KR102550242B1 - 과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법 - Google Patents
과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 당뇨병과 우울증 치료, 노화 예방 및 항스트레스 등의 효과가 우수하여 의약품 및 식품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있는 시린진을 식물체에서 효과적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법에 관한 것이다.
시린진(syringin)은 가시오가피의 근피나 수피에 많이 들어 있는 약리 성분으로, 스트레스에 대해 정신적 또는 육체적으로 우수한 적응력을 나타내는 식물 유래의 대표적 적응원(adaptogen)으로 분류되고 있다. 적응원이란 다양한 스트레스에 반응하여 부작용없이 생체의 비특이성 저항력을 증가시키는 식물 이차대사 산물을 일컫는 말이다. 최근에 순수 분리된 시린진이 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증의 치료뿐만 아니라 노화예방, 시력개선, 청력개선, 간손상, 혈관확장, 피로회복, 항경련, 항스트레스 작용에도 효과적인 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있다. 그러나, 가시오가피의 재배 지역이 제한적이고 재배 지역에 따라 약리성분에 차이가 있어 상업적 이용을 위한 시린진 생산에 필요한 가시오가피의 안정적 공급이 어렵기 때문에 생명공학 기술을 이용한 식물대사 경로의 조절을 통하여 시린진과 같은 고부가 가치 산물인 식물 이차대사 산물의 안정적 생산기술 개발이 필요하다.
시린진은 리그닌계 배당체로 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해서 생성된 리그닌 구성 성분인 시나필 알콜(sinapyl alcohol, s type monolignol)이 당전이 효소(UDP-dependent glucosyltransferase, UGTase)에 의해서 배당체가 됨으로써 생성된다. 모델 식물체인 애기장대에는 약 100여 종의 당전이 효소가 있으며 식물호르몬을 비롯한 다양한 화합물의 배당체를 형성함으로써, 이들 화합물이 세포 내에서 비활성화되고 액포에 저장되는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 이들 중에서 UGT72E2 및 UGT72E3은 각각 특이적으로 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol) 및 시나필 알코올과 같은 모노리그놀(monolignol)을 배당체로 전환시키는 당전이 효소로 알려져 있다. 그러나, 당전이 효소 UGT72E3은 시나필 알코올에 대한 기질 특이성은 우수하지만 당전이 활성이 낮아서 그 응용성이 매우 제한적이었다. 따라서, 식물체 내에서 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해 시린진을 효과적으로 생산하기 위해서는 시린진의 전구체인 시나필 알코올에 대해 기질 특이성이 있으면서 당전이 활성이 강한 당전이 효소에 관한 연구 및 식물세포 내에 미량으로 존재하는 시나필 알코올의 함량을 증가시킬 수 있는 대사공학적 기술이 필요하다.
그러나, 과다한 모노리그놀의 시린진 전환은 세포벽의 완전성(integrity)에 변화를 유발하고, 과도한 면역반응을 활성화시켜 형질전환 식물체의 생장에 장애가 되어 생체중이 크게 감소하는 부작용이 발생할 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 식물체의 면역반응을 최소화하여 형질전환 식물체의 생체중을 증가시킴으로써 시린진 생산에 최적화된 식물체를 제작하고 효율적으로 시린진을 순수 분리하는 방법에 관한 연구가 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1399946호에는 재조합 당전이 효소 UGT72E-3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 이용한 '시린진과 코니펜린 함량이 증가된 형질전환 콩 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 콩 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 코딩 유전자, 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)에서 시나필 알코올(sinapyl alcohol)로의 전환에 관여하는 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 코딩 유전자 및 페닐프로파노이드 생합성 경로에 관여하는 양성 조절인자인 Myb63 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자를 동시에 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조한 후 시린진 함량을 측정한 결과, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체의 시린진 함량이 야생형에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자를 동시에 과발현하는 형질전환체에서 모노리그놀(monolignol)이 배당체 산물인 코니페린과 시린진으로 전환됨에 따라 세포벽이 불안정해져서 면역반응이 과도하게 활성화되어 생체중이 급격히 감소하지만, 식물의 과면역 반응을 완화시키기 위한 NahG (salicylate hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 NahG 유전자를 추가로 도입할 경우 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체에 비해 생체중이 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 함량 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 당뇨병과 우울증 치료, 노화 예방 및 항스트레스 등의 효과가 우수하여 의약품 및 식품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있는 시린진을 식물체에서 효과적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 제공함으로써, 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 NahG(salicylate hydroxylase) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 3 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체와 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체에서 UGT72E2/3-1-myc 단백질(57 kDa)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 야생형 애기장대(WT col-0), UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 잎에서 코니페린과 시린진 함량을 분석한 HPLC(High performance liquid chromatography) 크로마토그램이다.
도 5는 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 잎에서 코니페린(coniferin)과 시린진(syringin) 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 야생형 애기장대(col-0), UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 지상부의 생체중(fresh weight) 및 건중량(dry weight)을 측정한 결과이다.
도 7은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체(T1-25-5)에서 전이 유전자들과 Myb63 전사 조절자에 의해서 조절되는 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련된 유전자들의 발현 수준을 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 8은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체(T1-25-5)에서 다양한 식물 방어 호르몬에 의해 매개되는 면역반응과 관련된 유전자의 발현 수준을 애기장대 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 9는 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 시린진을 순수 분리하기 위해 수행된 박막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)의 용매 조건을 보여준다. CHCl3: 클로로포름, MeOH: 메탄올, Acetone: 아세톤, EtOA: 에틸아세테이트, C: 코니페린(coniferin), S: 시린진(syringin), M.E: methanol extract.
도 10은 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 시린진을 순수 분리하기 위해 수행된 오픈 컬럼 크로마토그래피(Open column chromatography)의 이동상 조건과, 분획물 E층에서 시린진이 검출된 TLC 결과이다.
도 11은 TLC 분석을 통해 시린진 스팟이 나타난 분획물 E층을 취합 및 농축시켜 얻은 미색의 결정체와 HPLC용 표준품 시린진을 대상으로 수행한 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석 결과를 보여주는 크로마토그램이다.
도 12는 HPLC용 표준품 시린진에 대한 검량곡선이다.
도 13은 야생형 애기장대(WT), 기존 한국등록특허 제2169650호의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체 및 본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체를 수경재배 또는 토양재배한 후 코니페린(coniferin) 및 시린진(syringin) 함량을 측정한 결과이다. root: 형질전환체의 뿌리, shoot: 형질전환체의 지상부, soil: 형질전환체의 잎.
도 2는 NahG(salicylate hydroxylase) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 3 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체와 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체에서 UGT72E2/3-1-myc 단백질(57 kDa)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 야생형 애기장대(WT col-0), UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 잎에서 코니페린과 시린진 함량을 분석한 HPLC(High performance liquid chromatography) 크로마토그램이다.
도 5는 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 잎에서 코니페린(coniferin)과 시린진(syringin) 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 야생형 애기장대(col-0), UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 지상부의 생체중(fresh weight) 및 건중량(dry weight)을 측정한 결과이다.
도 7은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체(T1-25-5)에서 전이 유전자들과 Myb63 전사 조절자에 의해서 조절되는 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련된 유전자들의 발현 수준을 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 8은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체(T1-25-5)에서 다양한 식물 방어 호르몬에 의해 매개되는 면역반응과 관련된 유전자의 발현 수준을 애기장대 야생형과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 9는 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 시린진을 순수 분리하기 위해 수행된 박막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)의 용매 조건을 보여준다. CHCl3: 클로로포름, MeOH: 메탄올, Acetone: 아세톤, EtOA: 에틸아세테이트, C: 코니페린(coniferin), S: 시린진(syringin), M.E: methanol extract.
도 10은 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 메탄올 추출물로부터 시린진을 순수 분리하기 위해 수행된 오픈 컬럼 크로마토그래피(Open column chromatography)의 이동상 조건과, 분획물 E층에서 시린진이 검출된 TLC 결과이다.
도 11은 TLC 분석을 통해 시린진 스팟이 나타난 분획물 E층을 취합 및 농축시켜 얻은 미색의 결정체와 HPLC용 표준품 시린진을 대상으로 수행한 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석 결과를 보여주는 크로마토그램이다.
도 12는 HPLC용 표준품 시린진에 대한 검량곡선이다.
도 13은 야생형 애기장대(WT), 기존 한국등록특허 제2169650호의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체 및 본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체를 수경재배 또는 토양재배한 후 코니페린(coniferin) 및 시린진(syringin) 함량을 측정한 결과이다. root: 형질전환체의 뿌리, shoot: 형질전환체의 지상부, soil: 형질전환체의 잎.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 식물체 내에서 시린진의 합성을 증가시키기 위해서 당전이 활성과 시나필 알코올(sinaphyl alcohol)에 대한 기질 특이성을 강화한 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2 및 UGT72E3 단백질을 코딩하는 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E3/2를 제조하였고, 상기 재조합 유전자로부터 발현되는 단백질의 카복시 말단에 3개의 Myc 에피토프(epitope)를 포함하는 42개의 아미노산 서열을 추가한 새로운 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc을 제조하였다. Myc 에피토프의 결합은 면역블롯팅(immunoblotting) 분석을 통해 단백질의 발현량을 확인하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라 목적 단백질(효소)의 활성을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명에 따른 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, F5H 단백질 및 Myb63 단백질의 범위는 각각 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내의 시린진(syringin) 합성 증가를 의미한다.
또한, 상기 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H 단백질 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 범위는 UGT72E3/2-1-myc, F5H 또는 Myb63 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질 코딩 유전자, F5H 단백질 코딩 유전자 및 Myb63 단백질 코딩 유전자의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, F5H 단백질 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자들이 병렬로 연결된 다중 유전자 발현용 재조합 벡터로, 구체적으로는 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 합성 경로에서 시니필 알코올로의 전환에 필요한 코니페릴 알코올의 하이드록실화 단계를 조절하는 F5H 단백질 코딩 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb63 단백질 코딩 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 염기서열을 확인한 후 UGT72E3/2-1-myc 유전자가 클로닝되어 있는 발현 벡터에 각각 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 3개의 유전자가 유전자 발현 억제(silencing)를 최소화하면서 동시에 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NahG(salicylate hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 NahG 유전자가 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자와 함께 식물체에서 과발현될 경우 야생형과 비슷한 수준의 생체중 및 건중량을 유지할 수 있다. UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자가 식물체에서 과발현되면 모노리그놀이 배당체 산물인 코니페린과 시린진으로 전환됨에 따라 세포벽이 불안정해져서 면역반응이 과도하게 활성화되어 생장이 감소하지만, NahG 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 NahG 유전자를 추가로 도입할 경우 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체에 비해 생장 저해 현상이 억제되어 형질전환체 지상부의 생체중 및 건중량이 각각 3.4배, 2.8배 정도 증가하고, 야생형과 비슷한 수준으로 유지하는 특징이 있다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자와 NahG 단백질을 코딩하는 유전자는 단일 재조합 벡터에 포함될 수 있고, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법은 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 식물세포에 형질전환할 수 있다. 구체적으로 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자에 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 연결시켜 제작된 재조합 벡터로 형질전환하거나, 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 동시형질전환하여 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물체 내의 시린진 함량을 증가시키는 방법에 있어서, 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.
본 발명의 재조합 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될수 있다. 상기 발현 벡터의중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 또는 NahG 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(Geneticin), 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(Nopaline synthase, NOS), 벼 α아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 식물 발현 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 식물 발현 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한,
상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 각각 병렬로 연결하여 제작된 것으로, 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환으로 형질전환 세포 내로 전이되는 3개의 유전자가 유전자 발현 억제 없이 동시에 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법은 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 식물세포에 형질전환할 수 있다. 구체적으로 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자에 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 연결시켜 제작된 재조합 벡터로 형질전환하거나, 상기 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 동시형질전환하여 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제조한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에서, UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하며, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에서 새롭게 제조된 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체는 기존 한국등록특허 제2169650호에 개시된 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체에 비해 시린진 생산량이 우수한 것이 특징이다. 구체적으로 수경재배한 기존 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체의 뿌리(root) 및 지상부(shoot)에서 시린진 함량은 각각 35.14 μmol/g, 88.4 μmol/g이었으나, 수경재배한 본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체의 뿌리 및 지상부에서 시린진 함량은 각각 104.94 μmol/g, 116.59 μmol/g으로, 기존 형질전환체에 비해 시린진 함량이 각각 3배, 1.3배 정도 증가하였다. 또한, 토양재배한 기존 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb58 과발현 형질전환체의 잎에서 시린진 함량은 41.03 μmol/g이었으나, 토양재배한 본 발명의 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체의 잎에서 시린진 함량은 51.66 μmol/g으로, 기존 형질전환체에 비해 시린진 함량이 1.3배 정도 증가하였다(도 13).
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진 함량 증진용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H 단백질 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 시린진 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 조성물은 NahG 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자에 NahG 유전자를 추가로 연결하여 제작된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하거나, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자가 포함된 재조합 벡터와 NahG 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 NahG 유전자가 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자와 함께 식물체에서 과발현될 경우 야생형과 비슷한 수준의 생체중을 가진다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
UGT72E3/2-1-myc
,
F5H
및
Myb63
유전자를 포함하는 다중 유전자 발현용 재조합 벡터 및
NahG
유전자 발현용 재조합 벡터의 제작
재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 유전자의 코딩 영역을 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절되도록 바이너리 벡터에 클로닝하였다. 또한, 식물체 내의 대사경로 조절을 통해 시린진의 생산을 증가시키기 위하여 페닐프로파노이드 합성 경로에서 시나필 알코올로의 전환에 필요한 코니페릴 알코올의 하이드록실화 단계를 조절하는 F5H 유전자를 동일한 벡터에 클로닝하였다. 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 양성 조절하는 전사인자인 Myb63을 슈퍼 프로모터로 발현되도록 제작하고 동일한 벡터에 클로닝하였다. F5H와 Myb63 유전자의 발현 카세트(프로모터+유전자+터미네이터) 전체를 PCR로 증폭하고 염기서열을 확인한 후 각각 기존에 UGT72E3/2-1-myc 유전자가 클로닝되어 있는 발현 벡터의 프로모터 상류(upstream)에 있는 EcoRl 부위와 OCS 터미네이터의 하류(downstream)에 있는 HindⅢ 부위에 각각 클로닝하여 3개의 유전자 발현 카세트를 병렬로 연결하였다. 하나의 바이너리 벡터의 T-DNA 영역에 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자가 각각의 발현 카세트 형태를 유지하기 때문에 한 번의 형질전환 이벤트로 전이되는 3개의 유전자가 유전자공동억제 현상없이 동시에 발현되는 새로운 다중 유전자 발현 벡터 시스템을 완성하였다(도 1).
또한, 본 발명에서는 살리실산을 하이드록실화하여 카테콜로 전환하는 효소를 암호화하는 NahG 유전자 코딩 영역을 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절되도록 바이너리 벡터에 클로닝하였다(도 2).
실시예 2.
UGT72E3/2-1-myc
,
F5H
및
Myb63
과발현 형질전환체와
NahG
유전자를 추가로 도입한 형질전환체에서 UGT72E3/2-1-myc 단백질의 발현량 분석
UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자를 포함하는 다중 유전자 발현용 재조합 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스(A. tumefaciens) GV3101로 옮기고, 이 박테리아를 사용하여 애기장대를 인 플랜타(in planta) 방법으로 형질전환시켰다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 의해서 크게 영향을 받으므로 PPT(phosphinothricin)에 대한 저항성을 보이는 애기장대 형질전환체들 중에서 전이유전자인 UGT72E3/2-1-myc에 의해 생성되는 당전이 효소 단백질을 안정적으로 과발현하는 형질전환체를 선발하기 위해서 형질전환 l세대(Tl)에서 면역 블롯 방법으로 조사하여 세대를 진전시켰다.
또한, NahG 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 GV3101로 옮기고, 이 박테리아를 사용하여 애기장대를 인 플랜타 방법으로 형질전환시켰다. 상기 형질전환체는 hyg 저항성 유전자(hygromycin resistance gene)를 이용하여 선택배지에서 선별하고 세대를 진전시켰다.
이후 동시형질전환법을 통해 NahG 유전자가 도입된 애기장대에 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스 GV3101을 이용하여 애기장대를 인 플랜타 방법으로 형질전환시켰다.
UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체와 NahG 유전자가 도입된 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 T3 식물체에서 전체 단백질을 분리하여 20 ug씩 SDS-PAGE 수행하여 크기별로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼하고 면역 블롯을 수행하였다. 그 다음, Myc 에피톱(epitope)에 대한 단일 항체를 1차 항체로 사용하고 mouse IgG에 대한 과산화효소(peroxidase)가 부착된 항체를 2차 항체로 이용하고 ECL 키트를 이용하여 UGT72E3/2-1-myc의 발현 수준을 분석한 결과, 두 독립된 형질전환 식물체에서 재조합 단백질 효소인 UGT72E3/2-1-myc의 발현량이 서로 유사함을 확인하였다(도 3).
실시예 3.
UGT72E3/2-1-myc
,
F5H
및
Myb63
과발현 형질전환체와
NahG
유전자를 추가로 도입한 형질전환체의 잎에서 코니페린 및 시린진 생성량의 정량적 HPLC 분석
일반적으로 속씨식물의 잎에서 페닐프로파노이드 합성 경로의 활성화에 의해 생성되는 모노리그놀(monolignol)은 대부분 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)로, 당전이 효소에 의해서 코니페린으로 전환된다. 극히 일부의 코니페릴 알코올이 효소적 작용에 의해서 시린진의 전구물질인 시나필 알코올(sinapyl alcohol)로 전환되지만, 낮은 당전이 효소의 활성에 의해 시린진으로의 전환율은 매우 낮다. 일부 시나필 알코올은 자외선을 흡수하여 잎을 보호하는 기능을 하는 시나필 에스터로 전환되기도 한다.
본 발명에서 야생형 애기장대, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체를 수경재배한 후 식물체 잎에서 코니페린 및 시린진 함량을 측정한 결과, 야생형의 잎에서는 코니페린 및 시린진이 거의 검출되지 않은 반면, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 및 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체에서는 HPLC용 표준품으로 사용된 코니페린(코니페릴 알코올 4-O-글루코시드) 및 시린진(시나필 알코올 4-O-글루코시드)과 동일한 보유시간에서 피크가 나타났고, 두 독립된 형질전환 식물체의 시린진 생성량은 서로 비슷한 수준임을 확인하였다(도 4).
이를 통해, NahG 도입이 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63의 시린진 합성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
실시예 4.
UGT72E3/2-1-myc
,
F5H
및
Myb63
과발현 형질전환체와
NahG
유전자를 추가로 도입한 형질전환체의 시린진 함량 및 생체중 분석
일반적으로 속씨식물 잎의 페닐프로파노이드 합성 경로의 활성화에 의해서 생성되는 모노리그놀은 식물의 2차 세포벽의 구성 성분이다. 본 발명을 통해 제작된 형질전환 식물체는 모노리그놀이 코니페린과 시린진으로 전환됨에 따라 불안정한 세포벽을 가지게 된다. 불안정한 세포벽은 다양한 면역반응을 매개하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 면역반응과 식물체 내 탄소의 흐름이 시린진 생산에 집중되어 형질전환체의 생체중이 급격히 감소하는 현상이 발생하였다.
본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 NahG 유전자를 추가로 도입함에 따라 식물의 대표적인 방어 호르몬인 살리실산(SA)의 축적을 막아 시린진의 생산량을 유지하면서 생체중이 증가하는 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현형질전환 식물체를 제작하였다.
먼저 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체와 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 잎에서 시린진 함량을 측정한 결과, 두 독립된 형질전환 식물체의 시린진 함량은 각각 129.03 umol/g, 100.18 umol/g으로, 서로 유의적 차이가 없음을 확인하였다(도 5).
또한, UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체와 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 지상부의 생체중 및 건중량을 측정한 결과, 야생형에 비해 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체의 생체중 및 건중량은 현저히 감소한 반면, NahG 유전자가 추가로 도입된 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 생체중 및 건중량은 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체에 비해 각각 3.4배, 2.8배 정도 증가하였고, 야생형과 비슷한 수준임을 확인하였다(도 6). 이를 통해, NahG 유전자의 추가 도입으로 인해 과면역반응이 억제되어 식물의 생장 증진된 것임을 알 수 있었다.
실시예 5.
UGT72E3/2-1-myc
,
F5H
및
Myb63
과발현 형질전환체의 전체 대사체 분석
UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 과발현 형질전환체 라인(T1-25-5)과 야생형을 대상으로 RNA-seq 방법을 이용하여, 전체 대사체(metabolome) 변화를 비교·분석하여 시린진 생산량 증대에 대한 분자생물학적 원인을 규명하고자 하였다.
분석 결과, 도 7에 나타난 것과 같이, T1-25-5 라인에서는 F5H (FAH1) 및 Myb63 유전자의 뿐만 아니라 페닐프로파노이드 생합성 경로와 관련한 다양한 유전자의 발현이 크게 증가하였고, 도입된 UGT72E3/2-1-myc, F5H 및 Myb63 유전자들의 발현과 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 유전자들의 발현이 비례하며, 최종적으로 생산되는 코니페린과 시린진의 생산량에 비례하는 양상을 보였다.
또한, 도 8에 나타난 것과 같이, 다양한 식물 방어 호르몬에 의해 매개되는 면역반응에 관련한 유전자들의 발현 수준도 야생형에 비해 크게 증가하는 특징을 보였고, 최종적으로 생산되는 코니페린과 시린진의 생산량에 비례하는 양상을 보였다.
이러한 결과는 대사체의 흐름이 시린진 생합성 쪽으로 집중되고 있음을 보여주며, 생장 저해 현상이 과면역반응에 의해 유도되는 것으로, 시린진 생산량 증대와 생체중 감소에 밀접한 관련성이 있음을 보여주고 있다.
실시예 6.
UGT72E3/2-1-Myc
,
F5H
및
Myb63
과발현 형질전환체에
NahG
유전자를 추가로 도입한 형질전환체로부터 시린진의 순수 분리
본 발명의 UGT72E3/2-1-Myc, F5H, Myb63 및 NahG 과발현 형질전환체의 HPLC 분석 결과, 형질전환체의 건조 분말 1 g 당 시린진의 함량이 114 umol로, mg 단위로 환산 시 대략 형질전환체의 건조 분말 1 g 당 시린진의 함량이 42 mg에 달하는 높은 수준임을 확인하였다.
형질전환체의 건조 분말 25 mg 당 3 ㎖의 메탄올 비율로 40시간 동안 교반 추출하였고, 형질전환체 건조 분말 4.35 g을 이용하여 메탄올 추출물을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 이용하여 도 9의 용매 조건으로 박막 크로마토그래피(TLC)를 수행하였고, 클로로포름(CHCl3)과 메탄올(MeOH)이 4:1의 비율로 혼합된 용매에서 코니페린과 시린진의 분리능이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
또한, 상기 메탄올 추출물을 이용하여 도 10의 이동상 용매 조건으로 오픈 컬럼크로마토그래피를 수행하여 이동상 용매의 극성 기울기를 통해 분획하였으며, TLC를 통해 분획물 E층에서 시린진이 검출되는 것을 확인하였다. 상기 시린진 스팟이 확인된 분획물 E층을 취합 및 농축시켜 얻은 미색의 결정체를 농도별로 분류하여 HPLC를 수행한 결과, 표준품으로 사용된 HPLC용 시린진(시나필 알코올 4-O-글루코시드)과 형질전환체에서 분리된 시린진의 보유시간이 동일함을 확인하였다(도 11).
또한, 표준품으로 제작된 검량곡선(도 12)을 기준으로 하여 계산했을 때, 정제된 분말 1 g 당 시린진이 900 mg 이상으로 순도가 90% 이상임을 확인하였고(표 1), 식물체 건조 분말 4.35 g으로부터 정제된 시린진 190 mg을 회수하였다.
| Sample(mg/L) | Area | Concentration(mg/g) |
| Syringin fraction 12.5 | 356811 | 933.5184787 |
| Syringin fraction 25 | 724714 | 918.8534914 |
| Syringin fraction 50 | 1457014 | 909.3668397 |
*y=32551x-23026
통상적으로 가시오가피와 같은 천연물로부터 극미량 존재하는 시린진을 순수하게 분리하기 위해서는 다량의 원물과 많은 양의 용매가 필요하고 이를 분획하여 정제하는 과정이 매우 복잡하지만, 본 발명과 같이 UGT72E3/2-1-myc, F5H, Myb63 및 NahG 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용할 경우 형질전환 식물체의 생체중을 야생형과 유사한 수준으로 유지하면서 보다 간단한 방법으로 시린진을 대량 생산할 수 있다.
Claims (9)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 시린진(syringin) 합성을 위한 재조합 벡터.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NahG(salicylate hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시린진 합성을 위한 재조합 벡터.
- 제1항 또는 제3항의 시린진 합성을 위한 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2-1-myc 단백질을 코딩하는 유전자; F5H 단백질을 코딩하는 유전자; 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 시린진(syringin) 함량을 증가시키는 방법.
- 제1항 또는 제3항의 시린진 합성을 위한 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법. - 제5항의 제조방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진(syringin) 함량이 증가된 형질전환 식물체.
- 제6항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 단백질 UGT72E3/2-1-myc을 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 시린진(syringin) 함량 증진용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 NahG(salicylate hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체 내의 시린진(syringin) 함량 증진용 조성물.
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| KR1020230026477A KR102550242B1 (ko) | 2023-02-28 | 2023-02-28 | 과잉면역반응 억제를 통한 생체중 및 시린진 생산량이 증대된 형질전환 식물체 제조방법 |
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| KR20140058183A (ko) * | 2012-11-06 | 2014-05-14 | 동아대학교 산학협력단 | 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 |
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| KR20140058183A (ko) * | 2012-11-06 | 2014-05-14 | 동아대학교 산학협력단 | 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 |
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