KR102169650B1 - 다중 유전자 발현 시스템을 이용한 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 당전이 효소는 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

다중 유전자 발현 시스템을 이용한 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased syringin content using multiple gene expression system and plant thereof}
본 발명은 다중 유전자 발현 시스템을 이용한 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.
시린진(syringin)은 리그닌계 배당체로 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해서 생성된 리그닌 구성 성분인 시나필 알콜(sinapyl alcohol, s type monolignol)이 당전이 효소(UGTase; UDP-dependent glucosyltransferase)에 의해서 배당체가 됨으로써 생성된다. 모델 식물체인 애기장대에는 약 100여 종의 당전이 효소가 있으며 식물호르몬을 비롯한 다양한 화합물의 배당체를 형성함으로써 이들 화합물이 세포 내에서 비활성화되고 액포에 저장되는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 이들 중에서 UGT72E2 및 UGT72E3은 각각 특이적으로 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol) 및 시나필 알코올(sinapyl alcohol)과 같은 모노리그놀(monolignol)을 배당체로 전환시키는 당전이 효소로 알려져 있다. 그러나 당전이 효소 UGT72E3은 시나필 알코올에 대한 기질 특이성은 우수하지만 당전이 활성이 낮아서 그 응용성이 매우 제한적이었다. 따라서, 식물체 내에서 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해 시린진을 효과적으로 생산하기 위해서는 시린진의 전구체인 시나필 알코올에 대해 기질 특이성이 있으면서 당전이 활성이 강한 당전이 효소에 관한 연구 및 식물세포 내에 미량으로 존재하는 시나필 알코올의 함량을 증가시킬 수 있는 대사공학적 기술이 필요하다.
시린진(엘류테로사이드 B)은 가시오가피의 근피나 수피에 많이 들어 있는 약리 성분으로 스트레스에 대해 정신적 또는 육체적으로 우수한 적응력을 나타내는 식물 유래의 대표적 적응원(adaptogen)으로 분류되고 있다. 적응원이란 다양한 스트레스에 반응하여 부작용없이 생체의 비특이성 저항력을 증가시키는 식물 이차대사 산물을 일컫는 말이다. 최근에 순수 분리된 시린진이 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증의 치료뿐만 아니라 노화예방, 시력개선, 청력개선, 간손상, 혈관확장, 피로회복, 항경련, 항스트레스 작용에도 효과적인 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있다. 그러나 가시오가피의 재배 지역이 제한적이고 재배 지역에 따라 약리성분에 차이가 있어 상업적 이용을 위한 시린진 생산에 필요한 가시오가피의 안정적 공급이 어렵기 때문에 생명공학 기술을 이용한 식물대사 경로의 조절을 통하여 시린진과 같은 고부가 가치 산물인 식물 이차대사 산물의 안정적 생산기술 개발이 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1399944호에는 재조합 당전이 효소 UGT72E-3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 이용한 '시린진과 코니펜린 함량이 증가된 형질전환 콩 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 콩 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1399941호에는 '식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자를 이용한 '다중 유전자 발현 시스템을 이용한 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 기질 특이성이 뛰어나면서 당전이 활성이 강화된 새로운 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 애기장대에서 분리된 당전이 효소 UGT72E2와 UGT72E3(UDP-dependent glycosyltransferase 72E3)을 코딩하는 유전자로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E3 /2-1을 제조하고, 상기 재조합 단백질의 카복시 말단에 3개의 Myc 에피토프를 포함하는 42개의 아미노산 서열을 추가한 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc을 제조하였다. 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자를 동시에 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조한 후 시린진의 합성 효율을 정량적으로 비교한 결과, 새롭게 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환체가 야생형에 비해 시린진 함량이 크게 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 함량 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 당뇨병과 우울증 치료, 노화 예방 및 항스트레스 등의 효과가 우수하여 의약품 및 식품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있는 식물 유래 시린진을 식물체에서 효과적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜머파시엔스로 인필트레이션된 애기장대 잎에서 UGT72E3/2-1-myc의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3A는 애기장대 야생형(WT)과 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58을 동시에 과발현하는 형질전환체(T1-14-2, T1-14-3)를 토양재배한 후 식물체 잎에서의 코니페린과 시린진 생성량을 분석한 HPLC(High-performance liquid chromatography) 크로마토그램이고, 도 3B는 상기 HPLC 분석결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 파란색 화살표, 코니페릴 알코올 4-O-글루코시드(코니페린, Coniferin); 빨간색 화살표, 시나필 알코올 4-O-글루코시드(시린진, Syringin).
도 4는 애기장대 야생형과 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58을 동시에 과발현하는 형질전환체(T1-7-4, T1-14-2 및 T1-14-3)를 수경재배 또는 토양재배한 후 식물체의 뿌리 또는 잎에서 코니페린과 시린진 함량을 측정한 결과이다.
도 5는 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58을 동시에 과발현하는 형질전환체(T1-14-3)의 전체적인 대사체(metabolome) 변화를 확인하기 위해 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자뿐만 아니라 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련된 유전자의 발현 수준을 애기장대 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 6은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58을 동시에 과발현하는 형질전환체(T1-14-3)의 전체적인 대사체(metabolome) 변화를 확인하기 위해 페닐프로파노이드 생합성 경로의 출발 물질인 페닐알라닌 합성에 관여하는 쉬킴산 합성 경로(shikimate pathway)에서 일차대사 합성 경로와 관련된 유전자의 발현 수준을 애기장대 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 식물체 내에서 시린진의 합성율을 증가시키기 위해서 당전이 활성과 시나필 알코올(sinaphyl alcohol)에 대한 기질 특이성을 강화한 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2 및 UGT72E3 단백질을 코딩하는 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E3/2를 제조하였고, 상기 재조합 유전자로부터 발현되는 단백질의 카복시 말단에 3개의 Myc 에피토프(epitope)를 포함하는 42개의 아미노산 서열을 추가한 새로운 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc을 제조하였다. Myc 에피토프의 결합은 면역블롯팅(immunoblotting) 분석을 통해 단백질의 발현량을 확인하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라 목적 단백질(효소)의 활성을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명에 따른 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질의 범위는 각각 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내의 시린진(syringin) 합성 증가를 의미한다.
또한, 상기 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자는 식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 특징이 있으며, 상기 유전자의 범위는 UGT72E3/2-1-myc, F5H 또는 Myb58 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H 단백질 코딩 유전자 및 Myb58 단백질 코딩 유전자의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자들이 병렬로 연결된 다중 유전자 발현용 재조합 벡터로, 구체적으로는 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 합성 경로에서 시니필 알코올로의 전환에 필요한 코니페릴 알코올의 하이드록실화 단계를 조절하는 F5H 단백질 코딩 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb58 단백질 코딩 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 염기서열을 확인한 후 UGT72E3 /2-1- myc 유전자가 클로닝되어 있는 발현 벡터에 각각 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 3개의 유전자가 유전자 발현 억제(silencing) 없이 동시에 발현될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전화시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법에 있어서, 상기 UGT72E3/2-1-myc 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.
본 발명에서는 새롭게 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체가 형질전환체의 교배(sexual crossing)에 의한 유전자 집적(gene stacking)의 방법으로 제작된 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질 과발현 형질전환체(한국등록특허 제1399946호)에 비해 최대 시린진 생산량이 약 4배, 코니페린이 약 20배 증가한 것을 확인하였다. 구체적으로 기존 형질전환체의 교배에 의한 유전자 집적의 방법으로 제작된 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질 과발현 형질전환체에서는 시린진이 10.79 μmol/g이고 코니페린이 10.79 μmol/g이었으나, 본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환체에서는 시린진이 41.03 μmol/g이고 코니페린이 208.36 μmol/g인 것을 확인하였다.
본 발명의 재조합 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등 으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 각각 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 3개의 유전자가 유전자 발현 억제 없이 동시에 발현될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하며, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체는 바람직하게는 잎 또는 뿌리에서 시린진 함량이 증가되고, 가장 바람직하게는 잎에서 시린진 함량이 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 함량 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 시린진 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 재조합 당전이 효소 UGT72E3 /2-1- myc 의 제조
본 발명에서는 UGT72E2 및 UGT72E3 단백질을 각각 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과, 345번부터 카복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카복시 단편으로 이분하였다. 아미노 단편은 기질인식 특이성을 결정하는 영역을 포함하고 카복시 말단은 당전이 활성에 중요한 PSPG(plant secondary product glycosyltransferases) 모티프를 포함하고 있다. 식물체 내에서 시린진을 효율적으로 합성하기 위해서는 당전이 활성보다 기질 특이성이 중요하므로 정확히 이등분하지 않고, 먼저 아미노 단편은 전체의 3/4으로 하고 카복시 단편은 PSPG 모티프를 포함하는 최소 크기로 나누었다.
본 발명에서 사용한 재조합 UGT72E3 /2-1 유전자는 UGT72E3의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편 코딩 유전자와 UGT72E2의 345번부터 카복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편 코딩 유전자를 연결하여 제조한 것으로, 상기 UGT72E3 /2-1 유전자로부터 발현된 단백질의 카복시 말단에 3개의 Myc 에피토프(epitope)를 포함하는 42개의 아미노산 서열을 추가하여 새로운 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc을 완성하였다.
2. UGT72E3 /2-1-m yc , F5H 및 Myb58 유전자를 모두 포함하는 다중 유전자 발현용 재조합 벡터의 제작
상기 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자의 코딩 영역을 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되도록 바이너리 벡터에 클로닝하였으며, 식물체 내의 대사경로 조절을 통해 시린진의 생산을 증가시키기 위하여 페닐프로파노이드 합성 경로에서 시나필 알코올로의 전환에 필요한 코니페릴 알코올의 하이드록실화 단계를 조절하는 F5H 유전자를 동일한 벡터에 클로닝하였다. 또한, 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb58을 슈퍼 프로모터로 발현되도록 제작하여 동일한 벡터에 클로닝하였다. F5H와 Myb58 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR로 증폭하여 염기서열을 확인하고 기존에 UGT72E3 /2-1- myc 유전자가 클로닝 되어 있는 발현 벡터의 프로모터 상위에 있는 EcoRⅠ 부위와 OCS 터미네이터의 하위에 있는 HindⅢ 부위에 각각 클로닝하여 3개 유전자의 발현 카세트를 병렬로 연결하였다(도 1). 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 3개의 유전자가 유전자 발현 억제(silencing) 없이 동시에 발현될 수 있다.
3. UGT72E3 /2-1- myc , F5H 및 Myb58 유전자 과발현 형질전환 식물체 제작
상기 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자를 모두 포함하는 다중 유전자 발현용 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens) EHA105로 옮긴 다음 이 균주를 사용하여 애기장대를 인 플랜타(in planta) 방법으로 형질전환시켰다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 큰 영향을 받으므로 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT) 제초제 저항성 애기장대 형질전환체들 중에서 전이유전자 UGT72E3 /2-1- myc에 의해 생성되는 당전이 효소 단백질이 안정적으로 과발현되는 형질전환체를 선발하기 위해 형질전환체 1세대(T1)를 대상으로 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. T1 식물체에서 전체 단백질을 분리하여 단백질 10 ug씩 SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 크기별로 분리하고 NC 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼한 후 1차 항체(myc 에피토프 단일 항체)와 2차 항체(HRP가 결합된 마우스 IgG 항체)에 각각 반응시키고 ECL 키트를 이용하여 UGT72E2/3-1-myc 단백질의 발현 수준을 확인하였다(도 2).
실시예 1. 토양재배한 UGT72E3 /2-1- myc , F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체의 잎에서의 코니페린 및 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
일반적으로 속씨식물 잎에서 페닐프로파노이드 합성경로의 활성화에 의해 생성되는 모노리그놀(monolignol)은 당전이 효소에 의해서 대부분의 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)이 코니페린으로 전환된다. 극히 일부의 코니페릴 알코올이 효소적 작용에 의해서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올(sinapyl alcohol)로 전환되지만, 낮은 당전이 효소의 활성에 의해 시린진으로의 전환율은 매우 낮다. 일부 시나필 알코올은 자외선을 흡수하여 잎을 보호하는 기능을 하는 시나필 에스터로 전환되기도 한다.
본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체와 애기장대 야생형을 토양재배한 후 식물체의 잎에서의 코니페린 및 시린진 함량을 측정한 결과, 야생형의 잎에서 거의 검출되지 않았던 코니페린과 시린진이 형질전환체의 잎에서 현저히 높은 수준으로 생성된 것을 확인하였다. 이는 UGT72E3/2-1-myc과 과발현되는 F5H와 Myb58이 대사공학적으로 시나필 알코올의 공급을 증가시켜 식물체 내에서 시린진 합성 증진 효과를 나타내는 것으로 사료되었다(도 3).
실시예 2. 수경재배한 UGT72E3 /2-1- myc , F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체의 잎에서의 코니페린 및 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
항상 빛에 노출되어 있는 잎과 달리 식물의 뿌리는 빛에 노출이 되면 빛 신호전달 기작에 의해서 페닐프로파노이드 합성경로에 관여하는 다양한 유전자의 발현이 증가하여 많은 양의 코니페릴 알코올 및 시나필 알코올을 포함하는 모노리그놀의 합성이 증가할 수 있다.
본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체와 애기장대 야생형을 토양재배한 후 식물체의 잎 또는 뿌리에서의 코니페린 및 시린진 함량을 측정한 결과, 야생형의 잎에서 거의 검출되지 않았던 코니페린과 시린진이 형질전환체의 잎에서 현저히 높은 수준으로 생성된 것을 확인하였다. 특히, 형질전환체 중 UGT72E2/3-1-myc 단백질의 발현량이 가장 높았던 T1-14-3 라인의 잎에서 시린진이 코니페린의 약 76% 수준(약 88 umol)으로 생성되어 식물체 내 시린진 함량이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 4). 이는 교배 및 유전자 선발을 통해서 이루어지는 복수의 전이 유전자를 한 식물체에 축적하는 과정에서 쉽게 발생하는 유전자공동억제 현상이 거의 없이 전이 유전자의 발현량을 높게 유지하기 때문에 최종 산물인 시린진의 생산량이 크게 증가한 것으로 사료되었다.
실시예 3. UGT72E3 /2-1- myc , F5H, Myb58 과발현 형질전환체의 전체 대사체 분석
UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자를 동시에 과발현하는 형질전환체 중에서 UGT72E3/2-1-myc의 단백질 발현량이 가장 높은 라인(T1-14-3)과 야생형을 대상으로 RNA-seq 방법을 이용해서 전체 대사체(metabolome) 변화를 비교 분석하여 시린진 생산량 증대에 대한 분자생물학적 원인을 규명하고자 하였다.
그 결과, T1-14-3 라인에서는 UGT72E3 /2-1- myc, F5H 및 Myb58 유전자뿐만 아니라 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련된 유전자의 발현과(도 5) 페닐프로파노이드 생합성 경로의 출발 물질인 페닐알라닌 합성에 관여하는 쉬킴산 합성 경로(shikimate pathway)에서 일차대사 합성 경로와 관련된 유전자의 발현이 야생형에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 6). 반면, 시린진 합성에 필요한 대사체를 공동으로 사용하는 플라보노이드 합성 경로에 관여하는 유전자들은 야생형에 비해서 크게 감소하였다. 상기와 같은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체의 전사체 분석 결과를 통해 대사체의 흐름이 시린진 생합성 쪽으로 집중되고 있음을 알 수 있었고, 시린진 생산량 증대 효과와 밀접한 관련성이 있을 것으로 사료되었다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Method for producing transgenic plant with increased syringin content using multiple gene expression system and plant thereof <130> PN19260 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT72E3/2-1-myc <400> 1 atgcatatca caaaaccaca cgccgccatg ttttccagtc ccggaatggg ccatgtcctc 60 ccggtgatcg agctagctaa gcgtctctcc gctaaccacg gcttccacgt caccgtcttc 120 gtccttgaaa ctgacgcagc ctccgttcag tccaagctcc ttaactcaac cggtgttgac 180 atcgtcaacc ttccatcgcc cgacatttct ggcttggtag accccaacgc ccatgtggtg 240 accaagatcg gagtcattat gcgtgaagct gttccaaccc tccgatccaa gatcgttgcc 300 atgcatcaaa acccaacggc tctgatcatt gacttgtttg gcacagatgc gttatgtctt 360 gcagcggagt taaacatgtt gacttatgtc tttatcgctt ccaacgcgcg ttatctcgga 420 gtttcgatat attatccaac tttggacgaa gttatcaaag aagagcacac agtgcaacga 480 aaaccgctca ctataccggg gtgtgaaccg gttagatttg aagatattat ggatgcatat 540 ctggttccgg acgaaccggt gtaccacgat ttggttcgtc actgtctggc ctacccaaaa 600 gcggatggaa tcttggtgaa tacatgggaa gagatggagc ccaaatcatt aaagtccctt 660 caagacccga aacttttggg ccgggtcgct cgtgtaccgg tttatccggt tggtccgtta 720 tgcagaccga tacaatcatc cacgaccgat cacccggttt ttgattggtt aaacaaacaa 780 ccaaacgagt cggttctcta catttccttc gggagtggtg gttctctaac ggctcaacag 840 ttaaccgaat tggcgtgggg gctcgaggag agccagcaac ggtttatatg ggtggttcga 900 ccgcccgttg acggctcgtc ttgcagtgat tatttctcgg ctaaaggcgg tgtaaccaaa 960 gacaacacgc cagagtatct accagaaggg ttcgtgactc gtacttgcga tagaggtttc 1020 gtggtcccct catgggcccc acaagctgaa atcctgtccc atcgggccgt tggtgggttt 1080 ttgacccatt gcggttggag ctcgacgttg gaaagcgtcg ttggcggcgt tccgatgatc 1140 gcatggccac tttttgccga gcagaatatg aatgcggcgt tgctcagcga cgaactggga 1200 atcgcagtca gattggatga tccaaaggag gatatttcta ggtggaagat tgaggcgttg 1260 gtgaggaagg ttatgactga gaaggaaggt gaagcgatga gaaggaaagt gaagaagttg 1320 agagactcgg cggagatgtc actgagcatt gacggtggtg gtttggcgca cgagtcgctt 1380 tgcagagtca ccaaggagtg tcaacggttt ttggaacgtg tcgtggactt gtcacgtggt 1440 gctcgcgcgt ccgagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgcgcgcgtc cgagcaaaag 1500 ctcatttctg aagaggactt gcgcgcgtcc gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg 1560 cgcgcgttat aa 1572 <210> 2 <211> 523 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT72E3/2-1-myc <400> 2 Met His Ile Thr Lys Pro His Ala Ala Met Phe Ser Ser Pro Gly Met 1 5 10 15 Gly His Val Leu Pro Val Ile Glu Leu Ala Lys Arg Leu Ser Ala Asn 20 25 30 His Gly Phe His Val Thr Val Phe Val Leu Glu Thr Asp Ala Ala Ser 35 40 45 Val Gln Ser Lys Leu Leu Asn Ser Thr Gly Val Asp Ile Val Asn Leu 50 55 60 Pro Ser Pro Asp Ile Ser Gly Leu Val Asp Pro Asn Ala His Val Val 65 70 75 80 Thr Lys Ile Gly Val Ile Met Arg Glu Ala Val Pro Thr Leu Arg Ser 85 90 95 Lys Ile Val Ala Met His Gln Asn Pro Thr Ala Leu Ile Ile Asp Leu 100 105 110 Phe Gly Thr Asp Ala Leu Cys Leu Ala Ala Glu Leu Asn Met Leu Thr 115 120 125 Tyr Val Phe Ile Ala Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Gly Val Ser Ile Tyr 130 135 140 Tyr Pro Thr Leu Asp Glu Val Ile Lys Glu Glu His Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Lys Pro Leu Thr Ile Pro Gly Cys Glu Pro Val Arg Phe Glu Asp Ile 165 170 175 Met Asp Ala Tyr Leu Val Pro Asp Glu Pro Val Tyr His Asp Leu Val 180 185 190 Arg His Cys Leu Ala Tyr Pro Lys Ala Asp Gly Ile Leu Val Asn Thr 195 200 205 Trp Glu Glu Met Glu Pro Lys Ser Leu Lys Ser Leu Gln Asp Pro Lys 210 215 220 Leu Leu Gly Arg Val Ala Arg Val Pro Val Tyr Pro Val Gly Pro Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Ile Gln Ser Ser Thr Thr Asp His Pro Val Phe Asp Trp 245 250 255 Leu Asn Lys Gln Pro Asn Glu Ser Val Leu Tyr Ile Ser Phe Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Ser Leu Thr Ala Gln Gln Leu Thr Glu Leu Ala Trp Gly Leu 275 280 285 Glu Glu Ser Gln Gln Arg Phe Ile Trp Val Val Arg Pro Pro Val Asp 290 295 300 Gly Ser Ser Cys Ser Asp Tyr Phe Ser Ala Lys Gly Gly Val Thr Lys 305 310 315 320 Asp Asn Thr Pro Glu Tyr Leu Pro Glu Gly Phe Val Thr Arg Thr Cys 325 330 335 Asp Arg Gly Phe Val Val Pro Ser Trp Ala Pro Gln Ala Glu Ile Leu 340 345 350 Ser His Arg Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Ser Ser 355 360 365 Thr Leu Glu Ser Val Val Gly Gly Val Pro Met Ile Ala Trp Pro Leu 370 375 380 Phe Ala Glu Gln Asn Met Asn Ala Ala Leu Leu Ser Asp Glu Leu Gly 385 390 395 400 Ile Ala Val Arg Leu Asp Asp Pro Lys Glu Asp Ile Ser Arg Trp Lys 405 410 415 Ile Glu Ala Leu Val Arg Lys Val Met Thr Glu Lys Glu Gly Glu Ala 420 425 430 Met Arg Arg Lys Val Lys Lys Leu Arg Asp Ser Ala Glu Met Ser Leu 435 440 445 Ser Ile Asp Gly Gly Gly Leu Ala His Glu Ser Leu Cys Arg Val Thr 450 455 460 Lys Glu Cys Gln Arg Phe Leu Glu Arg Val Val Asp Leu Ser Arg Gly 465 470 475 480 Ala Arg Ala Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ala 485 490 495 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ala Ser Glu Gln 500 505 510 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ala Leu 515 520 <210> 3 <211> 1563 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 atggagtctt ctatatcaca aacactaagc aaactatcag atcccacgac gtctcttgtc 60 atcgttgtct ctcttttcat cttcatcagc ttcatcacac ggcggcgaag gcctccatat 120 cctcccggtc cacgaggttg gcccatcata ggcaacatgt taatgatgga ccaactcacc 180 caccgtggtt tagccaattt agctaaaaag tatggcggat tgtgccatct ccgcatggga 240 ttcctccata tgtacgctgt ctcatcaccc gaggtggctc gacaagtcct tcaagtccaa 300 gacagcgtct tctcgaaccg gcctgcaact atagctataa gctatctgac ttacgaccga 360 gcggacatgg ctttcgctca ctacggaccg ttttggagac agatgagaaa agtgtgtgtc 420 atgaaggtgt ttagccgtaa aagagctgag tcatgggctt cagttcgtga tgaagtggac 480 aaaatggtcc ggtcggtctc ttgtaacgtt ggtaagccta taaacgtcgg ggagcaaatt 540 tttgcactga cccgcaacat aacttaccgg gcagcgtttg ggtcagcctg cgagaaggga 600 caagacgagt tcataagaat cttacaagag ttctctaagc tttttggagc cttcaacgta 660 gcggatttca taccatattt cgggtggatc gatccgcaag ggataaacaa gcggctcgtg 720 aaggcccgta atgatctaga cggatttatt gacgatatta tcgatgaaca tatgaagaag 780 aaggagaatc aaaacgctgt ggatgatggg gatgttgtcg ataccgatat ggttgatgat 840 cttcttgctt tttacagtga agaggccaaa ttagtcagtg agacagcgga tcttcaaaat 900 tccatcaaac ttacccgtga caatatcaaa gcaatcatca tggacgttat gtttggagga 960 acggaaacgg tagcgtcggc gatagagtgg gccttaacgg agttattacg gagccccgag 1020 gatctaaaac gggtccaaca agaactcgcc gaagtcgttg gacttgacag acgagttgaa 1080 gaatccgaca tcgagaagtt gacttatctc aaatgcacac tcaaagaaac cctaaggatg 1140 cacccaccga tccctctcct cctccacgaa accgcggagg acactagtat cgacggtttc 1200 ttcattccca agaaatctcg tgtgatgatc aacgcgtttg ccataggacg cgacccaacc 1260 tcttggactg acccggacac gtttagacca tcgaggtttt tggaaccggg cgtaccggat 1320 ttcaaaggga gcaatttcga gtttataccg ttcgggtcgg gtcgtagatc gtgcccgggt 1380 atgcaactag ggttatacgc gcttgactta gccgtggctc atatattaca ttgcttcacg 1440 tggaaattac ctgatgggat gaaaccaagt gagctcgaca tgaatgatgt gtttggtctc 1500 acggctccta aagccacgcg gcttttcgcc gtgccaacca cgcgcctcat ctgtgctctt 1560 taa 1563 <210> 4 <211> 520 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Glu Ser Ser Ile Ser Gln Thr Leu Ser Lys Leu Ser Asp Pro Thr 1 5 10 15 Thr Ser Leu Val Ile Val Val Ser Leu Phe Ile Phe Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Thr Arg Arg Arg Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro 35 40 45 Ile Ile Gly Asn Met Leu Met Met Asp Gln Leu Thr His Arg Gly Leu 50 55 60 Ala Asn Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Gly Leu Cys His Leu Arg Met Gly 65 70 75 80 Phe Leu His Met Tyr Ala Val Ser Ser Pro Glu Val Ala Arg Gln Val 85 90 95 Leu Gln Val Gln Asp Ser Val Phe Ser Asn Arg Pro Ala Thr Ile Ala 100 105 110 Ile Ser Tyr Leu Thr Tyr Asp Arg Ala Asp Met Ala Phe Ala His Tyr 115 120 125 Gly Pro Phe Trp Arg Gln Met Arg Lys Val Cys Val Met Lys Val Phe 130 135 140 Ser Arg Lys Arg Ala Glu Ser Trp Ala Ser Val Arg Asp Glu Val Asp 145 150 155 160 Lys Met Val Arg Ser Val Ser Cys Asn Val Gly Lys Pro Ile Asn Val 165 170 175 Gly Glu Gln Ile Phe Ala Leu Thr Arg Asn Ile Thr Tyr Arg Ala Ala 180 185 190 Phe Gly Ser Ala Cys Glu Lys Gly Gln Asp Glu Phe Ile Arg Ile Leu 195 200 205 Gln Glu Phe Ser Lys Leu Phe Gly Ala Phe Asn Val Ala Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Tyr Phe Gly Trp Ile Asp Pro Gln Gly Ile Asn Lys Arg Leu Val 225 230 235 240 Lys Ala Arg Asn Asp Leu Asp Gly Phe Ile Asp Asp Ile Ile Asp Glu 245 250 255 His Met Lys Lys Lys Glu Asn Gln Asn Ala Val Asp Asp Gly Asp Val 260 265 270 Val Asp Thr Asp Met Val Asp Asp Leu Leu Ala Phe Tyr Ser Glu Glu 275 280 285 Ala Lys Leu Val Ser Glu Thr Ala Asp Leu Gln Asn Ser Ile Lys Leu 290 295 300 Thr Arg Asp Asn Ile Lys Ala Ile Ile Met Asp Val Met Phe Gly Gly 305 310 315 320 Thr Glu Thr Val Ala Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Leu Leu 325 330 335 Arg Ser Pro Glu Asp Leu Lys Arg Val Gln Gln Glu Leu Ala Glu Val 340 345 350 Val Gly Leu Asp Arg Arg Val Glu Glu Ser Asp Ile Glu Lys Leu Thr 355 360 365 Tyr Leu Lys Cys Thr Leu Lys Glu Thr Leu Arg Met His Pro Pro Ile 370 375 380 Pro Leu Leu Leu His Glu Thr Ala Glu Asp Thr Ser Ile Asp Gly Phe 385 390 395 400 Phe Ile Pro Lys Lys Ser Arg Val Met Ile Asn Ala Phe Ala Ile Gly 405 410 415 Arg Asp Pro Thr Ser Trp Thr Asp Pro Asp Thr Phe Arg Pro Ser Arg 420 425 430 Phe Leu Glu Pro Gly Val Pro Asp Phe Lys Gly Ser Asn Phe Glu Phe 435 440 445 Ile Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Gln Leu Gly 450 455 460 Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Ala Val Ala His Ile Leu His Cys Phe Thr 465 470 475 480 Trp Lys Leu Pro Asp Gly Met Lys Pro Ser Glu Leu Asp Met Asn Asp 485 490 495 Val Phe Gly Leu Thr Ala Pro Lys Ala Thr Arg Leu Phe Ala Val Pro 500 505 510 Thr Thr Arg Leu Ile Cys Ala Leu 515 520 <210> 5 <211> 825 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 atgggcaaag gaagagcacc atgttgtgac aaaaccaaag tgaagagagg accatggagc 60 catgatgaag acttgaaact catctctttc attcacaaga atggtcatga gaattggaga 120 tctctcccaa agcaagctgg attgttgagg tgtggcaaga gttgtcgtct gcgatggatt 180 aattacctca gacctgatgt gaaacgtggc aatttcagtg cagaggaaga agacaccatc 240 atcaaacttc accagagctt tggtaacaag tggtcgaaga ttgcttctaa gctgcctgga 300 agaacagaca atgagatcaa gaatgtgtgg catacacatc tcaagaaaag attgagctcg 360 gaaactaacc ttaatgccga tgaagcgggt tcaaaaggtt ctttgaatga agaagagaac 420 tctcaagagt catctccaaa tgcttcaatg tcttttgctg gttccaacat ttcaagcaaa 480 gacgatgatg cacagataag tcaaatgttt gagcacattc taacttatag cgagtttacg 540 gggatgttac aagaggtaga caaaccagag ctgctggaga tgccttttga tttagatcct 600 gacatttgga gtttcataga tggttcagac tcattccaac aaccagagaa cagagctctt 660 caagagtctg aagaagatga agttgataaa tggtttaagc acctggaaag cgaactcggg 720 ttagaagaaa acgataacca acaacaacaa caacagcata aacagggaac agaagatgaa 780 cattcatcat cactcttgga gagttacgag ctcctcatac attaa 825 <210> 6 <211> 274 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Gly Lys Gly Arg Ala Pro Cys Cys Asp Lys Thr Lys Val Lys Arg 1 5 10 15 Gly Pro Trp Ser His Asp Glu Asp Leu Lys Leu Ile Ser Phe Ile His 20 25 30 Lys Asn Gly His Glu Asn Trp Arg Ser Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu 35 40 45 Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg 50 55 60 Pro Asp Val Lys Arg Gly Asn Phe Ser Ala Glu Glu Glu Asp Thr Ile 65 70 75 80 Ile Lys Leu His Gln Ser Phe Gly Asn Lys Trp Ser Lys Ile Ala Ser 85 90 95 Lys Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr 100 105 110 His Leu Lys Lys Arg Leu Ser Ser Glu Thr Asn Leu Asn Ala Asp Glu 115 120 125 Ala Gly Ser Lys Gly Ser Leu Asn Glu Glu Glu Asn Ser Gln Glu Ser 130 135 140 Ser Pro Asn Ala Ser Met Ser Phe Ala Gly Ser Asn Ile Ser Ser Lys 145 150 155 160 Asp Asp Asp Ala Gln Ile Ser Gln Met Phe Glu His Ile Leu Thr Tyr 165 170 175 Ser Glu Phe Thr Gly Met Leu Gln Glu Val Asp Lys Pro Glu Leu Leu 180 185 190 Glu Met Pro Phe Asp Leu Asp Pro Asp Ile Trp Ser Phe Ile Asp Gly 195 200 205 Ser Asp Ser Phe Gln Gln Pro Glu Asn Arg Ala Leu Gln Glu Ser Glu 210 215 220 Glu Asp Glu Val Asp Lys Trp Phe Lys His Leu Glu Ser Glu Leu Gly 225 230 235 240 Leu Glu Glu Asn Asp Asn Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Lys Gln Gly 245 250 255 Thr Glu Asp Glu His Ser Ser Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Glu Leu Leu 260 265 270 Ile His

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전화시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 함량을 증가시키는 방법.
  4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 제4항의 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진(syringin) 함량이 증가된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진(syringin) 함량 증진용 조성물.
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KR20140058183A (ko) * 2012-11-06 2014-05-14 동아대학교 산학협력단 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체

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Tackmin Kwon 등. 2018 한국육종학회·차세대BG21사업단·GSP사업단 공동심포지엄, 페이지 165 (2018.07.11.)* *

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