KR102559326B1 - 다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 - Google Patents

다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 피부의 주름 개선 및 미백 효과가 우수하여 의약품, 식품 및 화장품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있는 식물 유래의 코니페린을 식물체에서 효과적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법{Method for producing transgenic plant with increased coniferin content using multiple gene expression system}
본 발명은 다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
코니페린(coniferin)은 리그닌계 배당체로 페닐프로파노이드 합성경로를 통해서 생성된 리그닌 구성 성분인 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol, G type monolignol)이 당전이 효소(UDP-glucosyltransferase)에 의해서 배당체가 됨으로써 생성된다. 모델 식물체인 애기장대에는 약 100여 종의 당전이 효소가 있으며, 식물 호르몬을 비롯한 다양한 화합물의 배당체를 형성함으로써 이들 화합물이 세포 내에서 비활성화되고 액포에 저장되는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 이들 중에서 당전이 효소 UGT72E2(UDP-glycosyltransferase 72E2)는 상대적으로 효소 활성이 높으나 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)과 시나필 알코올(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성이 낮아 기질의 농도에 따라 코니페린과 시린진을 혼합하여 합성하는 단점이 있다. 따라서 식물체에서 효과적으로 코니페린을 생산할 수 있는 기질 특이성이 강화된 새로운 당전이 효소의 개발은 기능성 이차대사산물인 코니페린의 대량생산 및 응용에 앞서 먼저 해결되어야 할 난제이다.
코니페린은 오가피와 가시오가피의 뿌리와 줄기에 많이 생성되는 대표적 약리적 성분으로 콜라겐 분해 효소인 콜라게나제(collagenase)와 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제(elastase)의 활성을 억제하여 피부의 주름 개선 효과가 우수하며 멜라닌 합성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수한 것으로 보고되고 있다. 따라서 코니페린은 의약품 산업과 식품산업 및 화장품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있다.
한편, 한국등록특허 제1399944호에는 재조합 당전이 효소 UGT72E-3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 이용한 '시린진과 코니페린 함량이 증가된 형질전환 콩 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 콩 식물체'가 개시되어 있으나, 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자 및 Myb63 코딩 유전자를 이용한 본 발명의 '다중 유전자 발현 시스템을 이용한 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자 및 페닐프로파노이드 생합성 경로에 관여하는 양성 조절인자인 Myb63 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자를 동시에 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조한 후 코니페린(coniferin) 함량을 측정한 결과, UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 코니페린 함량이 야생형에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)에서 시나필 알코올(sinapyl alcohol)로의 전환에 관여하는 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 유전자가 넉아웃된 돌연변이체를 형질전환시킬 경우, 시린진(syringin)의 생산을 차단함으로써 코니페린의 순수 분리에 최적화된 형질전환 식물체를 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 포함하는 코니페린 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 코니페린을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 코니페린 함량 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 피부의 주름 개선 및 미백 효과가 우수하여 의약품, 식품 및 화장품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있는 식물 유래의 코니페린을 식물체에서 효과적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체에서 UGT72E2/3-1-myc 단백질(57 kDa)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 야생형 애기장대(WT col-0), UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체 T1-23-7, T1-32-10 및 T1-39-5 라인의 잎에서 코니페린(Coniferin, C)과 시린진(Syringin, S) 함량을 분석한 HPLC(High performance liquid chromatography) 크로마토그램이다.
도 4는 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체 T1-23-7, T1-32-10 및 T1-39-5 라인의 잎에서 코니페린(coniferin) 및 시린진(syringin) 함량을 분석한 결과이다.
도 5는 야생형 애기장대(col-0) 및 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 야생형 애기장대의 T1-39-5 라인을 토양재배(soil) 또는 수경재배(liquid)한 후, 토양재배한 식물체의 잎과 수경재배한 식물체의 뿌리 및 잎에서 코니페린(coniferin) 및 시린진(syringin) 함량을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 야생형 애기장대 식물체(Col-0)와 F5H 넉아웃 돌연변이체 T1-30-8 라인(f5h)에서 UGT72E2/3-1-myc 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 야생형 애기장대(WT col-0) 및 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 F5H 넉아웃 돌연변이체 T1-30-8 라인을 토양재배(soil) 또는 수경재배(liquid)한 후, 토양재배한 식물체의 잎과 수경재배한 식물체의 뿌리 및 잎에서 코니페린(coniferin)과 시린진(syringin) 함량을 분석한 결과이다.
도 8은 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체 T1-39-5 라인에서 전이유전자들과 Myb63 전사 조절자에 의해서 조절되는 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련된 유전자들의 발현 수준을 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 9는 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 코니페린을 순수 분리하기 위해 수행된 오픈컬럼크로마토그래피(Open column chromatography)의 이동상 조건과, 분획물 E층에서 코니페린이 검출된 박막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 결과이다.
도 10은 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 코니페린을 순수 분리하기 위해 수행된 TLC의 용매 조건을 보여준다. CHCl3: 클로로포름, MeOH: 메탄올, Acetone: 아세톤, EtOAc: 에틸아세테이트, C: 코니페린(coniferin), S: 시린진(syringin), M.E: methanol extract.
도 11은 TLC 분석을 통해 시린진 스팟이 나타난 분획물 E층을 취합 및 농축시켜 얻은 미색의 결정체와 HPLC용 표준품 코니페린을 대상으로 수행한 HPLC 분석 결과를 보여주는 크로마토그램이다.
도 12는 HPLC용 표준품 코니페린에 대한 검량곡선이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 포함하는 코니페린 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 식물체 내에서 코니페린의 합성을 증가시키기 위해서 당전이 활성과 코니페린 알코올(coniferin alcohol)에 대한 기질 특이성을 강화한 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2 및 UGT72E3 단백질을 코딩하는 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E2/3을 제조하였고, 상기 재조합 유전자로부터 발현되는 단백질의 카복시 말단에 3개의 Myc 에피토프(epitope)를 포함하는 42개의 아미노산 서열을 추가한 새로운 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc을 제조하였다. Myc 에피토프의 결합은 면역블롯팅(immunoblotting) 분석을 통해 단백질의 발현량을 확인하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라 목적 단백질(효소)의 활성을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명에 따른 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 단백질의 범위는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내의 코니페린 합성 증가를 의미한다.
또한, 상기 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 범위는 UGT72E2/3-1-myc 또는 Myb63 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1 및 서열번호 3의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자들이 병렬로 연결된 다중 유전자 발현용 재조합 벡터로, 구체적으로는 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb63 단백질 코딩 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 염기서열을 확인한 후 UGT72E2/3-1-myc 유전자가 클로닝되어 있는 발현 벡터에 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 2개의 유전자가 유전자 발현 억제(silencing)를 최소화하면서 동시에 발현될 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될수 있다. 상기 발현 벡터의중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(Geneticin), 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(Nopaline synthase, NOS), 벼 α아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 코니페린을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체에서 코니페린을 생산하는 방법에 있어서, 상기 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.
본 발명의 재조합 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명의 식물 발현 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 식물 발현 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명의 식물체에서 코니페린을 생산하는 방법은 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자로 형질전환된 식물세포로부터 합성된 코니페린을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC를 통해 코니페린을 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 각각 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 2개의 유전자가 유전자 발현 억제 없이 동시에 발현될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에서, UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 야생형 애기장대 식물체 또는 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해된 돌연변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 F5H 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, F5H 단백질 코딩 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 F5H 유전자의 발현 저해는 VIGS(Virus-induced gene silencing), RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 유전자 교정 시스템 또는 방사선 조사를 통한 돌연변이 유발에 의해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 F5H 코딩 유전자의 발현이 저해된 F5H 넉아웃 돌연변이체는 EMS(ethyl methane sulfonate) 처리 돌연변이체 집단에서 분리된 것으로, 코딩 영역의 292번째 염기 C가 T로 전환되어 글루타민 대신 종결코돈이 형성된 돌연변이체이다.
상기 F5H 유전자의 발현 저해는 형질전환 식물체에서 시린진의 합성을 억제하여 순수한 코니페린 생성을 유도할 수 있다.
본 발명의 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하며, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된, 야생형에 비해 코니페린 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에서 새롭게 제조된 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체는 UGT72E2/3-1-myc 과발현 형질전환체 또는 Myb63 과발현 형질전환체에 비해 식물체 내 코니페린 함량 증진 효과가 우수한 특징이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 코니페린 함량 증진용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc을 코딩하는 유전자 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 코니페린 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자를 포함하는 다중 유전자 발현용 재조합 벡터의 제작
재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자의 코딩 영역을 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절되도록 pCambia 3300 기반 바이너리 벡터에 클로닝하였다. 또한, 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb63을 슈퍼 프로모터(mas2'(mannopine synthase2') 전사 활성 요소와 ocs(octopine synthase) 전사 활성 요소의 삼량체로 구성; Plant Physiology, 2007, 145, p.1294-1300)로 발현되도록 제작하고 동일한 벡터에 클로닝하였다. Myb63 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR로 증폭한 후 염기서열을 확인하고, 기존 UGT72E2/3-1-myc 유전자가 클로닝되어 있는 발현 벡터의 프로모터 상류(upstream)에 있는 EcoRⅠ 부위에 클로닝하여 2개의 유전자 발현 카세트를 병렬로 연결하였다. 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환 이벤트로 전이되는 2개의 유전자가 유전자공동억제 현상없이 동시에 발현되는 새로운 다중 유전자 발현 벡터 시스템을 완성하였다(도 1).
실시예 2. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체에서 UGT72E2/3-1-myc 단백질의 발현량 분석
UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스(A. tumefaciens) GV3101로 옮기고, 이 박테리아를 사용하여 애기장대를 인 플랜타(in planta) 방법으로 형질전환시켰다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 의해서 크게 영향을 받으므로 PPT(phosphinothricin)에 대한 저항성을 보이는 애기장대 형질전환체들 중에서 전이유전자 UGT72E2/3-1-myc에 의해 생성되는 당전이 효소 단백질을 안정적으로 과발현하는 형질전환체를 선발하기 위해서 형질전환 1세대(T1)에서 면역 블롯 방법으로 조사하여 세대를 진전시켰다.
재조합 당전이 효소의 발현량에 따른 코니페린 생산량을 비교하기 위해 T1 식물체에서 전체 단백질을 분리하여 20 ug씩 SDS-PAGE를 수행하여 크기별로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼하고 면역 블롯을 수행하였다. 그 다음, Myc 에피톱(epitope)에 대한 단일 항체를 1차 항체로 사용하였고, mouse IgG에 대한 과산화효소(peroxidase)가 부착된 항체를 2차 항체로 이용하였으며, ECL 키트를 이용하여 UGT72E2/3-1-myc의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, 형질전환체 T1-23-7, T1-32-10 및 T1-39-5 라인 중 T1-23-7과 T1-39-5에서 UGT72E2/3-1-myc가 발현된 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 잎에서 코니페린 및 시린진 생성량의 정량적 HPLC 분석
일반적으로 속씨식물의 잎에서 페닐프로파노이드 합성 경로의 활성화에 의해 생성되는 모노리그놀(monolignol)은 대부분 코니페릴 알코올로, 당전이 효소에 의해서 코니페린으로 전환된다. 이후 극히 일부의 코니페릴 알코올이 효소적 작용에 의해서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올로 전환된다.
본 발명에서 야생형 애기장대, UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체 T1-23-7, T1-32-10 및 T1-39-5 라인을 토양에서 재배한 후 각 식물체의 잎에서 코니페린과 시린진 함량을 측정한 결과, 야생형 잎에서는 코니페린 및 시린진 모두 검출되지 않았고, 형질전환체에서는 HPLC용 표준품으로 사용된 코니페린(코니페릴 알코올 4-O-글루코시드) 및 시린진(시나필 알코올 4-O-글루코시드)과 동일한 보유시간에서 피크가 나타난 것을 확인하였다. 형질전환체에서 시린진은 아주 소량으로 검출되었고, 형질전환체 중에서 UGT72E2/3-1-myc의 발현 수준이 가장 높았던 T1-39-5 라인에서 코니페린의 검출량이 가장 많음을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이를 통해, UGT72E2/3-1-myc 발현량과 코니페린 생산량이 비례하게 증가함을 알 수 있었다.
실시예 4. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 재배 조건에 따른 코니페린과 시린진 함량 분석
본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 야생형 애기장대 식물체(T1-39-5 라인)를 토양재배 또는 수경재배한 후, 토양재배한 식물체의 잎과 수경재배한 식물체의 뿌리 및 잎에서 코니페린 및 시린진 함량을 측정한 결과, 시린진은 토양재배에서 13.1 μmol/g, 수경재배에서 30.19 μmol/g으로 소량 검출된 반면, 코니페린은 토양재배에서 480.11 μmol/g, 수경재배에서 337.48 μmol/g으로 다량 검출된 것을 확인하였다(도 5).
항상 빛에 노출되어 있는 잎과 달리 식물의 뿌리는 빛에 노출되면 빛 신호전달 기작에 의해서 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자의 발현이 증가하여 많은 양의 코니페릴 알코올 및 시나필 알코올을 포함하는 모노리그놀의 합성이 증가할 수 있다. 본 발명에서는 상기 수경재배 조건에서 배양된 형질전환체를 대상으로 대사산물 분석을 수행하여 뿌리의 광자극으로 인해 코니페린 생산량이 증가된 것임을 알 수 있었다.
실시예 5. F5H 넉아웃 돌연변이체를 이용한 형질전환체에서 코니페린 함량 분석
코니페린 생산의 최적화를 위해 페닐프로파노이드 합성 경로에서 시나필 알코올로의 전환에 필요한 코니페릴 알코올의 하이드록실화 단계를 조절하는 F5H 유전자를 넉아웃시킨 돌연변이체를 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하여, UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자가 과발현된 돌연변이체를 제조하였다. 본 발명에서 사용된 F5H 넉아웃 돌연변이체는 EMS(ethyl methane sulfonate) 처리 돌연변이체 집단에서 분리된 것으로, 코딩 영역의 292번째 염기 C가 T로 전환되어 글루타민 대신 종결코돈이 형성된 돌연변이체이며, 애기장대 종자은행에서 구입하여 사용하였다.
상기 형질전환된 돌연변이체와 야생형 돌연변이체를 대상으로 UGT72E2/3-1-myc의 발현 수준을 분석한 결과, 형질전환된 돌연변이체 T1-30-8 라인이 야생형 돌연변이체와 유사한 수준으로 UGT72E2/3-1-myc이 발현된 것을 확인하였다(도 6).
또한, 상기 형질전환된 돌연변이체 T1-30-8 라인을 토양재배 또는 수경재배한 후, 토양재배한 식물체의 잎과 수경재배한 식물체의 뿌리 및 잎에서의 코니페린 및 시린진 함량을 측정한 결과, 시린진은 토양재배에서 2.7 μmol/g, 수경재배에서 0.33 μmol/g으로 극소량 검출된 반면, 코니페린은 토양재배에서 425.98 μmol/g, 수경재배에서 431.07 μmol/g으로 다량 검출된 것을 확인하였다(도 7).
즉, 본 발명의 재조합 벡터로 F5H 넉아웃 돌연변이체를 형질전환시킬 경우 시린진의 생산이 차단되어 수경재배 조건에서도 시린진 생산량이 증가하지 않음을 알 수 있었고, 이를 통해 F5H 넉아웃 돌연변이체를 이용하면 순수한 코니페린 생산에 최적화된 형질전환체의 제조가 가능함을 알 수 있었다.
실시예 6. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 전체 대사체 분석
UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체 T1-39-5 라인과 야생형 애기장대를 대상으로 RNA-seq 방법을 이용하여, 전체 대사체(metabolome) 변화를 비교·분석하여 코니페린 생산량 증대에 대한 분자생물학적 원인을 규명하고자 하였다.
분석 결과, 도 8에 나타난 것과 같이, T1-39-5 라인에서는 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 유전자뿐만 아니라, 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련한 다양한 유전자의 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해, 대사체의 흐름이 코니페린 생합성 쪽으로 집중되고 있고, 코니페린 생산량 증대와 밀접한 관련성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체로부터 코니페린의 순수 분리
본 발명의 UGT72E2/3-1-myc 및 Myb63 과발현 형질전환체의 HPLC 분석 결과, 형질전환체의 건조분말 1 g 당 코니페린의 함량이 425 umol로, mg 단위로 환산 시 대략 건조분말 1 g 당 코니페린 함량이 145 mg에 달하는 높은 수준임을 확인하였다.
형질전환체의 건조분말을 25 mg 당 3 ㎖의 메탄올 비율로 40시간 동안 교반 추출하였으며, 형질전환체의 건조분말 3.76 g을 이용하여 추출물을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 이용하여 도 9의 이동상 용매 조건으로 오픈컬럼크로마토그래피를 수행하였으며, 이동상의 극성 기울기만을 이용하여 코니페린을 순수 분리하였다.
이후 TLC(도 10)를 통해 코니페린 스팟이 확인된 분획물을 취합 및 농축시켜 미색의 결정체를 획득하였고, 정성 분석을 위해 HPLC를 수행하였다. 그 결과, 표준품으로 사용된 HPLC용 코니페린(순도 90%)과 형질전환체에서 분리된 코니페린의 보유시간이 동일함을 확인하였다(도 11).
또한, 표준품으로 제작된 검량곡선(도 12)을 기준으로 하여 계산했을 때 정제된 분말 1 g 당 코니페린이 1,000 mg 이상이고, 표준품의 순도가 90%인 것을 감안하여 형질전환체로부터 정제된 코니페린의 순도가 99% 이상임을 확인하였다(표 1). 그리고 형질전환체의 건조분말 3.76 g으로부터 정제된 코니페린 340 mg을 회수하였다.
HPLC 크로마토그램의 면적값에 기반한 코니페린 함량 정량 분석
Sample (ppm) Area Concentration(mg/g)
Coniferin fraction 12.5 329265 1254.454863
Coniferin fraction 25 666058 1269.257647
Coniferin fraction 50 1331019 1268.438098
*y=20983x-237.17

Claims (10)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 포함하는 코니페린(coniferin) 합성을 위한 재조합 벡터.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 하나의 벡터 내에 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자의 발현 카세트 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 발현 카세트를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 코니페린 합성을 위한 재조합 벡터.
  4. 제1항 또는 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 코니페린(coniferin)을 생산하는 방법.
  5. 제1항 또는 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 코니페린(coniferin) 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 추가로 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 F5H 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  8. 제5항의 방법에 의해 제조된, 야생형에 비해 코니페린(coniferin) 함량이 증가된 형질전환 식물체.
  9. 제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3-1-myc 코딩 유전자; 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질 코딩 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 코니페린(coniferin) 함량 증진용 조성물.
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