CN112322653B - 一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法。本发明公开的农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法包括：以毛华菊叶片为外植体，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染毛华菊叶片，而后于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；将所得共培养后的外植体于分化筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性芽；然后将毛华菊抗性芽于生根筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性植株；从毛华菊抗性植株中筛选含有所述目的DNA的阳性植株，即得到完成遗传转化的毛华菊阳性植株。本发明的方法为本源植物的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，有利于解析菊科植物复杂性状形成的分子机理，为菊花重要基因的功能解析提供参考。

Description

一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域中，一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法。
背景技术
毛华菊[Chrysanthemum vestitum(Hemsl.)Ling]是我国特产的菊科菊属多年生草本植物，茎枝上有稠密厚实的短柔毛，常见于石灰岩沙质土壤地带，比较耐寒，繁殖力强。具有较好的观赏价值，属于野生观赏植物。其主要分布在安徽、湖北、河南的丘陵地及低山区，大约在东经109-117°，北纬29.5-35°范围内，在中国的分布格局是十分清晰的点—线型分布。通过比较形态学研究和聚类分析发现，毛华菊与栽培菊花亲缘关系最近，因此提出其为参与菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)起源的重要野生种之一(戴思兰等，1998)。王文奎等对毛华菊野生资源考察中发现其存在丰富的形态变异，特别是对其舌状花形态变异的研究可以为菊花起源研究提供证据(王文奎等，1999)。樊光迅等在资源考察中发现了舌状花形态变异稳定的毛华菊株系，基于转录组分析初步筛选了可能参与瓣型调控的差异表达基因，为菊科植物舌状花形态变异机理的研究提供了线索(樊光迅，2018)。
毛华菊作为菊花的近缘野生种，其为六倍体，拥有丰富的种下形态变异，包括叶形、分枝数以及花朵形态的多样性，如舌状花形态、数目、大小、颜色等，对此进行后续研究有利于种质资源开发与利用。此外，虽然菊花的品种演化主要是人工栽培和选育的结果，但其演化和发展规律及方向与自然状态下的野生种有很大的相似性。因此，研究菊属野生种特别是菊花的近缘种的变异规律和特点可以了解菊花的品种变异的潜力和可能的方向，对指导菊花育种具有重要意义(许莹修，2005)。
目前关于毛华菊的研究比较少，其中仅涉及栽培繁殖技术、生理指标分析和耐热性基因的克隆及表达分析等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行毛华菊的遗传转化。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法，所述方法包括：
1)以毛华菊叶片为外植体，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染所述毛华菊叶片，将侵染后的毛华菊叶片于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的DNA的重组表达载体；
2)将所述共培养后的外植体于分化筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性芽；
3)将所述毛华菊抗性芽于生根筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性植株；
4)从所述毛华菊抗性植株中筛选含有所述目的DNA的阳性植株，得到完成遗传转化的毛华菊阳性植株。
上述方法中，所述毛华菊可为毛华菊CVW或毛华菊CVZ，所述毛华菊CVW在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20705，所述毛华菊CVZ在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.20706。
上述方法步骤1)中，所述侵染液可为将所述重组农杆菌悬浮于MS液体培养基中得到的液体。所述重组农杆菌可为含有所述重组表达载体的农杆菌GV3101。
所述重组表达载体为在植物表达载体pART27中插入目的DNA片段得到的重组载体。
上述方法步骤1)中，所述侵染液的浓度可满足OD600值为0.6。所述侵染的时间可为10分钟。
上述方法步骤1)中，所述共培养的时间可为3天。
上述方法中，所述共培养培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基，所述溶质及其在所述共培养培养基中的浓度分别为萘乙酸1mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，pH值为6。
所述分化筛选培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基，所述溶质及其在所述分化筛选培养基中的浓度分别为萘乙酸1mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L以及相应浓度的抗生素，pH值为6。
在本发明的一个实施例中，所述分化筛选培养基中相应浓度的抗生素分别为卡那霉素4mg/L、羧苄青霉素300mg/L。
所述生根筛选培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1/2MS培养基，所述溶质及其在所述生根筛选培养基中的浓度分别为萘乙酸0.2mg/L以及相应浓度的抗生素，pH值为6。
所述1/2MS培养基为将MS培养基的除蔗糖外的其他溶质减半得到的培养基。
在本发明的一个实施例中，所述生根筛选培养基中相应浓度的抗生素分别为卡那霉素8mg/L、羧苄青霉素300mg/L。
上述方法中，所述共培养的条件可为：黑暗，培养温度(21±1)℃。
步骤2)中所述培养的条件可为：光照强度为3000lx，光周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，温度(21±1)℃。
步骤3)中所述培养的条件可为：光照强度为3000lx，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，培养温度为(21±1)℃。
上述方法还可包括利用所得完成遗传转化的毛华菊阳性植株获得再生植株。
获得再生植株可采用所述完成遗传转化的毛华菊阳性植株的茎段进行培养实现。具体的，获得再生植株可将所述完成遗传转化的毛华菊阳性植株的叶片或茎段依次进行愈伤组织诱导培养、不定芽分化培养、生根培养实现。
所述愈伤组织诱导培养可在愈伤组织诱导培养基中进行，所述愈伤组织诱导培养基为向MS培养基中添加NAA和6-BA得到的培养基，其中NAA浓度为1mg/L，6-BA浓度为2mg/L。
所述不定芽分化培养可在不定芽分化培养基中进行，所述不定芽分化培养基为向MS培养基中添加NAA和6-BA得到的培养基，其中NAA浓度为1mg/L，6-BA浓度为2mg/L。
所述生根培养可在生根培养基中进行，所述生根培养基为向MS培养基中添加NAA得到的培养基，其中NAA浓度为0.2mg/L。
本发明还提供了一种成套培养基，所述成套培养基包括所述共培养培养基、所述分化筛选培养基和生根筛选培养基。
所述成套培养基可用于农杆菌介导的毛华菊遗传转化。
所述成套培养基可仅由所述共培养培养基、所述分化筛选培养基和生根筛选培养基组成，还可以由所述共培养培养基、所述分化筛选培养基和生根筛选培养基以及用于制备毛华菊再生植株的培养基组成。
所述用于制备毛华菊再生植株的培养基可为所述愈伤组织诱导培养基、所述不定芽分化培养基和/或所述生根培养基。
本发明还提供了所述农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法在培育毛华菊品种/品系中的应用；
或，所述成套培养基在毛华菊遗传转化中的应用；
或，所述成套培养基在制备毛华菊遗传转化产品中的应用；
或，所述成套培养基在培育毛华菊品种/品系中的应用；
或，所述成套培养基在制备培育毛华菊品种/品系产品中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述农杆菌为农杆菌菌株GV3101。
本发明农杆菌介导的毛华菊遗传转化体系的构建方法具有以下优点：
1、本发明以甘菊花对称性关键基因ClCYC2c为例，以pHANNIBAL(Amp+)作为中间载体，pART27(Kana+)作为植物表达载体，提供了一种植物RNAi载体的构建办法，可为植物RNAi载体构建提供技术参考。
2、本发明所述的植物表达载体中，由于含有卡那霉素抗性基因、CaMV35S启动子等，便于后期通过卡那霉素筛选生根植株，并利于从分子水平上进行检测，二者结合准确可靠。
3、本发明在毛华菊高效再生体系的基础上，对植物表达载体最常用的标记基因之一，卡那霉素基因进行梯度筛选。即设置不同质量浓度的卡那霉素，对毛华菊叶片愈伤组织诱导及不定芽分化、不定芽生根的卡那霉素临界值进行试验，最终筛选出叶片分化和不定芽生根的卡那霉素临界值分别是4mg/L和8mg/L。
4、本发明提供了一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化的技术体系，这也是首次报道的关于毛华菊遗传转化的办法。即以毛华菊叶片为外植体，不经预培养，菌液浓度OD600值0.6，侵染时间为10min，共培养3天为最适转化体系。
本发明首先成功建立起一种高效诱导毛华菊叶片再生植株的方法，本发明的方法具有愈伤组织诱导率高、不定芽分化率高、生根率高，且再生周期短等优点，因此毛华菊可以作为菊科植物遗传育种研究的好材料，进行基础生物学研究，从而解析菊科一些生物学现象或助力品种改良等。同时，本发明在建立毛华菊叶片再生体系的基础上，建立了毛华菊叶片高效的遗传转化体系，为后期开展毛华菊转基因研究提供技术支持。毛华菊遗传转化体系的建立，为本源植物的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，有利于解析菊科植物复杂性状形成的分子机理，为菊花重要基因的功能解析提供参考。
生物材料保藏说明
分类命名：毛华菊(Chrysanthemum vestitum)
菌株编号：CVW
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2020年09月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20705
生物材料保藏说明
分类命名：毛华菊(Chrysanthemum vestitum)
菌株编号：CVZ
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2020年9月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20706
附图说明
图1是毛华菊初代培养的无菌幼苗。
图2是刚接种到愈伤诱导培养基培养的毛华菊叶片。
图3是愈伤组织诱导过程中切口边缘膨大的毛华菊叶片(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图4是毛华菊叶片在黑暗条件下诱导生成的愈伤组织(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图5是毛华菊叶片愈伤组织转移到光照条件下，不定芽诱导过程中产生的芽点(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图6是毛华菊不定芽长至0.5cm的不定芽(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图7是接入生根培养基时的毛华菊不定芽(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图8是接入生根培养基25天后的生根情况(左图为CVZ株系，右图为CVW株系)。
图9不定芽移栽后的毛华菊小苗。
图10是移栽后开花的毛华菊。
图11是自定义外植体的褐化程度。从左至右依次为一级褐化、二级褐化和三级褐化。
图12是植物RNAi表达载体pART27-2ClCYC2c示意图。
图13是转基因毛华菊CVW株系的筛选流程(注：A-B.农杆菌侵染毛华菊叶盘及共培养；C.叶片诱导愈伤组织；D.愈伤组织分化不定芽；E.转基因毛华菊不定芽生根；F-G.转基因苗移栽20天时植株生长状况)。
图14是ClCYC2c-RNAi载体转化毛华菊PCR检测(注：M表示Marker V，条带大小从上到下依次是2000、1500、1000、700、400、200bp；CK表示野生型植株；26、28为转基因株系编号)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
本发明实施例中所得数据采用Microsoft Excel 2013和SPSS21.0软件，进行方差分析与多重比较(LSD检验，P＝0.01或P＝0.05)，百分数经反正弦(y＝arcsin x1/2)转换后再进行分析和比较。
1、毛华菊材料：发明人2015年在河南省南阳市内乡县野外资源调查时发现的重要野生资源毛华菊(Chrysanthemum vestitum)CVW和毛华菊(Chrysanthemum vestitum)CVZ。
毛华菊(Chrysanthemum vestitum)CVW具有平瓣特征，已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20705，以下简称为毛华菊CVW。
毛华菊(Chrysanthemum vestitum)CVZ具有混合瓣特征，已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20706，以下简称为毛华菊CVZ。
下述实施例中的毛华菊材料为继代培养30-35天的毛华菊。
2、试剂和菌株
中间载体pHANNIBAL(Wei,Q.,Ma,C.,Xu,Y.et al.Control of chrysanthemumflowering through integration with an aging pathway.Nat Commun 8,829(2017)，https://doi.org/10.1038/s41467-017-00812-0)，经中国农业大学高俊平老师同意后，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
植物表达载体pART27(Wei,Q.,Ma,C.,Xu,Y.et al.Control of chrysanthemumflowering through integration with an aging pathway.Nat Commun 8,829(2017)，https://doi.org/10.1038/s41467-017-00812-0)，经中国农业大学高俊平老师同意后，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
农杆菌菌株GV3101：北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
3、培养基的配制：
(1)初代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L,蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L，pH值为6。
(2)继代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L,蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L，pH值为6。
(3)愈伤组织诱导培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L、萘乙酸(NAA)0.5-2.0mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.0-3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L，pH值为6。
(4)不定芽分化培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L、萘乙酸(NAA)0.5-2.0mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.0-3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L，pH值为6。
叶片分化的卡那霉素筛选培养基为向最佳愈伤组织诱导培养基(NAA浓度为1mg/L，6-BA浓度为2mg/L)中添加卡那霉素得到的培养基，其中卡那霉素的浓度为0、3、4、5、10或15mg/L。
(5)生根培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基2.18g/L、萘乙酸0-0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L，pH值为6。
生根的卡那霉素筛选培养基为向最佳生根培养基(萘乙酸的浓度为0.2mg/L)中添加卡那霉素得到的培养基，其中卡那霉素的浓度为0、2、3、5、8、10或15mg/L。
(6)预培养培养基，同愈伤组织诱导培养基，其中，NAA的浓度为1.0mg/L，6-BA的浓度为2.0mg/L。
(7)共培养培养基，同预培养培养基。
(8)分化筛选培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L、萘乙酸1.0mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L、卡那霉素4mg/L、羧苄青霉素300mg/L，pH值为6。
(9)生根筛选培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基2.18g/L、萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.8g/L、卡那霉素8mg/L、羧苄青霉素300mg/L，pH值为6.0。
(10)MS液体培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为MS基本培养基4.43g/L、蔗糖30g/L，pH值为5.8-6.0。
其中，MS基本培养基(MSP09)为CAISSON(美国)公司产品。
实施例1、毛华菊再生植株的制备
1、无菌幼苗初代培养
将幼嫩的毛华菊外植体(顶芽)用洗洁精清洗，后置于广口瓶中，盖纱布流水冲洗3h，在体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液中浸泡30s，用无菌水冲洗3-4次，再用有效氯含量为2％的次氯酸钠溶液消毒10min(消毒时间视外植体幼嫩程度而定，最少8min)，用无菌水冲洗3-4次，得到消毒后的毛华菊顶芽，放在无菌干燥的滤纸上吸干表面水分，备用；
将消毒后的毛华菊顶芽接种于初代培养基上，在光照强度为3000lx，16小时光照/8小时黑暗条件下进行无菌幼苗的初代培养，培养温度(21±1)℃，培养时间为35-40天。此阶段无菌幼苗长势良好，其茎节间伸长，叶片完全张开，根系生长旺盛(如图1所示)。后将初代培养所得无菌幼苗按茎段繁殖方式，在超净工作台内将茎段作为外植体按照上述方法进行继代扩繁，每次接种30瓶，每瓶接种2株，获得的无菌幼苗用于后续毛华菊叶片再生试验。
2、愈伤组织诱导培养
在超净工作台中用手术刀将毛华菊叶片切成0.5cm x 0.5cm的小块，分别接种于愈伤组织诱导培养基中，在黑暗条件下进行愈伤组织诱导培养(如图2)，培养温度(21±1)℃，其中，愈伤组织诱导培养基中所用NAA浓度为1mg/L，6-BA浓度为2mg/L，外植体接种5天时，叶片切口边缘开始膨大，形成愈伤组织(如图3)，愈伤组织颜色为淡黄绿色，质地疏松，大小一致，培养14-16天后，统计愈伤组织诱导率，数据分析结果见表1。
在愈伤组织诱导培养过程中每次处理接种毛华菊叶片6瓶，每瓶接种8块外植体，重复处理3次。
愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100％。
3、不定芽分化培养
将诱导形成的淡黄色、质地疏松的愈伤组织转接到不定芽分化培养基(NAA浓度为1mg/L，6-BA浓度2mg/L中，进行不定芽分化培养，培养温度为(21±1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下分化培养30天，其中，不定芽分化培养每12天继代一次，即将愈伤组织培养12天之后取出，置于另一新鲜的不定芽分化培养基中继续进行不定芽的分化培养，以降低植物体内的激素浓度，防止产生不定芽过细、节间过短或玻璃化等现象，重复操作2-3次；在不定芽分化培养过程中愈伤组织由淡黄色变为浅绿色或深绿色(如图4)，质地较为致密，表面粗糙逐渐分化出不定芽点(如图5)，随后不定芽长至0.5cm(图6)，再逐渐长成小芽丛(如图7)，40天后统计并计算不定芽分化率和平均每外植体分化不定芽数，结果见表2。
在不定芽分化培养过程中每次处理接种毛华菊愈伤组织40个，重复处理3次。
不定芽分化率(％)＝分化不定芽的外植体总数/接种的外植体总数×100％。
平均每外植体分化不定芽数＝分化不定芽总数/分化不定芽的外植体总数
4、生根培养
将长度为1.2-1.5cm的毛华菊不定芽在超净工作台中用手术刀分离后，接种于生根培养基中，进行生根培养，其中，组织培养温度为(21±1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗；不定根的生根培养基中所用NAA浓度为0.2mg/L；生根培养15天后不定根长至1.2-1.5cm，不定根较粗短，根系上布满根毛(如图8)，有利于毛华菊不定芽吸收养分，25天后统计不定芽的生根数、根长、生根率，并观察根系生长状态，结果见表3。
在生根培养过程中每次处理接种10瓶，每瓶接种2株，重复处理3次。
生根率(％)＝生根的外植体数目/接种的外植体的数目×100％。
5、炼苗、移栽
待生长健壮的无菌苗的不定根长至1.2-1.5cm时，打开瓶盖，将其在组培室中炼苗1天后，取出植株，并用流水洗去根部残留的培养基，移栽到装有泥炭、蛭石、珍珠岩的无土栽培基质中，泥炭、蛭石、珍珠岩的重量配比为1：1：1，在气候室内，于(20±1)℃下，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为50-80％下进行培养，培养15天后，统计移栽成活率，达到100％(图9)，植株生长健壮，培养1个月后，移至光周期为12小时光照/12小时黑暗条件下进行培养，直至毛华菊开花(图10)。
实施例2
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA0.5mg/L和6-BA 1.0mg/L，并将生根培养基中NAA的浓度替换为0.5mg/L，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数、生根数、根长、生根率，并观察根系生长状态，结果见表1-3。
实施例3
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA0.5mg/L和6-BA 2.0mg/L，并将生根培养基中NAA的浓度替换为0(即不含NAA)，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数、生根数、根长、生根率，并观察根系生长状态，结果见表1-3。
实施例4
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA0.5mg/L和6-BA 3.0mg/L，并将生根培养基中NAA的浓度替换为0(即不含NAA)，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
实施例5
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA1.0mg/L和6-BA 1.0mg/L，生根培养基的配方同实施例1，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
实施例6
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA1.0mg/L和6-BA 3.0mg/L，生根培养基的配方同实施例1，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
实施例7
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA2.0mg/L和6-BA 1.0mg/L，生根培养基的配方同实施例1，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
实施例8
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA2.0mg/L和6-BA 2.0mg/L，生根培养基的配方同实施例1，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
实施例9
按照实施例1的方法，将愈伤组织诱导培养基中NAA与6-BA的浓度分别替换为NAA2.0mg/L和6-BA 3.0mg/L，生根培养基的配方同实施例1，其它步骤均不变，分别统计毛华菊再生植株培养过程中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均每外植体分化不定芽数，结果见表1、2。
表1毛华菊叶片愈伤组织诱导结果
Figure BDA0002786463190000101
Figure BDA0002786463190000111
注：同一列间进行LSD显著性检验，小写字母不同表示在P＝0.05水平上存在显著差异。
由表1结果表明：本发明添加了NAA和6-BA的培养基对愈伤组织的诱导，增殖效果明显；采用毛华菊叶片作为外植体诱导形成愈伤组织过程中，两个株系的愈伤组织诱导率都很高，出愈率均达到95％以上；诱导形成的愈伤组织颜色为淡黄绿色，质地疏松，大小一致，愈伤组织生长状态良好，分化能力强，利于不定芽的分化。
表2毛华菊不定芽分化结果
Figure BDA0002786463190000112
注：同一列间进行LSD显著性检验，小写字母不同表示在P＝0.05水平上存在显著差异。
由表2结果表明：本发明的不定芽诱导分化培养过程中，每12-15天进行继代转接培养一次，降低了毛华菊愈伤组织诱导不定芽分化培养过程中激素浓度，不定芽生长茁壮，分化效率高，且无玻璃化、无褐化等现象。其中较优方案CVZ株系分化率达到87.50-91.67％，平均每个外植体产生不定芽数达到2.31-4.34个，CVW株系分化率达到87.50-100％，平均每个外植体产生不定芽数达到2.21-3.59个。实施例1为最优方案，下文据实施例1的方法进行进一步实验。
表3毛华菊不定芽生根结果
Figure BDA0002786463190000121
注：同一列间进行LSD显著性检验，小写字母不同表示在P＝0.05水平上存在显著差异。
由表3结果表明：
1、本发明中毛华菊不定芽在添加植物生长调节剂NAA的1/2MS培养基中的生根率高，其中CVZ达到100％，生根数可达到2.03-2.13条，根长达到2.95-5.11cm；CVW达到95％以上，生根数可达到1.96-2.04条，根长达到4.37-7.65cm；两个株系均在生根培养基中NAA浓度为0.2mg/L时的生根效果最好。
2、本发明的毛华菊在不定芽生根培养基生长所形成的根系较健壮，且根系上均布满根毛，从而增加了根的吸收面积，有利于毛华菊不定芽对营养成份的吸收。
实施例10
以毛华菊CVZ株系为例，除愈伤组织诱导和不定芽分化过程中不更换相同的新鲜培养基(即不继代)外，其它均与实施例1相同，统计外植体褐化情况，结果见表4。毛华菊愈伤组织培养40天时，对外植体的褐化情况进行统计，自定义外植体褐化程度的分级标准：一级褐化，褐化面积占叶盘总面积的1/4-1/3；二级褐化，褐化面积占叶盘总面积的1/3-1/2；三级褐化，褐化面积超过叶盘总面积的1/2(图11)。其中，褐化率＝各级褐化的叶盘数/同一处理中未污染的叶盘总数×100％。未污染的叶盘是指未长菌的叶盘。
表4更换培养基对毛华菊CVZ外植体褐化的影响
试验 一级褐化(％) 二级褐化(％) 三级褐化(％)
实施例1 66.32±2.80 4.02±1.71 0
实施例10 36.10±2.40 30.05±0.71 35.00±1.71
注：以自定义外植体褐化程度的分级标准进行统计。
由表4结果表明：本发明的愈伤组织诱导和不定芽分化培养过程中，每12-15天进行继代转接培养一次，相较于未更换过培养基的外植体相比，可有效降低毛华菊外植体的褐化程度，更有利于毛华菊不定芽的分化。
实施例11、毛华菊的遗传转化
本实施例所用毛华菊为实施例1中利用毛华菊CVW所得的无菌组培苗。
一、毛华菊卡那霉素敏感性试验
(1)叶片分化的卡那霉素筛选
在超净工作台中用手术刀将毛华菊叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，叶片表面及边缘划伤，分别接种于不同质量浓度的叶片分化的卡那霉素筛选培养基中，进行叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的卡那霉素临界值筛选。其中，叶片分化的卡那霉素筛选培养基中所用NAA为1mg/L，6-BA为2mg/L，培养温度(21±1)℃。叶片愈伤组织诱导阶段为黑暗条件，培养14-16天；后为不定芽分化阶段，将愈伤组织转至日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养30天，且不定芽分化培养每12天继代一次。
在叶片愈伤组织诱导培养过程中，每次处理接种毛华菊叶片20块，重复处理3次；不定芽分化培养中，将每次处理诱导出的愈伤组织全部接种，重复处理3次，进行数据统计和分析。
愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100％。
不定芽分化率(％)＝分化不定芽的外植体总数/接种的外植体总数×100％。
不同卡那霉素浓度下培养30天的结果见表5。试验发现，毛华菊叶片在卡那霉素浓度为4mg/L时，生长完全受到抑制。继续培养至40天后几乎全部白化，不形成愈伤组织，不定芽分化率为0，所以叶片分化的卡那霉素适宜浓度为4mg/L。
表5卡那霉素浓度对毛华菊叶片及愈伤组织的影响
Figure BDA0002786463190000131
Figure BDA0002786463190000141
注：1.同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
2.不定芽分化率的统计时，统计的为培养30天时芽高于或等于5mm的不定芽。
(2)不定芽生根的卡那霉素筛选
在超净工作台中，将长度为1.0-1.2cm的无菌苗叶片分化的不定芽用手术刀分离，除去基部多余的愈伤组织，接种于不同卡那霉素浓度的生根卡那霉素筛选培养基，每个培养基中接种2-3个不定芽，每个梯度设20瓶培养基。其中，萘乙酸的浓度为0.2mg/L。重复3次试验，培养35天观察不定芽的生根情况。其中，生根培养温度为(21±1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
在生根培养过程中每次处理接种10瓶，每瓶接种2株，重复处理3次。
生根率(％)＝生根的外植体数目/接种的外植体的数目×100％。
不同卡那霉素浓度下培养35天的结果见表6。试验发现，对照组(即未添加卡那霉素的生根培养基)在第7天时开始生根。卡那霉素浓度大于8mg/L时，培养至60天均未见生根迹象。卡那霉素浓度为8mg/L时，在第20天开始生根，在第25天时生根数量增多且增粗，在第30天时根部生长缓慢，在第35天时生长趋于停滞状态，在第38天时根系开始萎缩，且由白色变为褐黄色，不能正常生长。因此，毛华菊不定芽生根的卡那霉素浓度临界值为8mg/L。
表6不同卡那霉素浓度对毛华菊不定芽生根的影响
Figure BDA0002786463190000142
Figure BDA0002786463190000151
注：同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
二、试验因素对毛华菊叶片遗传转化的影响
1、侵染液的制备
(1)重组菌的制备：
植物RNAi表达载体pART27-2ClCYC2c的构建：
以SEQ ID NO.1所示的甘菊ClCYC2c基因的3’UTR区230bp特异性片段作为RNA干扰片段，采用软件primer 5.0软件设计扩增RNA干扰片段的引物，并根据中间载体pHANNIBAL上正、反向片段插入的酶切位点，分别在上游和下游引物的5’端添加Xho I/Kpn I位点和Cla I/Xba I位点，并在酶切位点上游添加保护碱基(表7)。以甘菊舌状花和管状花的cDNA混样为模板，分别利用Ri-CYC2c-F1和Ri-CYC2c-R1组成的引物对以及Ri-CYC2c-F2与Ri-CYC2c-R2组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物分别记为PCR产物1和PCR产物2。
将PCR产物1利用Xho I和Kpn I进行双酶切，将所得目的片段与中间载体pHANNIBAL利用Xho I和Kpn I进行双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pHANNIBAL-1；将PCR产物2利用Xba I和Cla I进行双酶切，将所得目的片段与pHANNIBAL-1利用Xba I和Cla I进行双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pHANNIBAL-2ClCYC2c；
再利用Xho I和Xba I分别酶切pHANNIBAL-2ClCYC2c载体和植物表达载体pART27，回收pHANNIBAL-2ClCYC2c载体中内含子区段连接正向和反向插入的ClCYC2c干扰片段的DNA片段以及pART27酶切后所得载体骨架，连接这两个片段，所得序列正确的重组载体即为受控于CaMV35S启动子的双元植物表达载体pART27-2ClCYC2c(图12)。
所用引物如表7所示。
表7、ClCYC2c RNAi表达载体构建所用的引物信息
引物名称 引物序列(5'-3') 酶切位点
Ri-CYC2c-F1 CCG<u>CTCGAG</u>TTGGTCAGGATCATTGTTC Xho I
Ri-CYC2c-R1 GG<u>GGTACC</u>AAGCTTAAGGTCGCTGTAG Kpn I
Ri-CYC2c-F2 GC<u>TCTAGA</u>TTGGTCAGGATCATTGTTC Xba I
Ri-CYC2c-R2 CC<u>ATCGAT</u>AAGCTTAAGGTCGCTGTAG Cla I
注：下划线表示酶切位点所在位置。
将构建成功的双元植物表达载体pART27-2ClCYC2c导入农杆菌菌株GV3101中，得到重组菌GV3101/pART27-2ClCYC2c。
(2)将步骤(1)所得重组菌GV3101/pART27-2ClCYC2c接种于5ml含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220rpm暗培养约16小时；再按照1:100的体积比转接到含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm暗培养，直至OD600达0.2-0.8。
(3)步骤(2)完成后，将所得菌液离心，弃上清液，收集菌体，将所得菌体重悬于MS液体培养基中，使OD600值为0.2-0.8，得到侵染液。
2、毛华菊叶片的遗传转化
(1)预培养对毛华菊叶片遗传转化的影响
预培养：以培养30-35天的毛华菊无菌苗为试材，选取充分展开、叶片厚实、生长均匀一致的幼嫩叶片，切取0.5cm×0.5cm叶盘，接种到预培养培养基上进行预培养，设置0d、1d、2d、3d共4个预培养时间，培养结束得到预培养的叶片。
侵染：利用步骤1所得侵染液(OD600值为0.6)侵染上述预培养的叶片，侵染时间为10min，侵染结束得到侵染后的叶片。
共培养：将所得侵染后的叶片于共培养培养基中黑暗下共培养2天，培养温度(21±1)℃，培养结束得到共培养后的叶片。
筛选：将共培养后的叶片于分化筛选培养基中进行培养，培养条件为：日光灯光源，光照强度为3000lx，光周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，温度(21±1)℃。培养期间每隔10-12天更换至相同配方的新鲜培养基中，直至得到分化出的不定芽(即抗性芽)，表8中显示为筛选培养40天的情况。
生根：将筛选后的愈伤组中分化出的不定芽转移至生根筛选培养基中进行生根培养，培养温度为(21±1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗；培养结束获得生长有不定根的毛华菊幼苗。
炼苗、移栽：
待生长健壮的无菌苗的不定根长至1.2-1.5cm时，打开瓶盖，将其在组培室中炼苗1天后，取出植株，并用流水洗去根部残留的培养基，移栽到装有泥炭、蛭石、珍珠岩的无土栽培基质中，泥炭、蛭石、珍珠岩的重量配比为1：1：1，在气候室内，于(20±1)℃下，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为50-80％下进行培养，即获得毛华菊幼苗(即抗性植株)。
在相同的菌液浓度和侵染时间、相同的共培养时间下进行转化培养，40天后通过统计和比较不同处理的抗性芽获得率，确定最佳预培养时间。
经过不同时间的预培养，转化率与愈伤组织形成状态上有明显差别。适当的预培养有利于提高外源基因的瞬时表达，促进细胞分裂，而分裂状态的细胞更容易整合外源DNA，对于植物的遗传转化具有重要的意义，尤其是一些对农杆菌侵染较为敏感的植物材料，一定时间的预培养可明显提高转化效率。但过长时间的预培养则会造成伤口愈合，不利于农杆菌转化，同时会导致植株褐化和玻璃化。试验发现，预培养0天，即不经过预培养的叶片，毛华菊愈伤组织在生长后期状态最好，褐化率和玻璃化率均最低，大部分愈伤组织可以正常分化不定芽，愈伤组织诱导率和不定芽分化率均较高，分别是96％和65.10％(表8)。因此，在毛华菊叶片遗传转化体系建立中，不经预培养效果最好。
抗性芽获得率(％)＝分化抗性芽的外植体总数/接种的外植体总数×100％。
褐化率(％)＝褐化的叶盘数/同一处理中未污染的叶盘总数×100％。
玻璃化率(％)＝发生玻璃化的外植体总数/接种的外植体总数×100％。
表8、预培养时间对毛华菊叶片转化率的影响
Figure BDA0002786463190000171
注：同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
(2)侵染液浓度与侵染时间对毛华菊叶片遗传转化的影响
按照步骤(1)的侵染、共培养、筛选、生根、炼苗、移栽的方法，不经预培养，检测不同侵染液浓度对毛华菊叶片遗传转化的影响。侵染液OD600值设置为0.2、0.4、0.6、0.8。侵染时间10min，共培养2d。
然后按照步骤(1)的侵染、共培养、筛选、生根、炼苗、移栽的方法，不经预培养，检测不同侵染时间对毛华菊叶片遗传转化的影响。侵染液时间设置为5、8、10、15min。侵染液OD600值为0.6，共培养2d。
结果表明，在不经预培养时间，侵染时间10分钟，共培养2天的情况下，随着菌液浓度的升高，愈伤组织诱导率有一定波动下降趋势，特别是菌液OD600值达到0.8时，农杆菌污染严重，不定芽分化率均显著降低，仅为41％，而褐化率和玻璃化率无明显变化(表9)。在不经预培养，菌液浓度OD600值为0.6，共培养2天的情况下，随着侵染时间的延长(5-10min)，愈伤组织诱导率和不定芽分化率均呈一定上升趋势，但当时间过长(15min)，不利于不定芽的生成，外植体褐化率显著上升(表10)。综上，当OD600值为0.6、侵染时间为10min时，毛华菊叶片不仅不定芽分化率高，且农杆菌不产生污染。因此将农杆菌的菌液浓度确定为OD600值为0.6，侵染时间为10min。
表9、侵染液浓度对毛华菊叶片转化率的影响
Figure BDA0002786463190000181
注：同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
表10、侵染时间对毛华菊叶片转化率的影响
Figure BDA0002786463190000182
注：同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
(3)共培养染时间对毛华菊叶片遗传转化的影响
按照步骤(1)的侵染、共培养、筛选、生根、炼苗、移栽的方法，不经预培养检测不同共培养时间对毛华菊叶片遗传转化的影响。共培养时间设置为1d、2d、3d、4d。侵染液OD600值为0.6，侵染时间10min。
毛华菊叶片不经预培养，在相同的菌液浓度、相同侵染时间侵染后，分别进行1d、2d、3d、4d的共培养，发现不同的共培养时间对抗性芽形成以及转化效率有很大影响(表11)。试验发现，随共培养时间的延长，出芽外植体的数目增多，3天时的抗性芽生成率最高，达到81.13％。而当共培养时间为4天时，则农杆菌过度生长，特别在伤口处有明显的菌丝或白色斑点状菌落，外植体细胞受毒害，抗性芽生成率明显降低为34.17％。因此，毛华菊叶片遗传转化共培养时间3天最佳，即没有明显农杆菌菌落出现即可。
表11、共培养时间对毛华菊叶片转化率的影响
Figure BDA0002786463190000191
注：同一列间进行LSD显著性检验，同列中不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)。
(4)毛华菊叶片最佳遗传转化体系的获得
以毛华菊叶片为外植体，通过上述因素筛选试验，最终建立毛华菊遗传转化体系是：不经预培养，菌液浓度OD600值0.6，侵染时间10分钟，共培养3天为最佳转化体系。具体流程(如图13)如下：
侵染：以培养30-35天的毛华菊无菌苗为试材，选取充分展开、叶片厚实、生长均匀一致的幼嫩叶片，切取0.5cm×0.5cm叶盘，利用步骤1所得侵染液(OD600值为0.6)侵染上述叶片，侵染时间为10min，侵染结束得到侵染后的叶片。
共培养：将所得侵染后的叶片于共培养培养基中黑暗下共培养3天，培养温度(21±1)℃，培养结束得到共培养后的叶片。
筛选：将共培养后的叶片于分化筛选培养基中进行培养，培养条件为：日光灯光源，光照强度为3000lx，光周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，温度(21±1)℃。培养期间每隔10-12天更换至相同配方的新鲜培养基中，直至得到分化出的不定芽(即抗性芽)。
生根：将筛选后的愈伤组中分化出的不定芽转移至生根筛选培养基中进行生根培养，培养温度为(21±1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗；培养结束获得生长有不定根的毛华菊幼苗。
炼苗、移栽：
待生长健壮的无菌苗的不定根长至1.2-1.5cm时，打开瓶盖，将其在组培室中炼苗1天后，取出植株，并用流水洗去根部残留的培养基，移栽到装有泥炭、蛭石、珍珠岩的无土栽培基质中，泥炭、蛭石、珍珠岩的重量配比为1：1：1，在气候室内，于(20±1)℃下，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为50-80％下进行培养，即获得毛华菊幼苗(即抗性植株)。
3、转基因植株的获得
利用步骤2中(4)的毛华菊CVW叶片最佳遗传转化体系以及步骤1的侵染液进行毛华菊的遗传转化，共获得216株抗性植株(图13中F和G)。
4、PCR检测抗性植株
提取步骤3所得部分抗性植株(52株)叶片总DNA，通过PCR扩增检测目的基因表达情况，以野生型毛华菊CVW作为阴性对照。所用引物为35S：GACGCACAATCCCACTATCC和Ri-CYC2c：CAAGCAGATTGGAATTTCTA。
所得PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳部分结果如图14所示。其中编号为26、28的两株抗性植株扩增出792bp的目的条带，而作为阴性对照的野生型植株则无此条带。根据PCR检测结果确定成功转入pART27-2ClCYC2c载体的毛华菊阳性株系为编号26、28的两株抗性植株，转基因率约为3.85％。
5、阳性植株的继代培养
将步骤4中PCR检测获得的阳性株系，按实施例1中茎段继代扩繁方式，获得无菌幼苗，每个阳性株系均获得超过24个植株。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ttggtcagga tcattgttcc ctttacgttt ctatatgtaa tggatgcttg attgatatga 60
agggaaacca tagagatata tgtcatttga tcttgttgta ttacattaaa gagatattca 120
ttgatctttg tgaatgagtc tagctaattg actaatagta tggtcgtatc ctgcatcttt 180
gatcatcata atgtaataat ggaaactgtt taatgactac agcgacctta agctt 235

Claims (3)

1.农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法，包括：
1）以毛华菊叶片为外植体，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染所述毛华菊叶片，将侵染后的毛华菊叶片于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的DNA的重组表达载体；所述共培养培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基，所述溶质及其在所述共培养培养基中的浓度分别为萘乙酸1 mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，pH值为6；
所述毛华菊为毛华菊CVW或毛华菊CVZ，所述毛华菊CVW在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的保藏编号为CGMCC No.20705，所述毛华菊CVZ在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的保藏编号为CGMCC No.20706；
2）将所述共培养后的外植体于分化筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性芽；所述分化筛选培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基，所述溶质及其在所述分化筛选培养基中的浓度分别为萘乙酸1 mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2 mg/L以及相应浓度的抗生素，pH值为6；
3）将所述毛华菊抗性芽于生根筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性植株；所述生根筛选培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1/2 MS培养基，所述溶质及其在所述生根筛选培养基中的浓度分别为萘乙酸0.2 mg/L以及相应浓度的抗生素，pH值为6；
4）从所述毛华菊抗性植株中筛选含有所述目的DNA的阳性植株，得到完成遗传转化的毛华菊阳性植株；
步骤1）中，所述侵染液的浓度满足OD600值为0.6；所述侵染的时间为10分钟；所述共培养的时间为3天；所述共培养的条件为：黑暗，培养温度（21 ± 1）℃；
步骤2）中所述培养的条件为：光照强度为3000 lx，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，温度（21 ± 1）℃；
步骤3）中所述培养的条件为：光照强度为3000 lx，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，培养温度为（21 ± 1）℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括利用所得完成遗传转化的毛华菊植株获得再生植株。
3.权利要求1或2所述方法在培育毛华菊品种/品系中的应用。
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