CN114561422B - 一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用 - Google Patents

一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，具体涉及一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用，包含了植物培养，侵染液制备，匍匐茎离体注射和毛状根诱导，以草莓小苗作为试验材料，对草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较，筛选出活体注射法后，用携带有pCAMBIA1302和pCAMBIA1302‑FaNRT1.1载体的K599发根农杆菌进行匍匐茎注射，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察确定为转基因毛状根，本发明成功建立了草莓匍匐茎生长转基因毛状根诱导体系，研究了草莓毛状根最佳诱导方法，红颜草莓毛状根诱导率达到50％，对草莓根系矿质营养和次生代谢研究提供了可行方法。

Description

一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物培养技术领域，具体涉及一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用。
背景技术
草莓是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本浆果果树，草莓果实中的营养价值丰富，含有多种维生素、苹果酸、柠檬酸、Ca、Fe、鞣酸、胡萝卜素和花青素等营养物质，因果大味美，被誉为“水果皇后”。
发根农杆菌是一种可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物的革兰氏阴性菌，它在侵染植物时将它携带的Ri质粒中的T-DNA导入被侵染植物的基因组中，受到侵染的植物伤口处会产生毛状根。发根农杆菌诱导所得的毛状根分化程度高且可以自主生长，是常见的试验材料。现有研究中还没有对草莓匍匐茎进行活体注射并通过农杆菌诱导建立草莓转基因毛状根诱导的方法。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决如何对草莓匍匐茎进行活体注射并通过农杆菌诱导建立草莓转基因毛状根诱导的问题，提供了一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明公开了一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
S1：转基因菌液制备：用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD600≈0.2～0.4，富集菌液，离心后用含有乙酰丁香酮的侵染液轻柔重悬，得到侵染菌液；
S2：侵染：采用步骤S1中得到的侵染菌液对盆栽草莓进行草莓匍匐茎活体注射；
S3：毛状根诱导：对步骤S2中经过活体注射后的草莓苗用湿棉花保湿，用黑塑料布覆盖，暗培养3d，得到毛状根。
所述步骤S1中离心的转速为5000r/min，离心时间为5min。。
所述步骤S1侵染液包括10mmol/L的MES、10mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的乙酰丁香酮，采用灭菌水定容。
所述步骤S2中草莓匍匐茎活体注射是采用侵染菌液在2～3幼叶小苗的匍匐茎上端0.5～1cm内进行草莓匍匐茎活体注射。
所述步骤S2中活体注射的侵染菌液OD600为0～1。
所述步骤S3中草莓苗注射伤口处需要用一端泡在水中的纱布覆盖保湿。
本发明还公开了上述草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法在章姬草莓、红颜草莓、白雪公主草莓中的应用。
与现有技术比较本发明的有益效果在于：
1、本发明以草莓小苗作为试验材料，对草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较，筛选出活体注射法后，用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌进行匍匐茎注射，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察确定为转基因毛状根，本发明成功建立了草莓匍匐茎生长转基因毛状根诱导体系，研究了草莓毛状根最佳诱导方法，对草莓基因研究有重要意义；
2、本发明采用的侵染方法是盆栽草莓匍匐茎活体注射的方法，此方法简单易行，区别于温郁金毛状根中的外植体组培诱导，活体注射可在大田培养时完成，不需要组培的无菌条件和脱菌繁殖，就已经可以成功获得转基因毛状根，并且与清水组进行对比确定了此方法的可行性；
3、本发明活体注射方法诱导率高，红颜草莓匍匐茎毛状根诱导率达到50％，白雪公主草莓匍匐茎毛状根诱导率达到60％；
4、本发明中毛状根注射位于草莓匍匐茎上端位点，区别于植物本身根系生长位置，较容易确定为转基因毛状根，转基因毛状根鉴定率较高，实验用活体注射法所得毛状根经过鉴定，100％均为转基因毛状根，有利于后期基因的功能验证。
附图说明
图1为草莓毛状根诱导活体注射方法，(A)为草莓匍匐茎的不同注射点，(B)注射后草莓注射点的培养方法，(C)草莓匍匐茎的不同老嫩程度，横线为5mm；
图2不同嫩度匍匐茎注射后表皮变化情况，Control注射不含菌液的侵染液，Young、Mature和Old注射含pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌，横线为5mm；
图3为草莓匍匐茎毛状根生长过程，(A)注射前，(B)注射后35d，(C)注射后40d，(D)注射后60d，横线为5mm；
图4为转pCAMBIA1302-FaNRT1.1和pCAMBIA1302毛状根的电泳检测结果，(A)和(B)为转pCAMBIA1302-FaNRT1.1和pCAMBIA1302的毛状根；
图5为转pCAMBIA1302-FaNRT1.1草莓毛状根的荧光信号，FaNRT 1.1为转pCAMBIA1302-FaNRT1.1的草莓毛状根，WT为草莓水培根，横线为25μm；
图6为转pCAMBIA1302-FaNRT1.1和pCAMBIA1302的草莓匍匐茎毛状根；
图7为FaNRT1.1的过表达对草莓根系硝酸盐转运活性的影响；
图8为转pHellsgate2-FaNRT1.1和pHellsgate2的毛状根电泳检测结果；
图9为转pHellsgate2-FaNRT1.1和pHellsgate2的草莓匍匐茎毛状根；
图10为FaNRT1.1基因的沉默表达对草莓根系硝酸盐转运活性的影响。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
一、诱导草莓匍匐茎生长转基因毛状根的方法
1、基本侵染方法的筛选
用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD600≈0.2-0.4，富集菌液，5000r/min离心5min，弃上清，用侵染液[MES(10mmol/L)，MgCl2(10mmol/L)，Ace(乙酰丁香酮)(0.5mmol/L)，灭菌水定容]轻柔重悬，重复用侵染液清洗1次，最后用侵染液定容，用于注射或处理草莓匍匐茎。
选取的草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较。剪取草莓10-15d匍匐茎上2-3幼叶的小苗，保留匍匐茎上段1.5cm；用含发根农杆菌的侵染液在匍匐茎近小苗0.5-1cm内进行草莓匍匐茎离体注射；具有基部伤口的离体小苗整株泡在侵染液中，在0.8MPa下抽真空30min，进行草莓匍匐茎离体抽真空；在盆栽草莓2-3幼叶小苗的匍匐茎上端0.5-1cm内进行草莓匍匐茎活体注射。注射或抽真空后的草莓苗用湿棉花保湿，用黑塑料布覆盖，暗培养3d。离体注射的草莓苗放到浮板上水培处理，活体注射的草莓苗伤口处用一端泡在水中的纱布覆盖保湿。处理20d后，根据苗和根发黑，苗发黑、根发黑与苗和根生长良好4种情况进行统计。
2、草莓匍匐茎生长转基因毛状根的方法
筛选出活体注射法(图1B)后，用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD600≈1，进行匍匐茎注射部位、匍匐茎老嫩程度、不同菌液浓度和不同草莓品种的研究，并在注射35d后观察记录草莓匍匐茎注射点愈伤凸起情况和注射断枝情况。
对红颜草莓选取新萌发的匍匐茎，去除顶稍再长出的小匍匐茎顶稍，分别选取草莓匍匐茎接近顶端植株上端约0.5-1cm处的①点，匍匐茎中间的②点和接近结节约0.5-1cm处的③点，注射OD600≈1携带有pCAMBIA1302载体的发根农杆菌菌液，筛选最佳注射点(如图1A图所示)。
OD600≈1携带有pCAMBIA1302载体的发根农杆菌菌液分别稀释到OD600≈1、OD600≈0.1和OD600≈0.01，与不含菌液的注射液为Control，注射红颜草莓成熟茎①注射点，筛选注射用最佳菌液浓度。
对章姬、红颜、白雪公主这三种草莓，选取成熟茎①注射点，注射OD600≈1携带有pCAMBIA1302载体的发根农杆菌菌液，探讨适宜的毛状根诱导草莓品种。
二、FaNRT1.1在草莓中硝酸盐转运功能研究方法
用携带有pCAMBIA1302、pCAMBIA1302-FaNRT1.1、pHellsgate2和pHellsgate2-FaNRT1.1载体的K599发根农杆菌，按草莓毛状根最佳诱导方法侵染草莓匍匐茎。毛状根生长呈丛生状时，选取部分毛状根提取DNA，进行PCR检测转基因情况。以1302-35S F和1302-GFP R为引物，检测pCAMBIA1302转基因的情况；以1302-35S F和N11-380R为引物，检测pCAMBIA1302-FaNRT1.1转基因的情况；以Gate-intro86F和Gate-intro86R为引物，检测pHellsgate2转基因的情况；以N11-380F和Gate-intro86R为引物，检测pHellsgate2-FaNRT1.1转基因的情况。
选取pCAMBIA1302-FaNRT1.1载体的毛状根，进行激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
选取4种类型的转基因毛状根株系，提取RNA，反转录成cDNA，检测草莓硝酸盐代谢路径相关基因和相关硝酸盐转运蛋白基因的相对表达情况。
从毛状根近草莓母株端剪开，分离出只带毛状根而没有自身水培根的草莓小苗，用于15N标记实验，检测转基因株系的硝酸盐转运功能。空载对照、过表达株系和沉默株系在不含氮的营养液中培养5d；之后将草莓幼苗根系放入0.1mM CaSO4溶液中浸泡1min；将草莓根系再放入1.25mM的15N标记的KNO3(99atom％15N)作为氮源的营养液中浸泡10min；将浸泡后的草莓根系再一次放入0.1mM CaSO4溶液中浸泡1min；吸干根系表面水分后，将其放入85℃烘箱烘干并将其研磨成粉末；称取一定质量样品于稳定同位素质谱仪进行15N含量测定。
三、草莓转基因毛状根的诱导体系
1、基本侵染方法的筛选
不同基本侵染法侵染草莓后(表1所示)，幼苗受伤发黑和生长情况不一样。离体注射法和离体抽真空法对小苗的伤害较大，苗和根出现发黑的的比例分别达到45.95％和97.93％。而活体注射法对小苗的伤害最小，苗和根均可以继续生长。
表1不同基本侵染法侵染20d后草莓苗生长情况
2、匍匐茎不同部位注射35d后变化情况
表2匍匐茎不同部位注射35d后表皮凸起情况
注射部位 总数 表皮凸起数 表皮凸起百分比％
① 24 12 50
② 10 1 10
③ 10 0 0
在活体注射法的基础上，选取匍匐茎上三个不同位置进行注射(表2)。注射后注射点可以形成表皮凸起，有利于后期伤口处长毛状根。①位点靠近小苗，注射后表皮50％可以出现凸起，最有利于后期毛状根的形成。
3、匍匐茎不同老嫩程度注射35d后变化情况
表3匍匐茎不同老嫩程度注射35d后表皮凸起情况
老嫩程度 总数 表皮凸起数 表皮凸起百分比％ 断枝数 断枝百分比％
嫩 10 7 70 3 30
成熟 24 12 50 0 0
老 10 1 10 0 0
在活体注射法的基础上，选取匍匐茎上①位点的三种老嫩程度不同的匍匐茎进行注射(表3和图2)。注射点幼嫩时最容易形成表皮凸起，注射后35d时表皮凸起率可以达到最高的70％。但是，注射后幼嫩的匍匐茎也最容易折断，达到30％的断枝率。匍匐茎较老时，匍匐茎上不容易形成表皮凸起，仅有10％。中等水平的成熟匍匐茎上既可以形成50％的表皮凸起，又不容易出现断枝情况。注射中选取成熟茎和生长天数较多的嫩茎效果最好，9-12d左右成熟度的匍匐茎优先选择。
4、不同浓度菌液注射草莓35d后变化情况
表4不同浓度菌液注射35d后匍匐茎表皮凸起情况
浓度 总数 表皮凸起数 表皮凸起百分比％
0 10 0
0.01 10 1
0.1 10 2
1 10 5
活体注射9-12d左右的匍匐茎接近顶端植株约0.5-1cm处，不同菌液浓度对表皮凸起的诱导情况也不一样(表4和图2)。不含菌液的注射液注射后，匍匐茎上基本没有出现表皮凸起(图2Control)。而随着发根农杆菌菌液浓度的升高，表皮凸起的比率也升高。注射OD600≈1的发根农杆菌后，表皮凸起率可以达到50％，OD600≈1是较好的注射用菌液浓度。
5、不同品种草莓注射35d后变化情况
表5不同品种草莓注射35d后匍匐茎表皮凸起情况
品种 总数 表皮凸起书 表皮凸起百分比％
章姬 10 3 30
红颜 10 5 50
白雪公主 10 6 60
对三种不同品种草莓9-12d左右的匍匐茎接近顶端植株约0.5-1cm处，活体注射OD600≈1的发根农杆菌(表5)。注射后不同品种间表皮凸起率存在差异，白雪公主>红颜>章姬。红颜草莓的发根农杆菌注射后表皮凸起率较高，又是生产实践中推广品种，本研究选种红颜草莓进行后期实验验证。
6、草莓毛状根最佳诱导方法
对红颜草莓9-12d左右的接近顶端植株上端匍匐茎约0.5-1cm处，活体注射OD600≈1的发根农杆菌，是草莓毛状根诱导较好的一种方法。如图3所示，注射后35d，注射点表皮发生凸起；注射后40d，在凸起点长出细小的根状物；到注射后60d，注射点可以长出较多细长的毛状根。不同于草莓的水培根，毛状根更加细长、弯绕；草莓匍匐茎毛状根诱导率达到50％。生长毛状根的草莓小苗可以剪下来进行和根有关的其他验证实验。
四、FaNRT1.1转基因草莓毛状根的硝酸盐转运功能
1、FaNRT1.1过表达促进草莓根系硝酸盐的吸收
选用草莓毛状根最佳诱导方法，转pCAMBIA1302-FaNRT1.1和pCAMBIA1302两种载体。如图4所示，对5个pCAMBIA1302-FaNRT1.1和3个pCAMBIA1302转基因毛状根提取DNA，进行PCR检测，均检测到载体特异目的条带。选取含pCAMBIA1302-FaNRT1.1载体发根农杆菌侵染后的毛状根，进行激光共聚焦显微镜观察荧光信号(图5所示)。草莓未侵染农杆菌生长的水培根，未显示荧光信号。而pCAMBIA1302-FaNRT1.1侵染后，毛状根细胞显示了荧光信号。而且因为草莓匍匐茎毛状根生长的位置没有其他根系生长，本实验中含GFP标签载体的发根农杆菌侵染后生长出来的毛状根经检测均有荧光信号。
选用图6所示的1个pCAMBIA1302和3个pCAMBIA1302-FaNRT1.1，检测草莓硝酸盐代谢路径相关基因和相关硝酸盐转运蛋白基因的相对表达情况(图7A-G)，以及草莓毛状根对15N-硝酸盐的转运情况(图7H-I)。FaNRT1.1的过表达使得转基因毛状根中FaNRT1.1和FaNRT1.2基因的表达量显著提高，吸收转运更多的硝酸盐，使毛状根系中15N的含量极显著提高；10min的处理后，转基因毛状根植株地上部的15N含量仅显著提高。硝酸盐代谢路径上的FaNIA、FaNIR、FaGLN、FaGLU和FaGDH基因表达也随之显著上升。
2、FaNRT1.1沉默表达抑制草莓根系硝酸盐的吸收
选用草莓毛状根最佳诱导方法，转pHellsgate2和pHellsgate2-FaNRT1.1两种载体。如图8所示，对2个pHellsgate2-FaNRT1.1和2个pHellsgate2转基因毛状根提取DNA，进行PCR检测，均检测到载体特异目的条带。选用图9所示的1个pHellsgate2和2个pHellsgate2-FaNRT1.1，检测草莓硝酸盐代谢路径相关基因和相关硝酸盐转运蛋白基因的相对表达情况(图10A-G)，以及草莓毛状根对15N的转运情况(图10H-I)。FaNRT1.1的沉默表达使得干扰表达转基因毛状根中FaNRT1.1和FaNRT1.2基因的表达量显著降低，转运较少的硝酸盐，使毛状根系和地上部中15N的含量均极显著降低。硝酸盐代谢路径上的FaNIA、FaNIR、FaGLN、FaGLU和FaGDH基因表达也随之显著降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：转基因菌液制备：用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD600= 0.2~0.4，富集菌液，离心后用含有乙酰丁香酮的侵染液轻柔重悬，得到侵染菌液；
S2：侵染：采用步骤S1中得到的侵染菌液对盆栽草莓进行草莓匍匐茎活体注射；
S3：毛状根诱导：对步骤S2中经过活体注射后的草莓苗用湿棉花保湿，用黑塑料布覆盖，暗培养3d，得到毛状根；
所述步骤S2中草莓匍匐茎活体注射是采用侵染菌液在2~3幼叶小苗的匍匐茎上端0.5~1cm内进行草莓匍匐茎活体注射；
所述步骤S2中活体注射的侵染菌液OD600为1；
所述步骤S2中草莓匍匐茎为9-12d的草莓匍匐茎；
所述草莓的品种为章姬草莓、红颜草莓或白雪公主草莓。
2.如权利要求1所述的一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1中离心的转速为5000r/min，离心时间为5min。
3.如权利要求1所述的一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1侵染液为10mmol/L的MES、10mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的乙酰丁香酮，采用灭菌水定容。
4.如权利要求1所述的一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，所述步骤S3中草莓苗注射伤口处需要用一端泡在水中的纱布覆盖保湿。
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