CN113307884B - 托品酮生物合成融合蛋白及其应用和方法 - Google Patents

托品酮生物合成融合蛋白及其应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了托品酮生物合成融合蛋白及其应用和方法，托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通过连接肽连接，所述III型聚酮合酶PYKS位于连接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端；本发明利用PYKS与CYP82M3融合表达后发生相互作用，构成托品酮的代谢区室，经表达后提高了托品酮的合成效率，其效果优于PYKS和CYP82M3进行双基因共表达，或CYP82M3位于连接肽的羧基端的融合蛋白，因此该融合蛋白可用于提高托品烷生物碱合成能力，对托品烷生物碱的生产具有非常重要的意义。

Description

托品酮生物合成融合蛋白及其应用和方法
技术领域
本发明涉及代谢工程领域，具体涉及托品酮生物合成融合蛋白，还涉及托品酮生物合成融合蛋白的应用和提高托品烷生物碱的方法。
背景技术
托品烷生物碱(Tropane Alkaloid，TA)是一类具有重大医疗价值的天然抗胆碱药物，广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤。临床上常用的是莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)，市场需求十分巨大。目前TA都是从少数茄科TA资源植物中提取，包括颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Daturastramonium)和莨菪(Hyoscyamus niger)，颠茄是莨菪碱和东莨菪碱最主要的商业栽培药源，也是药典收录的TA药源植物。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02％～0.17％(干重)，东莨菪碱含量仅为干重的0.01％～0.08％。因此，培育托品烷生物碱高产药用植物一直是该行业长期追求的目标。此外，酵母合成生物学的发展为托品烷生物碱药用资源短缺提供了一种可能的解决方案，但目前TA全合成酵母菌株中，莨菪碱产量最高为80μg.L-1，东莨菪碱产量最高为30μg.L-1，远低于商业生产需求。
托品酮是莨菪碱和东莨菪碱等药用托品烷生物碱生物合成的必需前体。鸟氨酸经多步酶促反应合成N-甲基吡咯啉。N-甲基吡咯啉在III型聚酮合酶PYKS的催化下合成4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid，再被托品酮合成酶CYP82M3进一步催化合成托品酮。托品酮再经多步酶促反应合成莨菪碱和东莨菪碱等药用托品烷生物碱。已有研究表明，无论在植物代谢工程或是酵母合成生物学中，托品酮生物合成均是托品烷生物碱生物合成的关键限速步骤，极大地限制了下游药用托品烷生物碱的积累。因此，通过生物技术优化改造托品酮的生物合成步骤对药用托品烷生物碱的生产具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种托品酮生物合成融合蛋白；本发明的目的之二在于提供所述托品酮生物合成融合蛋白在提高托品烷生物碱合成能力中的应用；本发明的目的之三在于提供提高托品烷生物碱合成能力的核苷酸；本发明的目的之四在于提供提高托品烷生物碱合成能力的表达载体；本发明的目的之五在于提供一种提高托品烷生物碱合成能力的宿主细胞；本发明的目的之六在于提供提高托品烷生物碱含量的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、托品酮生物合成融合蛋白，所述托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通过连接肽连接，所述III型聚酮合酶PYKS位于连接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端。
优选的，所述III型聚酮合酶PYKS为植物III型聚酮合酶或细菌类III型聚酮合酶，具有催化N-甲基吡咯啉合成4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid的能力，托品酮合成酶CYP82M3来源于植物或细菌，可以催化4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid合成托品酮即可。
本发明中，所述连接肽可以为任何连接肽，可以将述III型聚酮合酶PYKS位于羧基端，托品酮合成酶CYP82M3位于氨基端均可实施，优选的，所述连接肽为3xGGGGS，2xGGGGS或GGSGGGGG。
优选的，所述托品酮生物合成融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.11所示。
2、所述托品酮生物合成融合蛋白在提高托品酮或托品烷生物碱合成能力中的应用。
3、提高托品酮或托品烷生物碱合成能力的核苷酸，其编码所述托品酮生物合成融合蛋白。
优选的，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.11所示。
4、提高托品酮或托品烷生物碱合成能力的表达载体，含有所述的核苷酸。
5、一种提高托品酮或托品烷生物碱合成能力的宿主细胞，被所述的表达载体所转化。
优选的，所述宿主细胞为具有托品烷生物碱合成能力的植物细胞或微生物细胞，具有托品烷生物碱合成能力可以是本身具有的，也可以通过代谢工程方式重建的。更优选的，所述植物细胞为颠茄、曼陀罗、木本曼陀罗、天仙子、三分三、铃铛子、烟草等；所述的微生物细胞为重建托品烷生物碱合成途径的细菌或真菌，如真菌中的酵母。
6、提高托品烷生物碱含量的方法，构建含有托品酮生物合成融合蛋白基因的表达载体，然后将表达载体在宿主细胞中表达，表达的融合蛋白作为托品酮的代谢区室，提高托品酮含量，然后提高下游托品烷生物碱含量，所述托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通过连接肽连接，所述III型聚酮合酶PYKS位于连接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端。
其中，宿主细胞为具有托品烷生物碱合成能力的植物细胞或微生物细胞，具有托品烷生物碱合成能力可以是本身具有的，也可以通过代谢工程方式重建的。更优选的，所述植物细胞为颠茄、曼陀罗、木本曼陀罗、天仙子、三分三、铃铛子、烟草等；所述的微生物细胞为重建托品烷生物碱合成途径的细菌或真菌，如真菌中的酵母。
本发明的有益效果在于：本发明公开了托品酮生物合成融合蛋白，该融合蛋白通过将PYKS位于连接肽的羧基端，托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端，经表达后的融合蛋白的同时PYKS与CYP82M3发生相互作用，构成托品酮的代谢区室，提高了托品酮的合成效率，其效果优于PYKS和CYP82M3进行双基因共表达，或CYP82M3位于连接肽的羧基端的融合蛋白，因此该融合蛋白可用于提高托品烷生物碱合成能力，对托品烷生物碱的生产具有非常重要的意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为双荧光素酶互补实验发现托品酮代谢区室。
图2为转基因毛状根中PYKS基因表达量检测结果。
图3为转基因毛状根中CYP82M3基因表达量检测结果。
图4为转基因毛状根中CYP82M3-3xGGGGS-PYKS表达量检测结果。
图5为转基因毛状根中PYKS-3xGGGGS-CYP82M3表达量检测结果。
图6为转基因毛状根托品酮含量检测结果。
图7为转基因毛状根托品含量检测结果。
图8为酵母发酵含量检测。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、托品酮生物合成代谢区室的发现
(1)颠茄须根总RNA提取
取适量颠茄须根组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，在分光光度计上测定RNA浓度。
(2)基因克隆
以所提取的总RNA为模板，按照天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA；设计基因特异性引物，具体引物如下：
F-CYP82M3：5’-cgcatgtatgataattttctcttctatga-3’(SEQ ID NO.1)；
R-CYP82M3：5’-cgcaaattcataaagcacagaattc-3’(SEQ ID NO.2)；
F-PYKS：5’-cgcatgaagttggaaaatggtca-3’(SEQ ID NO.3)；
R-PYKS：5’-cgcctaaatgggcacactacgaagca-3’(SEQ ID NO.4)；
首先，从颠茄中克隆到PYKS基因和CYP82M3基因。以颠茄cDNA为模板，F-PYKS和R-PYKS为引物，PCR克隆到PYKS基因，序列如SEQ ID NO.5所示。同样以颠茄cDNA为模板，F-CYP82M3和R-CYP82M3为引物，PCR克隆到CYP82M32基因，序列如SEQ ID NO.6所示。
(3)双荧光素酶互补实验
双荧光素酶互补实验(BIFC)已被广泛用于验证两个蛋白质在植物体内的相互作用，根据PYKS和CYP82M3序列构建相关实验质粒。首先PYKS和CYP82M3的编码序列均按照说明书构建到GATEWAY入门载体TOPO pEntry(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。然后，将PYKS与pEarleygate201-YFPN(Taixin Zhang，Yuqin Gou，Feng Bai，etc.AaPP2C1negatively regulates the expression of genes involved inartemisinin biosynthesis through dephosphorylating AaAPK1，2019，FEBS Letters.)的YFPN标签融合表达，通过LR重组反应生成质粒pEarleygate201-PYKS-YFPN；同样地，将CYP82M3与pEarleygate202-YFPC(Taixin Zhang，Yuqin Gou，Feng Bai，etc.AaPP2C1negatively regulates the expression of genes involved in artemisininbiosynthesis through dephosphorylating AaAPK1，2019，FEBS Letters.)的YFPC标签融合，以生成质粒pEarleygate202-CYP82M3-YFPC。已购买的质粒pCD3-953(https://abrc.osu.edu/stocks/766830)内含有CFP(青色荧光蛋白)完整蛋白表达框，被认为是内质网信号标记(ER marker)。
将质粒pEarleyGate201-AbPYKS-YFPN、pEarleyGate202-AbCYP82M3-YFPC和pCD3-953通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞，挑取单克隆经PCR菌检为阳性后，保存菌株。将菌液按如下分组1:1等比例混合，并等比加入含辅助p19质粒的农杆菌GV3101重悬液，注射烟草叶片，具体组别如表1所示。
表1、实验分组情况
Figure BDA0003083159820000041
然后48小时后在荧光显微镜下观察特定激发光和发射光波长下是否出现目标荧光，结果如图1。结果显示在激发光照射下，实验组和对照组均能观察到青色荧光，即内质网标记物信号；只在实验组中，当AbPYKS-YFPN和AbCYP2M3-YFPC在本氏烟草细胞中共表达时，转化后的细胞产生强烈的黄色荧光信号，即YFP信号，表明AbPYKS和AbCYP2M3在植物体内存在相互作用。此外，这些YFP信号与ER maker的青色荧光信号完全重合，而对照组1和对照组2中均无YFP信号，表明AbPYKS和AbCYP2M3在内质网上发生相互作用。
根据BIFC的结果可知，推测CYP82M3和PYKS可能在内质网上相互作用。这种现象又被称为代谢区室，是自然界进化出的一种酶的自组装策略，可提高代谢效率。通过将负责连续催化步骤的酶通过蛋白质相互作用形成代谢区室，可增加底物的局部浓度，减少中间体的传递时间，规避不利的酶反应动力学，增加代谢通量。借鉴大自然这一策略，我们思考能否通过构建人工的代谢区室，即二者的融合蛋白，形成更加稳固的复合体，从而进一步提高托品酮的合成效率。以下，我们设计了两种融合蛋白，分别是CYP82M3在氨基端而PYKS在羧基端的CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合蛋白，和PYKS在氨基端而CYP82M3在羧基端的PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合蛋白。
实施例2、托品酮生物合成融合蛋白的构建
为构建托品酮生物合成融合蛋白，设计引物序列如下：
F-3xGGGGS-CYP82M3:
5’-ggtgggggagggtccgggggtggagggagtgggggaggtgggtcaatgtatgataatttt-3’(SEQ ID NO.7)；
R-CYP82M3-3xGGGGS：
5’-tgacccacctcccccactccctccacccccggaccctcccccaccaaattcataaagca-3’(SEQID NO.8)；
F-3xGGGGS-PYKS：
5’-ggtgggggagggtccgggggtggagggagtgggggaggtgggtcaatgaagttggaaa-3’(SEQID NO.9)；
R-PYKS-3xGGGGS：
5’-tgacccacctcccccactccctccacccccggaccctcccccaccaatgggcacactacg-3’(SEQ ID NO.10)；
以重叠PCR的方法获得CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合基因，具体步骤如下：以上一步克隆到的PYKS基因为模板，加入引物F-3xGGGGS-PYKS(SEQ ID NO.9)和R-PYKS(SEQ IDNO.4)，进行PCR扩增，并切胶回收，获得3xGGGGS-PYKS。同样以上一步克隆到的CYP82M3基因为模板，加入引物F-CYP82M3(SEQ ID NO.1)和R-3xGGGGS-CYP82M3(SEQ ID NO.7)，进行PCR扩增，并切胶回收，获得CYP82M3-3xGGGGS。取3xGGGGS-PYKS和CYP82M3-3xGGGGS稀释100倍后作为模板加入不含引物的PCR体系中，进行15个PCR循环，加入引物F-CYP82M3和R-PYKS，再进行20个PCR循环。最后将PCR产物切胶回收并测序，获得CYP82M3-3xGGGGS-PYKS基因序列，具体序列如SEQ ID NO.11所示。
用上述同样的重叠PCR方法，构建PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合蛋白，具体步骤如下：以上一步克隆到的PYKS基因为模板，加入引物F-PYKS(SEQ ID NO.3)和R-PYKS-3xGGGGS(SEQ ID NO.10)，进行PCR扩增，并切胶回收，获得PYKS-3xGGGGS。同样以上一步克隆到的CYP82M3基因为模板，加入引物F-3xGGGGS-CYP82M3(SEQ ID NO.7)和R-CYP82M3(SEQ IDNO.2)，进行PCR扩增，并切胶回收，获得3xGGGGS-CYP82M3。取PYKS-3xGGGGS和3xGGGGS-CYP82M3稀释100倍后作为模板加入不含引物的PCR体系中，进行15个PCR循环，加入引物F-PYKS和R-CYP82M3，再进行20个PCR循环。最后将PCR产物切胶回收并测序，获得PYKS-3xGGGGS-CYP82M3基因序列。
实施例3、托品酮生物合成融合蛋白在植物代谢工程中的评价
(1)植物过表达载体的构建
为了评估，PYKS单基因表达、CYP82M3单基因表达、CYP82M3/PYKS双基因共表达、CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合基因表达、PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合基因表达，五种组合在植物药用托品烷生物碱代谢工程中的应用价值，本研究构建了以上五个植物表达质粒。分别以上述得到基因为模板，使用KOD-Plus扩增基因，使用限制性内切酶和T4 DNA连接酶进行酶切酶连反应。
以植物双元表达载体pBI121和pCAMBIA1305.1为原始质粒，pBI121的筛选标记基因是卡那霉素(NPTII)基因，pCAMBIA1305.1的筛选标记基因是潮霉素(HygR)基因；为了实验的一致性，选择NPTII基因作为惟一的筛选标记基因，以筛选获得阳性转基因毛状根，故需要改造载体。使用引物NPTII-XhoI-F和NPTII-XhoI-R，PCR扩增pBI121质粒T-DNA区内的NPTII基因(795bp)，并用XhoI单酶切PCR产物和质粒pCAMBIA1305.1，通过T4 DNA连接酶构建到质粒pCAMBIA1305.1中，挑取单斑，检测阳性单克隆，经公司测序无误，即得改造后载体，命名为pCAMBIA1305.1 K。引物序列如下：
NPTII-XhoI-F：5’-cgcctcgagatgattgaacaagatggattg-3’(SEQ ID NO.12)；
NPTII-XhoI-R：5’-cgcctcgagtcagaagaactcgtcaagaagg-3’(SEQ ID NO.13)；
构建过表达PYKS的载体pPYKS：使用引物BglII-PYKS-F和BstEII-PYKS-R扩增PYKS编码区，并用BglII和BstEII双酶切后，构建到质粒pCAMBIA1305.1K中，经测序无误后，质粒命名为pPYKS。引物序列如下：
BglII-PYKS-F：5’-cgcagatctatgaagttggaaaatggtca-3’(SEQ ID NO.14)；
BstEII-PYKS-R：5’-cgcggtnaccctaaatgggcacactacgaagca-3’(SEQ ID NO.15)；
构建过表达CYP82M3的载体：使用引物BamHI-CYP82M3-F和SacI-CYP82M3-R扩增CYP82M3编码区，使用BamHI和SacI双酶切后，连接到质粒pCAMBIA1305.1K中，经测序无误后，质粒命名为pCYP82M3。引物序列如下：
BamHI-CYP82M3-F：5’-cgcggatccatgtatgataattttctcttctatga-3’(SEQ IDNO.16)；
SacI-CYP82M3-R：5’-cgcgagctcaaattcataaagcacagaattc-3’(SEQ ID NO.17)；
构建共表达PYKS和CYP82M3的质粒：用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切质粒pCYP82M3，切胶回收，以获得携带35S启动子和NOS终止子的完整CYP82M3表达框；使用相同限制性内切酶双酶切质粒pPYKS，并将携带完整表达框CYP82M3构建到质粒pPYKS，经测序无误后，质粒命名为pCP。
构建CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合基因表达质粒：使用引物BamHI-CYP82M3-F和SacI-PYKS-R扩增PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合基因编码区，使用BamHI和SacI双酶切后，连接到质粒pBI121中。此时CYP82M3位于氨基端，PYKS位于羧基端。经测序无误后，质粒命名为pCLP。引物序列如下：
BamHI-CYP82M3-F：5’-cgcggatccatgtatgataattttctcttctatga-3’(SEQ IDNO.18)；
SacI-PYKS-R：5’-cgcgagctcctaaatgggcacactacgaagca-3’(SEQ ID NO.19)。
按照构建CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合基因表达质粒的方法构建CYP82M3-3xGGGGS-PYKS重组质粒，此时PYKS位于氨基端，CYP82M3位于羧基端，质粒命名为pPLC。引物序列如下：
BamHI-PYKS-F：5’-cgcggatccatgtatgataattttctcttctatga-3’(SEQ ID NO.20)；
SacI-CYP82M3-R：5’-cgcgagctcctaaatgggcacactacgaagca-3’(SEQ ID NO.21)。
(2)发根农杆菌介导的颠茄转化
将上述四个植物表达载体(作为4个不同的实验组)和pCAMBIA1305.1K(作为对照组)采用冻融法分别转入发根农杆菌(如C58C1)，并进行PCR验证。结果表明，五个植物双元过量表达载体已分别成功构建到发根农杆菌菌株中。
颠茄种子用75％乙醇浸泡1min，再用50％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的1/2MS固体培养基中，25℃，16h/8h(光亮/黑暗)光照培养，即可获得颠茄无菌苗。该条件下培养2周左右后，剪取无菌苗叶片和下胚轴外植体用于转化。
将所述外植体，加入活化好的以上所述植物双元超表达载体的发根农杆菌工程菌的重悬液(MS+AS 100μmol/L)中，菌液与外植体充分接触5分钟，转到共培养培养基(MS+AS100μmol/L)上，28℃暗培养2d。
将所述的共培养2d的颠茄外植体转入到筛选培养基(MS+Kan 100mg/L+Cef500mg/L)上于25℃暗培养，每周继代培养一次，经过1-2次继代后即可获得Kan抗性毛状根。将生长良好的毛状根剪下转入培养基(MS+Cef 200mg/L)上培养至完全无菌，从而获得Kan抗性颠茄毛状根。至此，获得5组颠茄毛状根系，对照组CK、PYKS单基因过表达组P、CYP82M3单基因过表达组C、双基因共表达组CP和融合基因表达组CLP。
(3)qPCR测定颠茄目标基因表达量
将获得的转基因颠茄毛状根采用荧光定量检测，结果显示，PYKS基因在P组和CP组毛状根中表达量被极显著提高(图2)，CYP82M3基因在C组和CP组毛状根中表达量被极显著提高(图3)，CYP82M3-3xGGGGS-PYKS基因仅在CLP中检测到(图4)，PYKS-3xGGGGS-CYP82M3仅在PLC中检测到(图5)。
qPCR检测引物序列如下：
q-CYP82M3-F:5’-tcagtgacaaagcctgacga-3’(SEQ ID NO.22)；
q-CYP82M3-R:5’-tgggcatgtttcatgacgtg-3’(SEQ ID NO.23)；
q-PYKS-F:5’-cttcaggagatgggctggac-3’(SEQ ID NO.24)；
q-PYKS-R:5’-aagcatcacagaagggcagg-3’(SEQ ID NO.25)；
q-CLP-F:5’-agttgtaatcaccccgcgtt-3’(SEQ ID NO.26)；
q-CLP-R:5’-ggtgttgctgttccaatggc-3’(SEQ ID NO.27)；
q-PLC-F:5’-tctagtagagaagggctgaag-3’(SEQ ID NO.28)；
q-PLC-R:5’-ccaatttcttgtccatagaatg-3’(SEQ ID NO.29)
(4)LC-MS测定颠茄中托品酮和托品的含量
每个独立的阳性毛状根株系，取100mg左右新鲜毛状根接种至100mL MS液体培养基中。四个实验组每组培养12个独立转化的毛状根株系，经pCAMBIA1305.1K独立转化的12个毛状根株系作为空质粒对照组。培养四周后即可收获毛状根，流水洗净毛状根表面培养液，新鲜材料包裹在锡箔中，在冷冻干燥机中低温冷干后用于下一步提取。
将冻干的毛状根装入已提前放入2-4颗3mm小钢珠的2mL EP管中，在设置为55Hz，90s的全自动样品快速研磨仪中磨成细粉。称量25mg干粉放于2mL EP管中，向管中加入1ml生物碱提取液，置于25℃，200rpm摇床震荡2h，11000rpm离心5min，吸取上清。用0.22μm滤头过滤上清，稀释十倍后，即可上机分析。
使用Thermo Fisher Scientific UPLC-Q Exactive超高压液相-质谱联用仪，在全扫描模式和正离子模式下，用电喷雾电离(Electronspray Ionization，ESI)进行生物碱含量的分析测定。
仪器参数设置如下：鞘气流量35，辅助气体流量10，喷雾电压3.00kV，毛细管温度350℃，S透镜射频电平为50，辅助气体加热器温度为350℃。系统流速为0.3mL/min，烘箱温度为35℃；所有标准品均购自Sigma Aldrich。使用ACQUITY UPLC BEN HILIC色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)鉴定并分析托品酮和托品的含量。样品分析采用梯度洗脱，流动相A：100mM甲酸铵和1％甲酸水溶液，流动相B是乙腈；每次进样体积为5μL。
洗脱程序见如下：
Figure BDA0003083159820000091
含量测定结果显示，PYKS单基因表达株系P与对照组株系CK中托品酮和托品的含量没有显著性差别(图6和图7)。CYP82M3单基因表达株系C中托品的含量出现轻微上升，但托品酮含量没有明显变化(图6和图7)。PYKS和CYP82M3双基因共表达株系CP中托品酮和托品的含量均出现极显著上升，其托品酮的含量比对照组高90％，其托品的含量比对照组高68％(图6和图7)。CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合基因表达的株系CLP中托品酮和托品的含量最高，与其它组均有极显著差异(图6和图7)，其托品酮含量比对照组株系提高了279％，比双基因共表达株系提高了99％，其托品含量比对照组株系提高了140％，比双基因共表达株系提高了42％。
但是PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合蛋白组与双基因共表达组中托品酮和托品含量均没有显著性区别。我们推测，这可能是因为PYKS位于氨基端影响了蛋白复合体的亚细胞定位，导致CYP82M3未能形成正确的折叠构象。通过亚细胞定位预测我们发现，PYKS无信号肽，在细胞质中游离存在；而CYP82M3和常见的细胞色素P450蛋白一样，氨基端存在明显的内质网定位信号。当CYP82M3位于氨基端而PYKS位于羧基端时，氨基端的内质网定位信号可引导融合蛋白定位于内质网，从而形成正确的催化结构，而且此时PYKS和CYP82M3形成了一个稳固的代谢区室，增加了底物的局部浓度，减少了中间代谢产物的传递时间，同时规避了不利的酶反应动力学，增加代谢通量。但当PYKS位于氨基端而CYP82M3位于羧基端时，氨基端无明确的定位信号，导致融合蛋白不能很好地结合在内质网上，最终CYP82M3未能折叠出正确的催化结构，催化功能受到不利影响。
以上结果表明，在植物代谢工程中，以CYP82M3作为氨基端，PYKS作为羧基端，中间以连接肽如3个连续的GGGGS作为接头进行连接，构建成一个融合蛋白CYP82M3-3xGGGGS-PYKS，作为托品酮的代谢区室，其催化效率远高于PYKS和CYP82M3进行双基因共表达，也优于PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合蛋白组。
实施例4、托品酮生物合成融合蛋白在酵母工程菌中的评价
(1)酵母全合成托品菌株的构建
为了了解托品酮生物合成融合蛋白在酵母合成生物学中的应用价值，在酿酒酵母WAT11菌株中测试PYKS/CYP82M3双基因共表达、CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合蛋白表达和PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合基因表达三个方案的托品酮生产效率。
首先构建酵母共表达PYKS和CYP82M3质粒：用限制性内切酶BamHI、KpnI、EcoRI和SacI酶切质粒pESC-URA，切胶回收。使用与载体多克隆位点区域含20bp同源序列的引物扩增PYKS和CYP82M3，用
Figure BDA0003083159820000101
PCR一步定向克隆试剂盒对质粒骨架和两个基因的扩增产物进行重组反应，转化大肠杆菌，PCR鉴定阳性克隆子，经测序无误后，质粒命名为pESC-URA-CP。引物序列如下：
ESC-CYP82M3-F：5’-ggagaaaaaaccccggatccatgtatgataattttctcttc-3’(SEQ IDNO.30)；
ESC-CYP82M3-R：5’-tcttagctagccgcggtaccctaaaattcataaagcacag-3’(SEQ IDNO.31)；
ESC-PYKS-F：5’-atttttgaaaattcgaattcatgaagttggaaaatggtca-3’(SEQ IDNO.32)；
ESC-PYKS-R：5’-gaattgttaattaagagctcttaaatgggcacactacgaa-3’(SEQ IDNO.33)。
构建酵母表达CYP82M3-3xGGGGS-PYKS质粒：用限制性内切酶BamHI、KpnI双酶切质粒pESC-URA，切胶回收。使用与载体多克隆位点区域含20bp同源序列的引物扩增CYP82M3-3xGGGGS-PYKS。用
Figure BDA0003083159820000102
PCR一步定向克隆试剂盒对质粒骨架和融合蛋白基因扩增产物进行重组反应，转化大肠杆菌，PCR鉴定阳性克隆子，经测序无误后，质粒命名为pESC-URA-CLP。引物序列如下：
F-ESC-CYP82M3-3xGGGGS-PYKS：5’-ggagaaaaaaccccggatccatgtatgataattttctcttc-3’(SEQ ID NO.34)；
R-ESC-CYP82M3-3xGGGGS-PYKS：5’-tcttagctagccgcggtaccttaaatgggcacactacgaa-3’(SEQ ID NO.35)。
构建酵母表达PYKS-3xGGGGS-CYP82M3质粒：用限制性内切酶BamHI、KpnI双酶切质粒pESC-URA，切胶回收。使用与载体多克隆位点区域含20bp同源序列的引物扩增PYKS-3xGGGGS-CYP82M3。用
Figure BDA0003083159820000111
PCR一步定向克隆试剂盒对质粒骨架和融合蛋白基因扩增产物进行重组反应，转化大肠杆菌，PCR鉴定阳性克隆子，经测序无误后，质粒命名为pESC-URA-PLC。引物序列如下：
F-ESC-PYKS-3xGGGGS-CYP82M3：5’-ggagaaaaaaccccggatccatgaagttggaaaatggtca-3’(SEQ ID NO.36)；
R-ESC-PYKS-3xGGGGS-CYP82M3：5’-tcttagctagccgcggtacctcaaaattcataaagcacag-3’(SEQ ID NO.37)。
再将以上三个酵母表达质粒分别转化WAT11感受态细胞，方法参照常规醋酸锂转化法，获得酵母工程菌株WAT11-CP、WAT11-CLP和WAT11-PLC。
(2)LC-MS测定培养基中托品酮含量
将WAT11原始酵母菌株和上述两个酵母工程菌株分别接种至YPD液体培养基中30℃震荡过夜培养。转接至含50ml的SC-U液体培养基(含1％棉籽糖和2％乳糖)的锥形瓶中，每组设置3个生物学重复，置于30℃震荡培养至OD600为0.6，加入终浓度为1mM的N-甲基吡咯啉，继续培养72小时，取1ml发酵后培养基经0.22μm滤头过滤，稀释十倍后，使用超高压液相-质谱联用仪分析其中托品酮含量。质谱分析仪器和方法与发根含量检测方法完全一致。
含量测定结果显示，WAT11原始酵母发酵后培养基中未检测到托品酮，而PYKS和CYP82M3双基因表达酵母WAT11-CP发酵后培养基中托品酮的含量为24.09μM，PYKS-3xGGGGS-CYP82M3表达酵母WAT11-PLC中托品酮含量为26.35μM，而CYP82M3-3xGGGGS-PYKS表达酵母WAT11-CLP发酵后培养基中托品酮的含量为287.83μM(图8)。WAT11-PLC发酵液中托品酮含量和WAT-CP无显著性差异。WAT11-CLP发酵液中托品酮的含量约为WAT11-CP发酵液的11.9倍。以上结果表明，在酵母生物合成中，CYP82M3-3xGGGGS-PYKS融合蛋白的催化效率远高于PYKS和CYP82M3进行双基因共表达，也优于PYKS-3xGGGGS-CYP82M3融合蛋白组。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 托品酮生物合成融合蛋白及其应用和方法
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcatgtatg ataattttct cttctatga 29
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcaaattca taaagcacag aattc 25
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cgcatgaagt tggaaaatgg tca 23
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<212> DNA
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cgcctaaatg ggcacactac gaagca 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaagttgg aaaatggtca aaaatttggg agggttcatg agagagctga gggtcctgca 60
aaaattttag ccattggaac agcaacacct ttccattggg ttgatcaaag ctcctatcct 120
gattattatt tcagggttac aaatagtgac catttggtgg acctcaaaga aaaatttaga 180
cgtatctgta acagaacaat gattagcaaa aggcacatgt ttttgacaga ggaaatattc 240
cagaaaaatc ccaatttgtg ctctcacaat gagccatcct ttgatgtcag gcaggacatt 300
ttagtttcag aaatacccaa acttggaaaa gaggctgtcc ttatggccat tgatgaatgg 360
gcccagccca aatccaaaat tacccattta gtcttttgca caagaagtgg tgttgacatg 420
cccggtgcag attaccaatt aattaagcta ttgggcctaa gcccatcagt tcaacgtgta 480
atgatgtacc aacaaggttg ctttgctggt ggcacgatgc ttcgattggc caaggactta 540
gctgagaata acaagggagc tagggtactt gtcgtgtgtg ctgagagctc agccataggg 600
tttcgtgggc ctagtgaaga tcatccggat aaccttatcg cgcaagcgtt gtttggagat 660
ggagcggccg ctcttataat tggatcagac cctaagatgg gcctagagag gcccatcttt 720
gagatagtca caacggccca aacatttgtc cctaacgggg actgtcacct cgcattacac 780
ctacgtgaaa tgggccttac atttcattgt accaaggatg taccaccaac tattgcgaaa 840
aatgttgaga gttgcttaat aaaggctttt gaacctttgg gaatatcaga ttggaactcg 900
atcttttgga ttcttcatcc aggaggtaat gcaattgtgg accaagtcga gagtacattg 960
ggcctagagc ccaataagtt acaggccaca agaaatatcc ttagagagta tggtaacttg 1020
tcaagtgcat gtgtgttatt catattggat gagattagaa agaaatctag tagagaaggg 1080
ctgaagactt caggagatgg gctggacttg ggagtccttt tatcatttgg gcctgggctt 1140
acgattgaga cagttgtgct tcgtagtgtg cccatttag 1179
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<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtatgata attttctctt ctatgatctg caaattatac ttggagtcct tctaactttt 60
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tggttcgaaa aattgacttt gaatataatt gtgaagatga ttgctgggaa aagatatgga 600
tctttggaga aagatgaaga ggcacaatgt tttagaaggg cttttgctaa gataatgtat 660
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tttcaagggc atattaagac catgaagcaa atttataagg acttggatga tattcttcaa 780
ggttgggtta atgaacatat ggagaaaaat aagaaggttg caggtgatga tgaagaacaa 840
gattgtatag atgcaatgct ttcagtgaca aagcctgacg atttcaaagc ctatgattat 900
acacgagata cagttatcaa ggcaactgta ttgagcatga tattggatgg ttcagacaca 960
actgcagttc acctaacatg gctcatgtcc ctattattga acaatcctca cgtcatgaaa 1020
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ccaaagggta ctcgtttgtt tcccaatgca tggaagatac aacgagaccc tcgggtttat 1260
tcagagcctg ataagttcat gccagagaga ttcttaaacg aacattcgaa tgtggatgct 1320
cgtggtcagc attttgagtt catcccgttt ggttctggaa gacggtcttg tcctggaatt 1380
aattttgcaa cgcaagtggc gcatctcaca attagtcgat taattcaagg atttaacttt 1440
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gcaaatcctg tggaagttgt aatcaccccg cgtttgaatt ctgtgcttta tgaattt 1557
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgggggag ggtccggggg tggagggagt gggggaggtg ggtcaatgta tgataatttt 60
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgacccacct cccccactcc ctccaccccc ggaccctccc ccaccaaatt cataaagca 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtgggggag ggtccggggg tggagggagt gggggaggtg ggtcaatgaa gttggaaa 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgacccacct cccccactcc ctccaccccc ggaccctccc ccaccaatgg gcacactacg 60
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgataaag aactcgctgc tagaccaatt agtctagcag cggaacatta tggctataat 360
tacgcaagat tttcttttgc taattatggt ccatattatt gccaagtacg aaaactcgtg 420
ttacaaaatg ttctgtctag tactagactt gaaaaagtca aacatgtccg aatttccgag 480
gtggaaatta gcatcaaaga attatttagt gaaagttcta aagtgattaa tattagtcaa 540
tggttcgaaa aattgacttt gaatataatt gtgaagatga ttgctgggaa aagatatgga 600
tctttggaga aagatgaaga ggcacaatgt tttagaaggg cttttgctaa gataatgtat 660
cttgctgggc aattcatttt atatgacgct attccgttcc aaattttcaa atatgtggat 720
tttcaagggc atattaagac catgaagcaa atttataagg acttggatga tattcttcaa 780
ggttgggtta atgaacatat ggagaaaaat aagaaggttg caggtgatga tgaagaacaa 840
gattgtatag atgcaatgct ttcagtgaca aagcctgacg atttcaaagc ctatgattat 900
acacgagata cagttatcaa ggcaactgta ttgagcatga tattggatgg ttcagacaca 960
actgcagttc acctaacatg gctcatgtcc ctattattga acaatcctca cgtcatgaaa 1020
catgcccaag aagaaataga caacaaagtt ggtacagaaa gatgggttga agaatccgat 1080
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ccaggaggta atgcaattgt ggaccaagtc gagagtacat tgggcctaga gcccaataag 2580
ttacaggcca caagaaatat ccttagagag tatggtaact tgtcaagtgc atgtgtgtta 2640
ttcatattgg atgagattag aaagaaatct agtagagaag ggctgaagac ttcaggagat 2700
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcggtnacc ctaaatgggc acactacgaa gca 33
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atttttgaaa attcgaattc atgaagttgg aaaatggtca 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaattgttaa ttaagagctc ttaaatgggc acactacgaa 40
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagaaaaaa ccccggatcc atgtatgata attttctctt c 41
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagaaaaaa ccccggatcc atgaagttgg aaaatggtca 40
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcttagctag ccgcggtacc tcaaaattca taaagcacag 40

Claims (8)

1.托品酮生物合成融合蛋白，其特征在于：所述托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通过连接肽连接，所述III型聚酮合酶PYKS位于连接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端；所述III型聚酮合酶PYKS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述托品酮合成酶CYP82M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述托品酮生物合成融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为3xGGGGS，2xGGGGS或GGSGGGGG。
3.根据权利要求1所述托品酮生物合成融合蛋白，其特征在于：所述托品酮生物合成融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.11所示。
4.权利要求1或2所述托品酮生物合成融合蛋白在提高托品酮或托品烷生物碱合成能力中的应用。
5.提高托品酮或托品烷生物碱合成能力的核苷酸，其特征在于：其编码如权利要求1～4任一项所述托品酮生物合成融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.11所示。
7.提高托品酮或托品烷生物碱合成能力的表达载体，其特征在于：含有如权利要求5或6所述的核苷酸。
8.提高托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：构建含有托品酮生物合成融合蛋白基因的表达载体，然后将表达载体在宿主细胞中表达，表达的融合蛋白作为托品酮的代谢区室，提高托品酮含量，然后提高下游托品烷生物碱含量，所述托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通过连接肽连接，所述III型聚酮合酶PYKS位于连接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于连接肽的氨基端；所述III型聚酮合酶PYKS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述托品酮合成酶CYP82M3的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
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