KR101399941B1 - 식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 합성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명을 통해 최근 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증 치료에 우수한 효능을 보이는 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있는 식물 유래의 시린진을 식물체에서 효과적으로 대량생산할 수 있으므로, 고부가가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도{Gene encoding recombinant UGTase protein increasing syringin synthesis in plant and uses thereof}
본 발명은 식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 합성을 증가시키는 방법 및 야생형에 비해 시린진 합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 합성 증가용 조성물에 관한 것이다.
시린진(syringin)은 리그닌계 배당체로 페닐프로파노이드 합성경로를 통해서 생성된 리그닌 구성 성분인 시나필 알코올(sinapyl alcohol, s type monolignol)이 당전이 효소(UDP-glucose transferase)에 의해서 배당체가 됨으로써 생성된다. 모델 식물체인 애기장대에는 약 100여 종의 당전이 효소가 있으며 식물호르몬을 비롯한 다양한 화합물의 배당체를 형성함으로써 이들 화합물이 세포 내에서 비활성화되고 액포에 저장되는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 이들 중에서 UGT72E2 및 UGT72E3가 각각 특이적으로 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol) 및 시나필 알코올(sinapyl alcohol)과 같은 모노리그놀(monolignol)을 우선적으로 배당체로 전환시키는 당전이 효소로 보고되고 있다. 그러나 시린진 생성에 필요한 시나필 알코올 특이적 당전이 효소인 UGT72E3는 시나필 알코올에 대한 기질 특이성은 우수하나 당전이 활성이 낮아서 그 응용성이 매우 제한적이었다. 따라서 식물체에서 효과적으로 시린진을 생산할 수 있는 새로운 당전이 효소의 개발은 기능성 이차대사산물인 시린진의 대량생산 및 응용에 앞서 먼저 해결되어야 할 난제이다.
특히 엘류테로사이드 B (시린진)는 가시오가피의 스트레스에 대한 우수한 정신적 육체적 적응력 효능이 있는 약리적 성분으로 식물 유래의 대표적 적응원(Adaptogen)으로 분류되고 있다. 적응원이란 다양한 스트레스에 반응하여 부작용 없이 생체의 비특이성 저항력을 증가시키는 식물 이차대사산물을 일컫는 말이다. 최근에 순수 분리된 시린진이 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증 치료에도 우수한 효능을 보이는 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있다.
한편, 한국공개특허 제1996-0006925호에는 시린진을 함유하는 TNFα 분비 억제제가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1998-0072707호에는 간기능보호작용을 가지는 시린진의 약학적 조성물이 개시되어 있으나, 본원 발명에서와 같이 식물체 내의 시린진 합성을 증가시키는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 애기장대에서 분리된 당전이 효소(UGTase; UDP-dependent glucosyltransferase) UGT72E2는 당전이 효율은 매우 우수하나 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)에 대한 기질 특이성이 약한 반면, 당전이 효소 UGT72E3는 시나필 알코올(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성은 우수하나 당전이 효율은 낮은 단점이 있어 산업적 응용성이 제한되는 단점을 발견하였고, 이를 극복하고자 기질 특이성은 강하게 유지되면서 당전이 활성이 강화된 새로운 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2와 UGT72E3 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E2/3와 UGT72E3/2를 제조하였다.
제조된 재조합 유전자들의 효소적 특성을 조사하기 위해서 아그로박테리움을 이용하여 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자들을 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조하였고, 시린진의 합성 효율을 정량적으로 각각 비교한 결과, 새롭게 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2이 야생형에 비해 시린진 합성이 현저히 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 UGT72E3/2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진 합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 합성이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 합성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 최근 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증 치료에 우수한 효능을 보이는 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있는 식물 유래의 시린진을 식물체에서 효과적으로 대량생산할 수 있는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질의 코딩 유전자를 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 애기장대 당전이 효소 UGT72E2 및 UGT72E3의 1차 및 2차 구조를 비교한 것이다.
도 2는 애기장대와 포도 유래의 당전이 효소 UGT72B1(A) 및 VvGT1(B), 애기장대 유래의 당전이 효소 UGT72E2 및 UGT72E3, 본 발명에서 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E2/3 및 UGT72E3/2(C)의 3차 구조를 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 형질전환체 제조에 이용된 재조합 벡터(A), 형질전환체로 전이된 유전자의 발현 정도(B), 자외선에 대한 형질전환체 잎에서의 반응성(C)을 나타낸 것이다.
도 4는 애기장대 야생형과 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2인 4종의 당전이 유전자를 각각 과발현하는 형질전환체의 잎에서의 코니페린 및 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석을 나타낸 것이다((C)의 각 크로마토그램의 피크 1, 코니페릴 알코올 4-O-글루코시드(코니페린); 2, 시나필 알코올 4-O-글루코시드(시린진); 3, 코니페릴 알코올; 4, 시나필 알코올).
도 5는 애기장대 야생형과 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2인 4종의 당전이 유전자를 각각 과발현하는 형질전환체의 뿌리에서의 코니페린 및 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석을 나타낸 것이다((C)의 각 크로마토그램의 피크: 1, 코니페릴 알코올 4-O-글루코시드(코니페린); 2, 시나필 알코올 4-O-글루코시드(시린진); 3, 코니페릴 알코올; 4, 시나필 알코올).
도 6은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내의 시린진(syringin) 합성 증가를 의미한다.
본 발명은 또한 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자는 애기장대 유래의 UGT72E3 및 UGT72E2 유전자로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 제조하였다.
본 발명에서는 시린진 생성율을 증가시키기 위해서 UGT72E3처럼 시나필 알코올(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성은 유지하고 UGT72E2처럼 당전이 활성이 높은 새로운 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2 및 UGT72E3 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E2/3 및 UGT72E3/2를 제조하였다.
먼저, 애기장대의 100여 개의 당전이 효소들 중에서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올 또는 구조적으로 유사한 코니페릴 알코올에 당을 전이할 수 있는 능력이 있다고 보고된 당전이 효소 UGT72E 계통군(clade)의 효소적 특성을 조사하였다. UGT72E 계통군 또한 일반적인 당전이 효소와 비슷한 구조적 특징을 가지고 있는데, 아미노 말단 영역은 기질 인식 영역을 가지며 카르복시 말단은 UDP에 의해서 활성화된 당으로부터 당을 기질에 전이하는 효소적 활성 영역을 가지고 있고, 특히 카르복시 말단의 PSPG (Plant Secondary Product Glucosyltransferase) 모티프가 식물체 유래의 당전이 효소의 활성에 중요한 것으로 보고되고 있다. UGT72E 계통군에는 염기서열이 유사한 당전이 효소 UGT72E1, UGT72E2 및 UGT72E3가 있다.
본 발명에서는 UGT72E2 및 UGT72E3을 각각 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편으로 이분하였다. 아미노 단편은 기질인식 특이성을 결정하는 영역을 포함하고 카르복시 말단은 당전이 활성에 중요한 PSPG 모티프를 포함하고 있다. 식물체 내에서 시린진을 효율적으로 생산하기 위해서는 기질 특이성이 당전이 활성보다 중요하므로 정확히 이등분하지 않고 아미노 단편을 전체의 3/4 정도로 크게 하고 카르복시 단편은 PSPG 모티프를 포함하는 최소 크기로 나누었다. 결과적으로, 본 발명의 재조합 UGT72E3/2 유전자는 UGT72E3의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 UGT72E2의 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편을 코딩하는 유전자를 연결하여 제조하였다.
본 발명의 유전자는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, 엠피실린(Ampicillin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 UGT72E3/2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 UGT72E3/2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 잎 또는 뿌리에서 시린진 합성이 증가되고, 가장 바람직하게는 잎에서 시린진 합성이 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진(syringin) 합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진(syringin) 합성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 시린진 합성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 애기장대 당전이 효소 UGT72E2 및 UGT72E3 의 1차 및 2차 구조
본 실시예에서는 식물체 내에서 약리적으로 응용성이 많은 시린진 생산에 유용한 새로운 당전이 효소를 개발하기 위해서, 당전이 효율은 매우 우수하나 시린진의 전구체인 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)에 대한 기질 특이성이 약한 UGT72E2와 시나필 알코올(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성은 우수하나 당전이 효율이 낮은 단점이 있는 UGT72E3 단백질의 1차 및 2차 구조를 SWISS-MODEL workspace를 이용하여 서로 비교하였다(도 1). 두 효소의 장점을 모두 갖춘 새로운 재조합 당전이 효소를 제작하기 위한 도메인 스와핑을 위한 전단계로 당전이 활성에 중요한 PSPG 모티프를 포함하는 카르복시 말단과 기질 특이성을 결정하는 아미노 말단의 1차 및 2차 구조적 차이점들과 도메인 스와핑이 일어나는 부위를 표시하였다.
실시예 2. 애기장대 당전이 효소 UGT72E2 및 UGT72E3 , 새롭게 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E2 /3 및 UGT72E3 /2의 3차 구조
이미 3차 구조 연구가 잘 이루진 애기장대와 포도 유래의 당전이 효소 UGT72B1과 VvGT1에서 나타나는 바와 같이 일반적으로 당전이 효소는 구조적으로 아미노 말단 영역과 카르복시 말단 영역의 경계부분의 깊고 좁게 갈라진 틈에 기질 특이성을 결정하는 영역(sugar acceptor)과 당전이 활성을 결정하는 영역(sugar donor)이 서로 이웃하는 형태를 보인다(도 2A 및 2B). SWISS-MODEL workspace를 이용하여 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2의 3차 구조를 예상하였다(도 2C). 특히 기질 특이성을 결정하는 영역과 당전이 활성을 결정하는 영역 주변의 구조적 변화가 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 당전이 효소들의 기질 특이성과 당전이 활성의 차이에 관여할 것으로 추정된다.
실시예 3. 형질전환체 생산에 이용된 재조합 벡터, 형질전환체로 전이된 유전자의 발현 정도 및 자외선에 대한 형질전환체의 표현형
본 발명자는 애기장대의 100여 개의 당전이 효소들 중에서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올 또는 구조적으로 유사한 코니페릴 알코올에 당을 전이할 수 있는 능력이 있다고 보고된 당전이 효소 UGT72E 계통군(clade)의 효소적 특성을 조사하였다. UGT72E 계통군 또한 일반적인 당전이 효소와 비슷한 구조적 특징을 가지고 있는데, 아미노 말단 영역은 기질인식 영역을 가지며 카르복시 말단은 UDP에 의해서 활성화된 당으로부터 당을 기질에 전이하는 효소적 활성영역을 가지고 있고, 특히 카르복시 말단의 PSPG (Plant Secondary Product Glucosyltransferase) 모티프가 식물체 유래의 당전이 효소의 활성에 중요한 것으로 보고되고 있다. UGT72E 계통군에는 염기서열이 유사한 당전이 효소 UGT72E1, UGT72E2 및 UGT72E3가 있다.
본 발명에서는 UGT72E2 및 UGT72E3 유전자들을 각각 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편으로 이분하였다. 아미노 단편은 기질인식 특이성을 결정하는 영역을 포함하고 카르복시 말단은 당전이 활성에 중요한 PSPG 모티프를 포함하고 있다. 식물체 내에서 시린진을 효율적으로 생산하기 위해서는 기질 특이성이 당전이 활성보다 중요하므로 정확히 이등분하지 않고 아미노 단편을 전체의 3/4 정도로 크게 하고 카르복시 단편은 PSPG 모티프를 포함하는 최소 크기로 나누었다.
본 발명에서 사용한 재조합 UGT72E2/3 유전자는 UGT72E2의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 UGT72E3의 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편을 코딩하는 유전자를 연결하여 제조하였고, 재조합 UGT72E3/2 유전자는 UGT72E3의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 UGT72E2의 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편을 코딩하는 유전자를 연결하여 제조하였다.
본 발명에서는 애기장대로부터 분리된 UGT72E2 및 UGT72E3 유전자와 본 발명에서 새롭게 제작한 재조합 UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자의 코딩 영역을 CaMV35S 프로모터와 수퍼프로모터에 의해 조절되도록 바이너리 벡터를 제작한 후 이 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스(A. tumefaciens) EHA105로 옮긴 다음 이 박테리아를 사용하여 애기장대를 인 플랜타(in planta) 방법으로 형질전환 시켰다(도 3).
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 의해서 크게 영향을 받으므로 하이그로마이신 저항성 애기장대 형질전환체들 중에서 애기장대 유래의 전이유전자 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2를 안정적으로 유전체에 삽입되어 발현되는 양을 RT-PCR 방법을 이용해서 조사하였다. 이때 도입된 유전자를 특이적 증폭하기 위해서 UGT72E 유전자 특이적 정방향 프라이머(forward primer: 5’GGTTGGAGCTCGACGTTGGAAAGCGTC 3’; 서열번호 3)와 벡터의 3' UTR 영역에 특이적인 역방향 프라이머(reverse primer: 5’TTAAAGCAGGGCATGCCTGC 3’; 서열번호 4) 조합을 이용하였다. RNA의 상대적인 양을 보정하기 위해서 항상 일정하게 발현하는 애기장대의 ACTIN1 유전자를 참고 유전자로 사용하였다. 조사된 각 유전자 별로 15개의 형질전환체 중에서 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자의 발현이 비슷한 형질전환체 라인들을 최종 확인하였다(도 3B). 잎에서의 당전이 효소의 활성에 의한 시나필 알코올의 시린진으로의 전환은 잎에서 자외선을 흡수하는 시나필 에스터(sinapyl ester)의 생성을 감소시킨다. 따라서 당전이 효소 활성이 강화된 형질전환체의 잎이 자외선에 노출이 되면 자외선은 주로 엽록체에 의해서 흡수되어 강한 붉은 색을 띤다. 잎에서 시나필 에스터의 생성이 정상적으로 일어나면 엽록체에 의한 자외선 흡수량이 감소되어 매우 약한 붉은 색을 띤다(도 3C).
실시예 4. 형질전환체의 잎에서의 코니페린과 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
일반적으로 속씨 식물의 잎의 페닐프로파노이드 합성경로의 활성화에 의해서 생성되는 모노리그놀(monolignol)은 대부분 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)로 당전이 효소에 의해서 코니페린으로 전환된다. 극히 일부의 코니페릴 알코올이 효소적 작용에 의해서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올(sinapyl alcohol)로 전환되고 낮은 당전이 효소의 활성에 의해서 시린진으로의 전환율은 매우 낮다. 대부분의 시나필 알코올은 자외선을 흡수하여 잎을 보호하는 기능을 하는 시나필 에스터로 전환된다. 따라서 코니페릴 알코올에 대한 기질 특이성이 강한 UGT72E2 유전자의 과발현은 코니페린의 생성을 증가시키고 시나필 알코올에 대한 기질 특이성이 강한 UGT72E3 유전자의 과발현은 시린진의 생성을 상대적으로 증가시켰다(도 4A 및 4B). 재조합 유전자 UGT72E3/2 유전자의 과발현은 UGT72E3 유전자의 과발현에 비교해서 잎에서 48.7%의 시린진 생성 증가 효과를 보였다(도 4B 및 4C).
실시예 5. 형질전환체의 뿌리에서의 코니페린 및 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
항상 빛에 노출되어 있는 잎과 달리 식물의 뿌리는 빛에 노출이 되면 빛 신호전달 기작에 의해서 페닐프로파노이드 합성경로에 관여하는 다양한 유전자의 발현이 증가된다. 그 결과 많은 양의 코니페릴 알코올 및 시나필 알코올을 포함하는 모노리그놀의 합성이 증가된다. 같은 조건에서 배양된 야생형 식물체의 잎에선 거의 검출이 되지 않았던 코니페린과 시린진의 생성이 크게 증가 하였으나 여전히 시린진의 생성율은 코니페린의 25% 수준으로 낮았다. 당전이 효소의 활성이 강하고 코니페릴 알코올에 대한 기질 특이성이 강한 UGT72E2 유전자를 과발현하는 형질전환체의 뿌리에 코니페린의 생성이 2배 이상 증가하였으나 시린진의 생성은 크게 변화가 없었다(도 5B 및 5C). 당전이 효소의 활성이 약하고 시나필 알코올에 대한 기질 특이성이 강한 UGT72E3 유전자를 과발현하는 형질전환체의 뿌리에서는 코니페린과 시린진이 야생형과 비슷한 수준으로 생성되었다. 그러나 재조합 유전자 UGT72E3/2 유전자의 과발현이 UGT72E3 유전자의 과발현에 비교해서 뿌리에서 11.2%의 시린진 생성 증가 효과를 보였다(도 5B 및 5C).
실시예 6. 당전이 효소 UGT72E3 /2 염기서열과 아미노산 서열
기존에 알려진 당전이 효소 UGT72E3에 비교해서 시나필 알코올에 대한 기질 특이성은 유지하면서 당전이 효소 활성이 48.7% 이상 증가된 새로운 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자의 염기서열과 암호화하고 있는 단백질의 아미노산 서열을 도 6에 나타내었다.
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Claims (14)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질.
  2. 제1항의 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  7. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 UGT72E3/2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 합성을 증가시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 UGT72E3/2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 잎에서 시린진 합성이 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진(syringin) 합성이 증가된 형질전환 식물체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
  13. 제11항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
  14. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진(syringin) 합성 증가용 조성물.




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PNAS, 104권, 51호, 20238-20243쪽(2007년) *
The Plant Journal, 48권, 286-295쪽(2006년) *

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