CN111944844A - 提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法,通过在颠茄中表达rolC基因或rolB有效提升TAs生物碱合成途径基因表达量，提高颠茄中的莨菪碱和山莨菪碱的含量，但会对植株表型产生变异影响；而H6H‑p组织定位表达的rolC基因rolB基因，在提高生物碱的同时，不影响植株表型生长。通过对rolC基因或rolB基因的选择控制，为进一步在颠茄的药用领域培育出高产生物碱颠茄株系奠定基础，并为进一步开展颠茄的TAs生物碱基因工程代谢研究提供一种新的方法。

Description

提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法。

背景技术

托品烷生物碱(Tropane alkaloids,TAs)是在临床上常用的一类抗胆碱药物，在镇痛、麻醉、抗晕动病、戒毒、帕金森氏病、农药中毒等治疗方面有良好的作用。目前托品烷生物碱主要从天然植物颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stramonium)、山莨菪(Anisodus tanguticus)等植物中提取，市场需求巨大，工业合成的成本较高。颠茄是被中国药典收录，主要提供托品烷生物碱的商业药源植物。2015版药典要求颠茄干草中莨菪碱含量不得低于0.3％，而野生颠茄中莨菪碱含量大约仅为干重的0.02％-0.17％，东莨菪碱含量更低，约为0.01％-0.08％，山莨菪碱含量更加微弱。因此利用代谢工程技术提高植株中的TAs含量是目前培育高产优质药源植物的一个最有效的方法。并且随着对TAs代谢途径的深入研究及基因克隆和高效遗传转化系统的发展，利用遗传代谢工程手段在植物细胞中大量生产高附加值的次生代谢产物已成为目前的研究方向和热点。

rol基因是发根农杆菌中pRi质粒上的植物发根诱导基因。White等(White F F etal，1985)通过对发根农杆菌pRiA4的T-DNA进行插入和缺失诱变实验，发现TL-DNA至少包含四个与发根诱导相关的基因位点，分别给它们命名为rol(root loci)A、rolB、rolC和rolD基因。研究发现，发根农杆菌rol基因诱导产生的植物发根往往能合成比植物体本身更高水平的次生代谢产物。在青蒿中报道，转rolB基因的青蒿显示青蒿素提升9倍，而转rolC基因的青蒿素提高了4倍。rol基因虽能在根中可促进次生代谢产物的合成，但在地上部分却有诱发植物畸形发育的副作用，Ooms等(Ooms G，1985)研究发现，尽管用Ri质粒转化的甘蓝型油菜可以开花，但不能结出种子。因此，有必要探索如何在颠茄中保留rol基因在植株中有利的一面。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，通过在颠茄中表达农杆菌rolC或rolB基因，所述农杆菌rolC基因的序列如SEQ ID NO.8所示；所述农杆菌rolB基因的序列如SEQ IDNO.9所示。

本发明中，在颠茄中过量表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法如下：克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建植物表达载体，获得含有农杆菌rolC基因或rolB基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。

本发明中，所述克隆农杆菌rolC基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQ IDNO.3与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6为引物对进行PCR扩增获得。

本发明中，所述克隆农杆菌rolB基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQ IDNO.10与SEQ ID NO.11为引物对进行PCR扩增获得。

本发明优选的，所述植物表达载体由农杆菌rolC基因或rolB基因通过BamH I和Sac I连入pBI121载体获得。

本发明优选的，通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因。

本发明优选的，所述通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法是克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建rolC基因或rolB基因定位表达载体，再将获得的rolC基因或rolB基因定位表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。

本发明优选的，rolC基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过HindIII和BamH I连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolC基因，获得rolC基因定位表达载体pH6H-p-rolC；所述H6H-p基因的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明优选的，rolB基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过HindIII和BamH I连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolB基因，获得rolB基因定位表达载体pH6H-p-rolB；所述H6H-p基因的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的有益效果在于：本发明在颠茄中表达rolC基因或rolB基因能有效提升TAs生物碱合成途径基因表达量，并且提高颠茄中的莨菪碱和山莨菪碱的含量，但会对植株表型产生变异影响；进一步通过H6H-p组织定位表达rolC基因或rolB基因，在提高生物碱的同时，不影响植株表型生长。实现对rol基因的选择控制，为进一步在颠茄的药用领域培育出高产生物碱颠茄株系，并进一步开展颠茄的TAs生物碱基因工程代谢研究提供一种新的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为颠茄遗传转化图(A：颠茄种子萌发第15d；B：第28d颠茄下胚轴快繁丛生芽；C：第30d颠茄子叶快繁丛生芽；D：颠茄转基因植株生根培养；E：室内练苗；F：室外种植转基因植株)；

图2为对照与CaMV35S-rolC转基因颠茄组培瓶时期的表型图(A1、A2、A3：WT颠茄第30d根部、顶芽、叶、茎段节间；B1、B2、B3：转pBI121空载颠茄30d根部、顶芽、叶、茎段节间；C1、C2、C3：EHA105-pCaMV35S-rolC第30d根部、顶芽、叶、茎段节间)；

图3为室内生长的CaMV35S-rolC转基因颠茄叶表型观察(A、E：野生型WT；B、F：空载转基因；C、D：AbEHA105-pCaMV35S-rolC转基因苗)。

图4为室外生长的CaMV35S-rolC转基因颠茄表型观察(A、E：野生型WT；B、F：空载转基因；C、D、G、H：EHA105-pCaMV35S-rolC转基因苗)。

图5为EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗表型生长(WT：1号；no-load transgene：2号；EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗：3号、4号)。

图6为莨菪碱和东莨菪碱标准曲线(A：莨菪碱；B：东莨菪碱)。

图7为生长2月颠茄中山莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载体转基因颠茄；C系列：CaMV35S-rolC转基因颠茄)。

图8为生长2月颠茄中莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载体转基因颠茄；C系列：CaMV35S-rolC转基因颠茄)。

图9为生长2月颠茄中山莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载转基因颠茄；H-C系列：EHA105-pH6H-p-rolC转基因颠茄)。

图10为生长2月颠茄中莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载转基因颠茄；H-C系列：EHA105-pH6H-p-rolC转基因颠茄)。

图11为EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄表型在室外生长的情况(A：WT；B：PBI121；C：EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄)。

图12为EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄进行表型(A：WT；B：PBI121；C：EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄)。

图13为EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄莨菪碱含量分析。

图14为EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄山莨菪碱含量分析。

图15为EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄莨菪碱含量分析。

图16为EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄山莨菪碱含量分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、H6H-p启动子和rolC基因片段的克隆

以颠茄DNA为模板，用合成的两条特异性引物121-H6H-F和121-H6H-R进行PCR，上游引物含有Hind III，下游含有BamH I酶切位点，具体引物序列如下：

F-H6H-121：5’-gaccatgattacgccaagcttagtcgctttaactatcttttgatg-3’(SEQ IDNO.1)；

R-H6H-121：5’-ggactgaccacccggggatccggagtaaaagtctcaaataagaaag-3’(SEQ IDNO.2)。

PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；72℃后延伸2min。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段H6H-p启动子，H6H-p全长为1100bp，具体序列如SEQ ID NO.7所示。

以C58C1菌液为模板，用特异性引物rolC-121-F和rolC-121-R、H6H-rolC-F和H6H-rolC-R分别扩增rolC全长，rolC上游引物含有BamH I，下游含有SacI酶切位点，具体引物序列如下：

H6H-rolC-F：5'-tgagacttttactccggatccgttaacatggctgaagacga-3’(SEQ IDNO.3)

H6H-rolC-R：5'-cgatcggggaaattcgagctcgactaaccattagccgattg-3’(SEQ IDNO.4)

rolC-121-F：5'-acgggggactctagaggatccgttaacatggctgaagacga-3’(SEQ IDNO.5)

rolC-121-R：5'-cgatcggggaaattcgagctcgactaaccattagccgattg-3’(SEQ IDNO.6)

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段rolC基因片段，rolC基因全长600bp左右，包括540bp编码框，编码180个氨基酸，起始密码子和终止密码子是ATG和TAA，具体序列如下SEQ ID NO.8所示。

atggctgaagacgacctgtgttctctctttttcaagctcaaagtggaggatgtgacaagcagcgatgagctagctagacacatgaagaacgcctcaaatgagcgtaaacccttgatcgagccgggtgagaatcaatcgatggatattgacgaagaaggagggtcggtgggccacgggctgct gtacctctacgtcgactgcccgacgatgatgctctgcttctatggagggtccttgccttacaattggatgcaaggcgcactcctcaccaaccttcccccgtaccagcatgatgtgactctcgatgaggtcaatagagggctcaggcaagcatcaggttttttcggttacgcggatcctatgcggagcgcctacttcgctgcattttctttccctgggcgtgtcatcaagctgaatgagcagatggagctaacttcgacaaagggaaagtgtctgacattcgacctctatgccagcacccagcttaggttcgaacctggtgagttggtgaggcatggcgagtgcaagtttgcaatcggctaa

切胶回收产物，分别连接中间表达载体pMD19-T-Vector，转化大肠杆菌感受态细胞经测序检测序列正确的克隆，获得pMD19-T-H6H-p、pMD19-T-rolC质粒。

实施例2、pCaMV35S-rolC、pH6H-p-rolC表达载体构建

以pBI121为植物表达载体，通过pBI121载体上的Hind III、BamH I与经同样酶切的pMD19-T-H6H-p目的片段H6H-p连接，获得pBI121-pH6H-p-GUS。再将pMD19-T-rolC经BamHI和Sac I酶切后与pBI121连接，获得pCaMV35S-rolC表达载体。将表达载体转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布到含有kan抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，挑单菌落活化4-6h左右，进行菌液PCR检测。取测序正确的DH5α-pCaMV35S-rolC可直接扩大培养，提取质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞。而测序正确的DH5α-pH6H-p-GUS则进行扩大培养后，提取质粒，对BamH I、Sac I两个酶切位点进行双酶切，回收酶切产物大骨架，与回收好的片段rolC进行连接，以H6H-p启动子为组织定位启动子与rolC基因成功进行载体构建，替换掉pBI121的CaMV35S启动子区域和GUS基因，获得rolC基因定位表达载体pH6H-p-rolC，再转化大肠杆菌感受态细胞，检验阳性菌液，送测序。结果正确的菌液扩大体积培养，提取质粒，转化EHA105农杆菌感受态细胞，分别获得工程菌EHA105-pCaMV35S-rolC和EHA105-pH6H-p-rolC。

实施例3、工程菌转化及颠茄转化

取适量测序成功的样品菌液进行活化，提取质粒，进行EHA105农杆菌感受态细胞的转化，涂布到含有对应Str、Rif、Kan三种抗性的平板上，28℃培养。48h后，挑取单菌落进行活化，利用PCR进行阳性鉴定，在600bp左右检测到rolC基因条带，检测的单菌落均有条带，转化成功，转化后的农杆菌菌液可进行下一步实验。

以颠茄子叶和下胚轴为转化对象，以EHA105为介导工程菌，侵染颠茄子叶和下胚轴，通过共培、除菌(长丛生芽)、生根培养，获取完整的颠茄转基因植株，结果如图1所示，对颠茄种子进行无菌处理后，培养一段时间后，种子萌发，并长出两片子叶，剪取子叶和下胚轴用于侵染、共培、共培结束后进行除菌培养，除菌期间子叶和下胚轴从愈伤组织长出带抗性芽点，逐渐快速生长繁殖长出丛生芽，丛生芽长2cm左右，可见幼茎和叶片，即可转到生根培养基中，转基因颠茄生根后长到6cm左右，进行阳性鉴定，检测阳性的转基因苗即可种植到室外进行练苗，练苗1月左右即可移栽到地里。

转基因颠茄中的rolC基因全长为600bp，提取转基因颠茄的基因组DNA，PCR扩增目的条带，并将PCR产物进行凝胶电泳检测，结果显示，均能检测出明亮清晰的目的条带，且在600bp左右检测到目的条带。EHA105-pCaMV35S-rolC转基因分别命名为C-1、C-3、C-5、C-7；AbEHA105-pCaMV35S-rolC转基因分别命名为H-C-1、H-C-11、H-C-29。

实施例4、转基因植株表型分析

1、EHA105-pCaMV35S-rolC转基因颠茄表型分析

检测为阳性的转基因苗，转接继代到生根培养基，组培瓶中一个月左右的生长状态如图2，CaMV35S-rolC基因的颠茄苗根、叶和节间表型生长与WT野生纯苗、空载转基因苗相比，有明显差异，CaMV35S-rolC基因的颠茄苗表现出叶片皱缩、节间缩短、主根和侧根生长茂密、茎段节间缩短、叶片皱缩且增多，甚至在组培苗培养期间提前打花苞，直至后期提前开花的现象。室内生长两个月后，分别取

利用spss统计分析软件对其叶长、叶宽、叶长宽比率、节间和单株最大叶片鲜重作单因素方差分析，结果如表1。结果显示，C-1、C-3、C-5、C-7号苗与对照组均呈现显著性差异，且叶片长宽比例明显变大；且单转rolC基因的颠茄植株出现与对照存在差异的两种表型，一种是叶片细小节间缩短，另一种是叶片皱缩节间缩短型(如图3)。颠茄苗种植到室外继续生长一个月后，表型现象更加明显(图4)，分支变多、节间缩短、高度下降，叶形向叶背卷缩变小、继续提前开花，顶端优势下降等，这与之前在其他物种中报道转rolC基因会导致节间缩短、叶片邹缩、叶型变小等性状一致。说明在颠茄中转rolC基因会对颠茄表型造成一定变异影响，并且在CaMV35S启动子驱动下变异更明显。

表1、AbEHA105-pCaMV35S-rolC转基因苗表型指标统计表

样品名称	叶长/cm	叶宽/cm	长宽比/cm	节间/cm	鲜重/g
						WT	16.5±0.7a	8.4±0.2a	1.96±0.13d	3.1±0.4a	1.775±0.114a
PBI121	16.5±1.7a	7.2±0.7b	2.28±0.09c	1.8±0.6b	1.705±0.038a
						C-1	13.0±0.5bc	4.2±0.2e	3.08±0.21a	0.8±0.3c	0.737±0.133bc
C-3	14.3±0.3b	5.3±0.1c	2.72±0.03b	1.3±0.2bc	0.855±0.027b
						C-5	12.5±0.9c	4.7±0.4cd	2.67±0.07b	0.7±0.3c	0.608±0.040c
C-7	13.0±0.9bc	4.9±0.3cd	2.67±0.06b	1.0±0.5c	0.744±0.122bc

2、EHA105-pH6H-p-rolC转基因颠茄表型分析

对EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗表型进行观察，几乎未见表型差异，种植到室外生长两个月的情况如图5，与1号和2号的WT和空载转基因苗相比较，转基因苗的表型生长无明显差异。对其叶长、宽、长宽比例、节间和单片最大叶片进行统计学分析，结果显示，除个体差异外，整体上看，转基因苗H-C-1、H-C-11、H-C-29与对照无显著差异，而H-C-2在叶长上与对照存在差异，可能是植株生长过程中，一些不可控因素造成了个体存在差异，但整体统计数据显示，对照与转基因植株之间无明显差异，鲜重检测为阳性的转基因苗，继代到生根培养基，生长一个月左右对转基因苗叶片长度、宽度、单片最大叶片鲜重以及节间高度的测量，从表2中可见，转基因与对照的叶长、叶宽、叶长宽比例、节间高度以及鲜重均无显著差异。

表2、EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗表型指标统计表

样品名称	长/cm	宽/cm	长宽比/cm	节间/cm	鲜重/g
						WT	21.5±2.0b	10.1±1.1a	2.12±0.023d	0.9±0.2bc	2.935±0.637a
PBI121	21.2±1.4b	9.2±1.1ab	2.32±0.157bc	1.1±0.2bc	2.635±0.576ab
						H-C-1	22.3±1.10b	8.1±0.9c	2.77±0.209a	0.8±0.3c	2.113±0.190b
H-C-2	25.37±1.7a	9.4±0.4ab	2.709±0.174a	1.3±0.3ab	2.608±0.190ab
						H-C-11	20.8±0.8b	8.6±0.4c	2.433±0.059b	0.9±0.2bc	2.118±0.327b
H-C-29	20.5±0.1b	9.0±0.5ab	2.270±0.122bc	1.5±0.2a	2.406±0.179ab

实施例5、转基因颠茄莨菪碱和山莨菪碱含量分析

1、莨菪碱和东莨菪碱标准曲线

以500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL浓度梯度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，用Excel软件，根据不同梯度标准品的对应的浓度和平均峰面积，计算得出莨菪碱和山莨菪碱的标准曲线和线性回归方程，标准曲线如图6所示。

莨菪碱(Scopolamine)线性回归方程如下：y＝89499x+70248，R2＝0.9997；

山莨菪碱(Anisodamine)线性回归方程如下：y＝33999x–26058，R2＝0.9999；

2、EHA105-pCaMV35S-rolC转基因颠茄莨菪碱和山莨菪碱含量分析

(1)剪取颠茄叶片，40℃烘干，磨粉，提取生物碱，利用HPCL法检测颠茄中的生物碱，统计样品峰值，根据山莨菪碱标准曲线的浓度和峰面积计算每个样品中山莨菪碱含量，检测结果如图7所示。结果显示，转基因株系C-1、C-3、C-5、C-7山莨菪碱的含量均与对照(WT、PBI121)，呈现显著性差异，转基因株系含量得到了大幅度的提高，依次为C-7>C-5>C-3>C-1，C-7的山莨菪碱含量(6.983mg/g)是野生型颠茄对照(1.534mg/g)的4.552倍、空载转基因颠茄对照(2.004mg/g)的3.485倍；初步推测山莨菪碱含量的提高可能是因为rolC基因的表达促进了代谢流向TAs方向转移。

(2)莨菪碱标准曲线计算得出莨菪碱含量，结果如图8所示。结果显示转基因株系C-1、C-3、C-5、C-7中莨菪碱的含量均高于对照，C-1莨菪碱含量最高(149.787μg/g)，高出野生型颠茄(39.588μg/g)对照的3.784倍，高出空载转基因颠茄(37.32μg/g)对照的4.014倍。

3、EHA105-pH6H-p-rolC转基因颠茄莨菪碱和山莨菪碱含量分析

对EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗的叶片进行检测，与对照相比，结果如图9所示，结果显示，H-C-1、H-C-2、H-C-11、H-C-29号转基因苗的山莨菪碱的含量均有所提升，H-C-2转基因植株山莨菪碱含量(60.379μg/g)最高，是野生型颠茄(8.538μg/g)的7.072倍，空载转基因颠茄(19.066μg/g)对照的3.167倍。

对EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗叶片莨菪碱检测结果如图10所示。结果显示，与对照相比，H-C-1、H-C-2、H-C-11、H-C-29转基因植株莨菪碱含量均提高，且H-C-1、H-C-2、H-C-11均显著高于对照；H-C-2提升效果最为明显，而H-C-29莨菪碱含量几乎和对照无明显差异，但含量均较对照，有微弱提升。

综合来看，进行组织定位的EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗同样促进了生物碱的合成，虽然在生物碱的含量提升上没有EHA105-pCaMV35S-rolC基因的植株效率高，但能促进托品烷生物碱合成的同时，不会造成地上部分产生变异，保留了rolC基因在颠茄中的有效作用，实现调控基因与合成途径基因的协同表达，最大程度和最有效地发挥调控基因的作用，为合理的在颠茄中利用rol基因提供很好的参考价值。

实施例6、转rolB基因颠茄及生物碱含量

按照实施例1～5的方法制备转rolB基因颠茄，其中rolB的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。克隆rolB基因的引物序列及rolB基因如下：

rolB-121-F:5'-acgggggactctagaggatccccaactcacatcacaatgga-3'(SEQ IDNO.10)；

rolB-121-R:5'-cgatcggggaaattcgagctcggctttaggcttctttcttc-3'(SEQ IDNO.11)；

H6H-rolB-F:5'-tgagacttttactccggatccccaactcacatcacaatgga-3'(SEQ IDNO.12)

H6H-rolB-R:5'-cgatcggggaaattcgagctcggctttaggcttctttcttc-3'(SEQ IDNO.13)

rolB的核苷酸序列：

atggatcccaaattgctattccttccacgatttcaaccagtagatctcactccagcatggagccagataaacctattcgaggggatccgatttgcttttgcaatctatagccgtgactatagcaaacccctcctgcatttccagaaacgatgggctcttgcagtgctagatttgaaggaaaactctccaccgatatatatacttaaacaactagctgagctcttgaagaacaaagtctgctatcatcctcctatgtttgttagtcagccggatctggctcgagaaaacgaccaacatgtatttgtctatctttctcgcgagaagatgcagaaagtgctgaaggaacaatccattacatttggaatggaggccgtgctggcgacaacgattcaaccatatcggagcgagctcgccctccaggagatgctccgtgttcacaaccttgcttggccgcacagccgcacggaggaacctgatttagaatgcttcatcgccattttcgcaagttccttgttcattcacttgctggagttaaaagtgaccaacgtttacgggagagaggtagcttgcaccttctttctgcggcgagggactgaaaaccgcccctatgatgttgtagcttgcggcaccacacaattcaccaaaaatgccctcgggatatcacgtccggccgcctcctcaccggagccagacctaaccctgcgactctcggggcctgatcaggaaggcgaggagggcgtcatgaagcctgctgcagtaaacctgaagaaagaagcctaa

1、EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄表型、莨菪碱和山莨菪碱含量分析

(1)莨菪碱和山莨菪碱含量分析(如图13、图14)所示。检测的两株pCaMV35S-rolB转基因颠茄的莨菪碱和山莨菪碱含量均提高，B-5转基因植株山莨菪碱含量(91.71μg/g)最高，是野生型颠茄(7.664μg/g)的11.966倍，空载转基因颠茄(19.067μg/g)对照的4.81倍。

(2)表型分析

对EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄表型进行观察，几乎未见表型差异，种植到室外生长的情况(如图11，A：WT；B:PBI121；C：EHA105-pCaMV35S-rolB转基因颠茄)，与WT和空载转基因苗相比较，转基因苗的表型生长无明显差异。对其最大叶片的长、宽、长宽比例、节间和鲜重进行统计学分析，从表3中可见，除个体差异外，整体上看，转基因苗B-1、B-5与对照无明显差异。

表3、EHA105-pCaMV35S-rolB转基因苗表型指标统计表

2、EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄莨菪碱和山莨菪碱含量分析

(1)莨菪碱和山莨菪碱含量分析(如图15、图16)所示。检测的4株pH6H-p-rolB转基因颠茄的莨菪碱与山莨菪碱含量显示，与WT和PBI121对照相比，4株转基因苗莨菪碱含量均提高。而单独与WT对照相比，山莨菪碱含量均提高，H-B-1转基因植株山莨菪碱含量(26.689μg/g)最高，是野生型颠茄(7.664μg/g)的3.482倍，空载转基因颠茄(19.066μg/g)对照的1.400倍。

(2)对EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄进行表型观察(如图12，A：WT；B：PBI121；C：EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄)，表型上与对照无差异，对植株最大叶片的长、宽、长宽比例、节间和鲜重进行统计学分析，从表4中可见，除个体差异外，整体上看，4株EHA105-pH6H-p-rolB转基因颠茄与对照无明显差异。

表4、EHA105-pH6H-p-rolB转基因苗表型指标统计表

综合来看，35S-rolB基因的颠茄植株莨菪碱和山莨菪碱均有所提高，而且提高的量比35S-rolC转基因颠茄植株稍高些，并且，表型上与对照相比未见明显差异，可能是观察的株系较少，后期研究工作考虑，继续增加株系培育，继续观察35S-rolB转基因颠茄表性变化。而进行组织定位的EHA105-pH6H-p-rolB转基因苗同样促进了生物碱的合成，虽然在生物碱的含量提升上没有CaMV35S-rolB和CaMV35S-rolC基因的植株效果好，但能促进托品烷生物碱合成的同时，保证颠茄植株正常生长，保留了rol基因在颠茄中的有效作用，为合理的在颠茄中利用rol基因提供很好的参考价值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>贵州大学

<120>提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaccatgatt acgccaagct tagtcgcttt aactatcttt tgatg 45

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactgacca cccggggatc cggagtaaaa gtctcaaata agaaag 46

<210> 3

<211> 1100

<212> DNA

<213>颠茄(Atropa belladonna)

<400> 3

cagcttagtc gctttaacta tcttttgatg agagtaaatt taagagctat cttacgacat 60

atatagtaaa tcgcatgatt aagctaacta gtgcagaatg agtaaattag aaatttctta 120

tagtagaaac actacagttg tgaaataaaa ttacaacaac tgagttcttg caagaaatat 180

attcattttg cacgtatgca tattaattaa gatataatat agatattagt ttttagagaa 240

aaggaattat gtgatatggt ggtgtaaaga tccactcata aactaaaatt taggtatgcg 300

cataatatag atattacttt ttagagaaaa ggaattatgt gatacagtgg ggctaaagat 360

ccactcataa actaaaaatg atatttaggt acgcgccttc atcgttatta gggtggtaaa 420

atttatccat aaaaatatga tttctcaatt aatttaagtt tgagcaggtc aatgactcat 480

tcatcaatta attcaatcta ctttgacctg cataattcag tccacctaat aattggattg 540

atgtgtaatt taaattgacc cgctcatttt tattaaatat gttatataga ttcatattcc 600

aatcaaactc ttaaaattga taaaagttgg atgggttgag ttatgaccta ttgtttagcg 660

tcttttgact cagtctattt caactcacgt aacatttgag ttgattaatg acttgttcat 720

ttattaactc aattctgatc tcaaattcaa cccaatctat ccattggtaa gagttaagcg 780

ggttaggttg tgatccatta tttagcccat tttaactcag ttatttatgg taattaatat 840

tttagcaggt tattgatcct ttcatttgtt aaatcataaa aaatcttatc aaaatattta 900

atacatgaat ggaggggtca ttaacgtgcc aaatttatgt agtttgagct gattatatta 960

aattaacctc aaggtactgg gtccataaca ctataaatag gcctttagct cttcatagta 1020

cattaccaaa tcttcaccat atccacaaca taatttcttt cttatttgag acttttactc 1080

ctaaaaaaca aaaaaaaatg 1100

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagactttt actccggatc cgttaacatg gctgaagacg a 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgatcgggga aattcgagct cgactaacca ttagccgatt g 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgggggact ctagaggatc cgttaacatg gctgaagacg a 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgggggact ctagaggatc cgttaacatg gctgaagacg a 41

<210> 8

<211> 543

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggctgaag acgacctgtg ttctctcttt ttcaagctca aagtggagga tgtgacaagc 60

agcgatgagc tagctagaca catgaagaac gcctcaaatg agcgtaaacc cttgatcgag 120

ccgggtgaga atcaatcgat ggatattgac gaagaaggag ggtcggtggg ccacgggctg 180

ctgtacctct acgtcgactg cccgacgatg atgctctgct tctatggagg gtccttgcct 240

tacaattgga tgcaaggcgc actcctcacc aaccttcccc cgtaccagca tgatgtgact 300

ctcgatgagg tcaatagagg gctcaggcaa gcatcaggtt ttttcggtta cgcggatcct 360

atgcggagcg cctacttcgc tgcattttct ttccctgggc gtgtcatcaa gctgaatgag 420

cagatggagc taacttcgac aaagggaaag tgtctgacat tcgacctcta tgccagcacc 480

cagcttaggt tcgaacctgg tgagttggtg aggcatggcg agtgcaagtt tgcaatcggc 540

taa 543

<210> 9

<211> 780

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggatccca aattgctatt ccttccacga tttcaaccag tagatctcac tccagcatgg 60

agccagataa acctattcga ggggatccga tttgcttttg caatctatag ccgtgactat 120

agcaaacccc tcctgcattt ccagaaacga tgggctcttg cagtgctaga tttgaaggaa 180

aactctccac cgatatatat acttaaacaa ctagctgagc tcttgaagaa caaagtctgc 240

tatcatcctc ctatgtttgt tagtcagccg gatctggctc gagaaaacga ccaacatgta 300

tttgtctatc tttctcgcga gaagatgcag aaagtgctga aggaacaatc cattacattt 360

ggaatggagg ccgtgctggc gacaacgatt caaccatatc ggagcgagct cgccctccag 420

gagatgctcc gtgttcacaa ccttgcttgg ccgcacagcc gcacggagga acctgattta 480

gaatgcttca tcgccatttt cgcaagttcc ttgttcattc acttgctgga gttaaaagtg 540

accaacgttt acgggagaga ggtagcttgc accttctttc tgcggcgagg gactgaaaac 600

cgcccctatg atgttgtagc ttgcggcacc acacaattca ccaaaaatgc cctcgggata 660

tcacgtccgg ccgcctcctc accggagcca gacctaaccc tgcgactctc ggggcctgat 720

caggaaggcg aggagggcgt catgaagcct gctgcagtaa acctgaagaa agaagcctaa 780

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgggggact ctagaggatc cccaactcac atcacaatgg a 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgatcgggga aattcgagct cggctttagg cttctttctt c 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgagactttt actccggatc cccaactcac atcacaatgg a 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgatcgggga aattcgagct cggctttagg cttctttctt c 41

Claims (9)

1.提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：通过在颠茄中表达农杆菌rolC或rolB基因，所述农杆菌rolC基因的序列如SEQ ID NO.8所示；所述农杆菌rolB基因的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：在颠茄中过量表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法如下：克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建植物表达载体，获得含有农杆菌rolC基因或rolB基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。

3.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述克隆农杆菌rolC基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6为引物对进行PCR扩增获得。

4.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述克隆农杆菌rolB基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.11为引物对进行PCR扩增获得。

5.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述植物表达载体由农杆菌rolC基因或rolB基因通过BamH I和Sac I连入pBI121载体获得。

6.根据权利要求1所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因。

7.根据权利要求6所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法是克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建rolC基因或rolB基因定位表达载体，再将获得的rolC基因或rolB基因定位表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。

8.根据权利要求7所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：rolC基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过Hind III和BamH I连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolC基因，获得rolC基因定位表达载体pH6H-p-rolC；所述H6H-p启动子的序列如SEQ ID NO.7所示。

9.根据权利要求7所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：rolB基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过Hind III和BamH I连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolB基因，获得rolB基因定位表达载体pH6H-p-rolB；所述H6H-p启动子的序列如SEQ ID NO.7所示。

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