫害且健壮的草莓‘申琪’匍匐茎尖在流水下冲洗1-2小时后，在超净台上用75％酒精消毒25-30s；再用6％次氯酸钠消毒5-6min，最后用无菌水清洗5次，每次2min；在无菌滤纸上吸干水分后，在显微镜下利用解刨针剥取茎尖生长点0.3-0.5cm，转接到茎尖诱导培养基上培养。

优选地，所述茎尖诱导优选培养基为T2：MS+GA 0.2mg/L+6-BA 0.3mg/L；温度 (25±2)℃，在避光暗处理24℃条件下启动茎尖诱导，避光暗处理一周之后弱光1000 lx光培养，光照时间16h/d。

所述增殖培养的培养基为T4：MS+IBA 0.01mg/L+6-BA 0.1mg/L。在温度(25 ±2)℃，光照强度1500～2000lx，光照时间16h/d条件下培养，每月扩繁一次。

所述生根培养基为T6：MS+IBA0.03mg/L，温度(25±2)℃，光照强度1500～2000lx，光照时间16h/d条件下培养。

优选地，步骤(2)中，首先将步骤(1)得到的草莓无菌叶片预培养，即将草莓‘申琪’无菌苗叶片用灭菌的手术刀将叶片边缘锯齿切开，然后将叶片沿着叶脉切成1 立方厘米大小的叶块，或者将叶柄切成1厘米长的截断，进行预培养愈伤诱导，放置在预培养基T2：MS+GA 0.2mg/L+6-BA 0.3mg/L上进行再生愈伤和不定芽诱导，温度(25±2)℃，暗培养3天。再生愈伤和不定芽诱导培养基为T7：MS+IBA 0.1mg/L+ 6-BA 2.8-3.8mg/L。

其中，步骤(3)中，活化农杆菌是将取根癌农杆菌阳性单克隆培养在含利福平、庆大霉素和卡那霉素Rif(利福平)、Gen(庆大霉素)和K+(卡那霉素)抗生素的LB 液体培养基中，黑暗条件下振荡过夜培养，获得菌液、离心，将菌体沉淀重悬于含有抗生素的液体LB培养基中，再次过夜振荡培养，得到活化的农杆菌用于后期侵染用。

具体地，农杆菌侵染液为T8：液体MS+乙酰丁香酮(AS)20mg/L，农杆菌在浸染液中浸染时间和农杆菌OD₆₀₀值有关。草莓叶片浸染时间和农杆菌的OD600值成反比，OD600＝1时，浸染时间为20-30分钟，侵染后转移到无菌滤纸上吸干多余菌液，放置在共培养基T9：MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 3.4mg/L+AS 20mg/L上暗培养2-3天，温度(25±2)℃，注意观察叶片边缘长出白色农杆菌为准。

其中，所述农杆菌为GV3101农杆菌，转化载体为JH19，该载体的详细信息披露于Zhou等的《Efficient genome editing of wild strawberry genes,vector developmentand validation》(Plant Biotechnology Journal(2018)16,pp.1868–1877)中，载体上有潮霉素筛选标记和eGFP荧光蛋白标签。

具体地，步骤(3)中，用通过在杀菌液中浸泡进行控菌杀菌，农杆菌控菌处理时间和杀菌液中抗生素浓度根据叶片上农杆菌的长势而定。杀菌液为T10：MS+Carb 300-400mg/L+Tim 300-400mg/L，杀菌时间为30-40分钟。如果浸染后叶片上农杆菌较多，可在高浓度杀菌液下较长时间浸泡；如果浸染后叶片上农杆菌较少，可在低浓度杀菌液下较短时间浸泡。在杀菌液中浸泡后的叶片转移到无菌滤纸上吸干多余液体后，转移到杀菌培养基T11：MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 3.4mg/L+Carb 250mg/L+Tim 250mg/L，温度(25±2)℃，暗培养7-10天。

优选地，步骤(4)中，采用抗生素潮霉素进行梯度筛选阳性愈伤和不定芽，开始利用T12：MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 3.4mg/L+Carb 250mg/L+Cef 50mg/L+Hyg 1mg/L 低浓度筛选，随后每隔两周更换培养基，每次将潮霉素(Hyg)的浓度提高1mg/L，直至潮霉素的浓度上调到5mg/L为上线，且有不定芽长出为止，同时将Carb和Cef 杀菌抗生素浓度逐步降低。经过高浓度抗生素‘潮霉素’筛选的不定芽，在增殖培养基T4：MS+IBA 0.01mg/L+6-BA 0.1mg/L上培养。在温度(25±2)℃，光照强度 1500～2000lx，光照时间16h/d条件下培养，每月扩繁一次。进一步，将扩增三叶一心的单独苗转移到生根培养基T6：MS+IBA 0.03mg/L上进行生根处理。

其中，Carb：羧苄青霉素钠，Tim：特美汀，Cerf：头孢氨苄；AS：乙酰丁香酮；IBA：吲哚丁酸；TDZ：N-苯基-N’-1,2,3,-噻二唑-5-脲。

其中，上述MS培养基的基本成分包括Murashige&skoog(MS524)：4.74g/L、 MES0.525g/L、Vitamin B1(B1 Thiamine HCl)10mg/ml、Vitamin B6(Pyridoxine HCl)1mg/L、myo-Inositol(肌醇)100mg/L、Sucrose(蔗糖)2％，当为固体培养基时添加 7g/L AgarPowder琼脂粉，PH值为5.8。

将上一步骤得到的经过抗生素‘潮霉素’筛选以后，并且生根的转化株系可以进行一下两种方法的检测。

a.通用载体序列片段Cas9基因PCR扩增检测：

以待检测植株叶片为模板提取DNA，利用T1/T2为引物，进行常规PCR扩增，检测Cas9基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法显示检测结果。具体地，JH19 载体序列Cas9基因检测片段PCR检测引物为T1：tggacaaaaaatacagcat和T2：tgcgaagatggtagatcg。

b.荧光eGFP蛋白发光检测：

以待检测转化愈伤组织或者植株为对象，在荧光显微镜下进行观察eGFP是否可以发出绿色荧光蛋白，如果eGFP可以发出绿色荧光，说明被检测愈伤或者株系中eGFP 成功表达，遗传转化成功。

有益效果：本发明是针对草莓‘申琪’新品种开展的茎尖无菌苗组培快繁技术和遗传转化技术，‘申琪’是上海市农科院2018年新育成品种，并针对该品种遗传转化培养条件进行了系统研究，探索了‘申琪’遗传转化中愈伤与不定芽诱导、生根诱导和‘申琪’叶片对筛选标记‘潮霉素’敏感性分析等关键环节激素浓度范围，具有如下优点：

(1)本发明是针对草莓新品种‘申琪’开展的茎尖无菌苗组培快繁技术，并对茎尖快繁的诱导、增殖和生根培养基进行了筛选优化，最终得到适合草莓‘申琪’品种茎尖快繁的体系；筛选出了包括最优茎尖诱导培养基：T2：MS+IBA 0.2mg/L+6-BA 0.3 mg/L；最优增殖培养基：T4：MS+IBA 0.01mg/L+6-BA 0.1mg/L；最优生根培养基： T6：MS+IBA 0.03mg/L；

(2)本发明研究的草莓‘申琪’新品种的遗传转化体系，通过茎尖快繁获得无菌苗，利用草莓‘申琪’无菌苗叶片进行愈伤组织和不定芽诱导，该方法有效较少了遗传转化后期的污染问题，为高效转化奠定基础；

(3)本发明研究的草莓‘申琪’新品种的遗传转化体系，从无菌草莓叶片准备与预培养开始，依次经过农杆菌浸染叶片共培养，控菌处理，愈伤组织荧光观察，分化苗期抗生素标记‘潮霉素’筛选和标记分子鉴定与等关键环节，整个转化周期从愈伤阶段开始抗生素和荧光筛选，实现转化周期短，阳性转化效率高等特点；

(4)本发明优化了草莓‘申琪’叶片诱导愈伤组织和不定芽的培养基条件，其中 4级愈伤组织最大化诱导的优选培养基为：优选T8-1：MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 3.4mg/L，温度(25±2)℃，暗培养3天；

(5)本发明采用农杆菌介导的叶盘转化方法，探索了适合农杆菌浸染叶片和共培养中乙酰丁香酮的浓度为20mg/L；

(6)本发明采用Carb和Cef两种抗生素进行杀菌处理，在杀菌液中Carb和Cef浓度为300-400mg/L，在延迟筛选和杀菌固体培养基中采用Carb 250mg/L+Tim 250mg/L 处理10天，可以有效控制农杆菌再生长；

(7)本发明针对农杆菌介导的草莓‘申琪’叶片遗传转化，阳性株系筛选方法采用植物筛选标记‘潮霉素’梯度筛选阳性转化株系，具体地，浸染农杆菌并和农杆菌暗共培养后的草莓叶片首先在T10：MS+Carb300-400 mg/L+Tim 300-400mg/L杀菌液中浸泡30-40分钟之后，在M11：MS+IBA0.1+6-BA3.4 mg/L+Carb250 mg/L+Tim250 mg/L 上暗培养7-10天，才开始将叶片放在T12：MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 3.4mg/L+Carb 250mg/L+Cef 50mg/L+Hyg1mg/L低浓度筛选培养基上开始筛选，该步骤有助于愈伤向不定芽的转化，有助于后期拿到更多的主要株系，便于后期抗生素‘潮霉素’低浓度筛选，愈伤组织绿色荧光GFP方法筛选，分化芽抗生素‘潮霉素’高浓度筛选等过程；

(8)本发明针对农杆菌介导的草莓‘申琪’叶片遗传转化，检测方法采转化载体(图2)通用序列PCR扩增检测，荧光蛋白GFP标签发光检测，以上多种检测方法相互验证，增加了阳性株系筛选的效率；

(9)本发明为了分析叶片愈伤诱导和不定芽的效率，根据叶片愈伤生长情况，将叶片四边发生的愈伤的情况分为四边无愈伤、1边愈伤发生、2边愈伤发生、3边愈伤发生、4边愈伤发生，并依次划分为0、1、2、3、4五种等级，通过对愈伤等级划分，有助于量化区分愈伤组织的健康和质量情况，为最大化诱导高质量愈伤提供判断和评价标准；进一步，为了分析‘申琪’叶片对‘潮霉素’敏感性，按照叶片死亡面积占叶片总面积的比例进行分级0％、25％、50％、75％、100％，将叶片死亡程度划分为0、1、 2、3、4五种等级，通过叶片死亡面积程度划分，有助于量化区分‘申琪’叶片在筛选标记‘潮霉素’处理下叶片死亡情况量化统计分析，为‘申琪’叶片在‘潮霉素’处理下叶片死亡程度分析奠定了评判标准。

附图说明

图1为草莓新品种‘申琪’叶片诱导愈伤等级分级，从A到E的情况分别为四边无愈伤、1边愈伤发生、2边愈伤发生、3边愈伤发生、4边愈伤发生，并依次划分为0、1、 2、3、4五种等级；

图2为草莓‘申琪’遗传转化载体JH19；

图3为草莓新品种‘申琪’匍匐茎茎尖；

图4为草莓新品种‘申琪’叶片诱导愈伤；

图5为草莓新品种‘申琪’叶片诱导不定芽；

图6为不同浓度6-BA对‘申琪’叶片诱导愈伤影响；

图7为‘申琪’叶柄诱导愈伤和不定芽；

图8为不同浓度6-BA对‘申琪’叶柄诱导愈伤影响；

图9为不同浓度6-BA对‘申琪’叶片不定芽再生影响；

图10为不同浓度6-BA对‘申琪’叶柄不定芽再生影响；

图11为不同农杆菌浓度对愈伤诱导影响；

图12不同浓度‘潮霉素’处理对‘申琪’叶片坏死率影响；

图13为以‘申琪’为基因型材料转化株系中标记基因Cas9基因PCR检测；

图14为以‘申琪’为基因型材料转化愈伤系中标记荧光蛋白eGFP发光表达分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中，愈伤分级、潮霉素敏感性分级和不定芽分化率分析标准如下：

愈伤分级：根据叶片愈伤生长情况，将叶片四边发生的愈伤的情况分为四边无愈伤、1边愈伤发生、2边愈伤发生、3边愈伤发生、4边愈伤发生，并依次划分为0、1、 2、3、4五种等级(图1)。

潮霉素敏感性分级：按照叶片死亡面积占叶片总面积的比例进行分级0％、25％、50％、75％、100％,将叶片死亡程度划分为0、1、2、3、4五种等级。

愈伤发生率(％)＝愈伤发生外植体数/总接种外植体数×100％

敏感发生率(％)＝坏死发生外植体数/总接种外植体数×100％

不定芽分化率(％)＝出芽的外植体数/接种外植体总数×100％

不定芽再生率＝再生不定芽的外植体数/接种外植体总数*100％

外植体平均再生芽数＝外植体再生的不定芽总数/再生不定芽的外植体数

实施例1草莓新品种‘申琪’茎尖快繁无菌苗获得。

草莓新品种‘申琪’是上海市农科院2018年新育成品种，该品种大果，抗炭疽病，连续结果能力强，在上三角地区目前已经广泛的推广，本发明系统建立了新品种‘申琪’茎尖快繁技术，包括茎尖诱导、诱导茎尖分化、幼苗增殖培养和生根培养。

茎尖消毒处理：选取无病虫害且健壮的4厘米长度左右的匍匐茎尖在流水下冲洗1.5-2小时(图3)，在超净台上利用75％酒精消毒30s，再利用6％次氯酸钠消毒6min，最后用无菌水清洗5次，每次2min；在无菌滤纸上吸干水分后，利用解刨针在超净台上显微镜下剥取茎尖生长点0.2～0.3cm。

茎尖诱导培养：将上一步骤剥取的茎尖生长点转接到茎尖诱导培养基。

T2：MS+IBA0.2mg/L+6-BA0.3mg/L上，温度(25±2)℃，先暗培养一周，再进行光照培养20-30天左右。

增殖培养：将茎尖诱导成功的茎尖分生丛芽转接到增殖培养基T4：MS+IBA 0.01mg/L+6-BA 0.1mg/L上培养，温度(25±2)℃，30天左右换一次培养基，一般继代培养2-3次即可。

生根培养：将继代2-3次的增殖苗，可以直接转接到生根培养基T6：MS+IBA 0.03mg/L上进行生根处理进行生根壮苗处理。温度(25±2)℃、光照度2000～3000lx、光照16h(光)/8h(暗)。在遗传转化用叶片之前，将生根健壮的‘申琪’苗(图3)提前在无激素的MS固体培养基上培养20-30天处理，减少草莓苗体内的激素，有利于叶片诱导不定芽的生成(图4-图5)。

实施例2不同浓度外源激素6-BA对草莓新品种‘申琪’叶片和叶柄愈伤和不定芽诱导的影响。

选取继代培养3代叶龄为35d左右的‘申琪’叶片，去掉叶缘及主叶叶脉，切成0.3-0.5 cm²的小块正面朝下放置，茎段切成0.5cm贴合于不同浓度细胞分裂素6-BA不定芽诱导培养基上培养；激素配比由表1可见，20天更换一次培养基，培养40d后统计愈伤等级，培养8周后统计不定芽诱导率。

表1不同激素浓度

在不同‘6-BA’浓度梯度诱导下，培养40天时统计时统计愈伤诱导情况，结果发现随着‘6-BA’浓度从2.8mg/L升高到3.4mg/L时，‘申琪’诱导四级愈伤诱导发生率随之升高，当‘6-BA’浓度为3.4mg/L时，同比‘申琪’叶片的四级健康愈伤发生率达到最高，随后随着‘6-BA’浓度升高，四级健康愈伤的诱导率开始降低(图6)。同时，本发明同时探索‘申琪’叶柄遗传转化过程中愈伤和不定芽诱导情况(图7)，在‘申琪’叶柄中，愈伤诱导趋势和叶片中相似，在‘6-BA’浓度为3.4时，四级健康愈伤达到最高值(图8)。

在愈伤诱导分析的基础上，本发明进一步将上述愈伤继续培养到第8周开始统计不定芽诱导发生率。结果如图9所示，当‘6-BA’浓度为3.4mg/L时，在叶片中，不定芽再生率为30％；在叶柄中不定芽再生率为23％，均比较高(图10)。

综上所述，草莓新品种‘申琪’叶片和叶柄诱导愈伤和不定芽的最优‘6-BA’浓度为3.4mg/L，该浓度筛选为后期‘申琪’遗传转化愈伤诱导培养奠定基础。

实施例3根癌农杆菌活化操作方法

在进行农杆菌GV3101和‘申琪’叶片或者叶柄浸染之前，将农杆菌进行活化处理之后，有利于菌液浸染，提高转化效率。具体活化方法如下：

(1)在超净台上用200μL移液枪头挑取-80℃保存的农杆菌，在LB+Kan 50mg/L +Gen 50mg/L+Rif 50mg/L固体培养基上划线培养，28℃，12-48h，长出单菌落。

(2)无菌枪头挑取单菌落，划线保存，同时用该枪头挑取单菌落接种于5ml LB +Kan 50mg/L+Gen50 mg/L+Rif 50mg/L液体培养基中，28℃，200rpm培养20h，获得步骤(3)所需菌液。

(3)取10μL(2)中培养的菌液于20ml相同液体培养基中，28℃，200rpm，培养 16-18h，OD600＝0.1-0.2。

(4)25℃，5000rpm，离心5min收集农杆菌菌体沉淀，转至用MS液体培养基(含20mg/L AS)中震荡培养。

实施例3农杆菌OD₆₀₀值对‘申琪’叶片伤诱导的影响。

含有双元表达载体(图2)的农杆菌OD₆₀₀值对浸染叶片的愈伤诱导有显著的影响。如图11所示，当农杆菌OD₆₀₀值为0.3时，转化‘申琪’叶片后4级健康愈伤的诱导率最高，为14％，随着农杆菌OD₆₀₀值从0.5增加到1时，4级健康愈伤的诱导率维持在稳定的 9-11％范围之内。当农杆菌OD₆₀₀值为1.5时，4级健康愈伤的诱导率降低到7％。由此可见，当农杆菌OD₆₀₀值为0.3时，浸染叶片愈伤诱导率最高，杆菌OD₆₀₀值高于1.5时，浸染叶片愈伤诱导率显著性降低，在用‘申琪’叶片进行遗传转化诱导愈伤时，选择农杆菌OD₆₀₀值小于1.5，大于0.3均可以较高效率的产生愈伤。

同时，本发明采用双元表达载体JH19(图2)为植物遗传转化载体进行农杆菌浸染叶柄后，愈伤组织和不定芽诱导情况分析。结果如表2所示，在杆菌OD₆₀₀值0.3-1.5不同梯度中，不定芽发生的叶块数目和不定芽数目均有显著性差异，当农杆菌OD₆₀₀值为1 时，不定芽发生的叶块数目最多，同时不定芽数目也是最多。

表2不同OD₆₀₀值对叶柄不定芽诱导率的影响

综上所述，农杆菌OD₆₀₀值选择1时，是叶柄不定芽诱导的最佳浓度，后期‘申琪’遗传转化参考该农杆菌浓度进行后期实验研发。

实施例4抗生素‘潮霉素’不同浓度对草莓新品种‘申琪’叶片敏感性影响。

草莓叶片对‘潮霉素’的坏死发生情况和敏感性标准如图12所示，为了分析叶片愈伤诱导和不定芽的效率，根据叶片愈伤生长情况，将叶片四边发生的愈伤的情况分为四边无愈伤、1边愈伤发生、2边愈伤发生、3边愈伤发生、4边愈伤发生，并依次划分为0、1、2、3、4五种等级；为了分析叶片对‘潮霉素’敏感性，按照叶片死亡面积占叶片总面积的比例进行分级0％、25％、50％、75％、100％，将叶片死亡程度划分为0、 1、2、3、4五种等级。按照叶片死亡面积占叶片总面积的比例进行分级0％、25％、50％、 75％、100％，将叶片死亡程度划分为0、1、2、3、4五种等级。

表3不同潮霉素(Hyg)浓度

本发明为了摸索适合‘申琪’叶片敏感性筛选的‘潮霉素’浓度，设计了5组不同‘潮霉素’浓度培养基(表3)，选取壮苗进行生根后，在无激素培养基上培养20-30天左右的‘申琪’无菌苗叶片，切掉叶缘及主叶叶脉，切成0.4-0.5cm的叶盘，近轴面朝下置于3.4mg/L6-BA不定芽诱导培养基上，同时在培养基中加入1-5mg/L不同浓度梯度的潮霉素。结果发现，当‘潮霉素’浓度为0时，叶片的坏死面积为0；当潮霉素’浓度为1mg/L时，4级叶片坏死率为10％以内，随着‘潮霉素’浓度的升高，叶片的坏死面积不断扩大；当‘潮霉素’浓度为3mg/L和4mg/L时，叶片的4级死亡率均在40％多；当‘潮霉素’浓度为达到5mg/L时，叶片的4级死亡率占了63％以上，2级死亡率仅占了2％左右。由此可见，5mg/L是‘申琪’叶片对‘潮霉素’敏感度的上线，后期‘潮霉素’筛选应保持在该浓度范围以内才能确保叶片不完全死亡(图12)。

实施例5转化株系核心标记基因Cas9 PCR检测和eGFP荧光观察分析

转化外源载体的‘申琪’叶片或者叶柄，在成功诱导愈伤组织和不定芽后，进行外源载体标记基因Cas9基因序列PCR扩增检测和eGFP荧光蛋白发光观察分析。

转化愈伤和不定芽在高浓度‘潮霉素’筛选之后，进一步我们检测了阳性愈伤分化而来株系苗中Cas9基因情况。通过利用T1：tggacaaaaaatacagcat和T2：tgcgaagatggtagatcg引物扩增cas9基因，结果显示在第7、11、12、18、19、20和23号愈伤诱导的不定芽中成功检测出了Cas9基因(图13)，并进一步作为备选阳性株系进行后续的检测分析。

在Cas9基因检测基础上，进一步通过荧光显微镜观察愈伤组织和不定芽GFP荧光蛋白标记发光情况，如图14所示，遗传转化成功的阳性草莓愈伤可以发出荧光，证明携带eGFP标签的外源载体已经成功在草莓愈伤中遗传转化并表达，以上转化株系双重检测方法是阳性株系筛选鉴定的有效保障。

综上，本发明提供一种草莓新品种‘申琪’茎尖快繁技术和农杆菌介导的草莓‘申琪’无菌叶片遗传转化体系。其中茎尖诱导愈伤和不定芽效率高，遗传转化过程中由乙酰丁香酮诱导农杆菌浸染叶片，通过抗生素浓度梯度控菌，抗生素浓度梯度筛选和多样化筛选标记基因分子PCR检测，提供一种由农杆菌介导的高效的草莓‘申琪’叶片遗传转化体系，为以草莓‘申琪’为基因型材料的组培茎尖快繁和基因功能改良奠定基础。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 草莓的遗传转化体系构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> T1(Artificial Sequence)

<400> 1

tggacaaaaa atacagcat 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> T2(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcgaagatg gtagatcg 18

Claims (6)

1.一种草莓申琪的遗传转化体系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采用茎尖快繁方法制备草莓‘申琪’无菌苗：首先对匍匐茎消毒处理，然后依次进行茎尖诱导培养、增殖培养和生根培养，其中，茎尖诱导培养基为T1：MS +GA 0.1 -0.5mg/L+6-BA 0.3-0.5 mg/L；增殖培养基为T3：MS +IBA 0.01-0.02 mg/L+ 6-BA 0.2-0.4 mg/L；生根培养基为T5：MS +IBA 0.03-0.05 mg/L；

（2）利用步骤（1）制备的无菌苗进行无菌叶片和叶柄再生愈伤和不定芽诱导培养：再生愈伤和不定芽诱导培养基为T7：MS+IBA 0.1mg/L+ 6-BA 2.8-3.8 mg/L；

（3）活化农杆菌，用农杆菌浸染草莓叶片和叶柄进行共培养，然后进行农杆菌控菌杀菌处理，农杆菌浸染液为T8：液体MS+乙酰丁香酮20 mg/L；侵染后转移到无菌滤纸上吸干多余菌液，放置在共培养基T9：MS+ IBA 0.1mg/L + 6-BA 3.4 mg/L + AS 20 mg/L 上暗培养2-3天，温度25±2℃；通过在杀菌液中浸泡进行控菌杀菌，杀菌液为T10：MS + Carb 300-400mg/L + Tim 300-400 mg/L，杀菌时间为30-40分钟，在杀菌液中浸泡后的叶片转移到无菌滤纸上吸干多余液体后，转移到杀菌培养基T11：MS+IBA 0.1 mg/L+ 6-BA 3.4 mg/L+Carb250 mg/L+Tim 250 mg/L，温度25±2℃，暗培养7-10 天；

（4）用抗生素梯度筛选阳性愈伤和不定芽，然后在增值培养基中培养扩增，将扩增得到的三叶一心的单独苗转移到优选生根培养基中进行生根培养：采用抗生素潮霉素进行梯度筛选阳性愈伤和不定芽，开始利用T12：MS+IBA 0.1 mg/L+6-BA 3.4 mg/L+Carb 250 mg/L+Cef 50 mg/L+Hyg 1 mg/L低浓度筛选，随后每隔两周更换培养基，每次将潮霉素的浓度提高1 mg/L，直至潮霉素的浓度上调到5mg/L为上线，且有不定芽长出为止，同时将Carb 和Cef杀菌抗生素浓度逐步降低，经过高浓度抗生素‘潮霉素’筛选的不定芽，在增殖培养基T4：MS +IBA 0.01 mg/L+ 6-BA 0.1 mg/L上培养，在温度25±2℃，光照强度 1500~2000lx，光照时间16 h/d条件下培养，每月扩繁一次，将扩增三叶一心的单独苗转移到生根培养基T6：MS +IBA 0.03 mg/L上进行生根处理；

（5）采用JH19载体上通用载体序列片段Cas9 基因PCR扩增检测或荧光蛋白eGFP发光检测进行阳性转化株系检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，首先将步骤（1）得到的草莓无菌叶片预培养，即将申琪无菌苗叶片用灭菌的手术刀将叶片边缘锯齿切开，然后将叶片沿着叶脉切成1立方厘米大小的叶块，或者将叶柄切成1厘米长的截断，进行预培养愈伤诱导。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，活化农杆菌是将取根癌农杆菌阳性单克隆培养在含利福平、庆大霉素和卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，黑暗条件下振荡过夜培养，获得菌液、离心，将菌体沉淀重悬于含有抗生素的液体LB培养基中，再次过夜振荡培养，得到活化的农杆菌用于后期侵染用。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为GV3101农杆菌，转化载体为JH19，载体上有潮霉素筛选标记和eGFP荧光蛋白标签。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS 培养基的基本成分包括Murashige＆ skoog 4.74 g/L、MES 0.525 g/L、维生素 B 110 mg/ml、维生素 B6 1 mg/L、myo-Inositol 100mg/L、蔗糖2 %，当为固体培养基时添加7 g/L琼脂粉，pH值为5.8。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，JH19载体序列Cas9基因检测片段PCR检测引物为T1：tggacaaaaaatacagcat和T2：tgcgaagatggtagatcg。