CN110452291B - 铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用。本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因DoLEA43，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。

Description

铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组 织形成中的应用

技术领域：

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用。

背景技术：

植物种子在成熟过程中，体内储藏性物质含量增加，水分含量逐渐降低，在种子的子叶或者胚乳中积累一些可溶性的糖类和蛋白质等，作为能量存储或者增强种子的脱水耐性(Angelovici et al.2010；Leprince et al.2017)。脱水耐性是种子对低含水量或脱水的忍耐程度，种子在成熟过程中进行脱水，在这一过程合成大量的亲水物质，维持细胞结构，防止质膜损害和重要蛋白变性等，从而减少种子脱水对细胞造成的伤害。1981年首次发现了棉花种子中高丰度的胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundantprotein，LEA)，随后在其它的物种如大豆(Glycine max，Lin et al.2004；Liu and Zheng2005)、玉米(Zea mays L.，Campbell et al.1998)、水稻(Oryza sativa L.，Xiao etal.2007)和烟草(Nicotiana rustica，RoyChoudhury et al.2007)等植物中也发现了LEA蛋白。LEA家族蛋白相对分子质量较小，一般为10-30k Da，小部分大于30k Da，是一类富含赖氨酸和甘氨酸等亲水性氨基酸的亲水性的蛋白(Baker et al.1988；Battaglia etal.2008))。研究表明，LEA受ABA和水分胁迫诱导(Moons et al.1997；Zegzouti etal.1997)，在逆境胁迫情况下，可能起到保护植物细胞结构、维持内环境稳定的作用。越来越多研究表明LEA参与植物各种非生物逆境胁迫，如干旱(Yu et al.2016)、盐胁迫(Chourey et al.2003；Xu et al.1996))和冷胁迫等(NDong et al.2002；Sutton etal.1992)。但LEA蛋白的其它功能如促进愈伤组织的形成未有报道。

在植物离体培养中，受到一些因素的刺激，植物细胞脱分化，并进一步增殖形成具有再生能力的细胞团，即愈伤组织。愈伤组织不仅是遗传转化、研究植物基因功能的重要材料，同时也是植物组织快繁的关键材料。此外，愈伤组织在植物种质保存和利用愈伤组织生产活性物质等方面扮演着重要的角色。

发明内容：

本发明的目的是提供一种铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在促进植物愈伤组织形成中的应用。

本发明所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

所述的促进植物愈伤组织形成优选为促进植物下胚轴愈伤组织形成。

所述的植物优选为拟南芥。

本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白家族LEA_1亚家族的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。

附图说明：

图1是DoLEA43基因全长；其中M为DL2000 DNA Marker，1为目的片段。

图2是pCAMBIA1302植物双元表达载体图。

图3是半定量PCR证明DoLEA43基因可在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)中正常转录；其中WT为野生型拟南芥，Line 2、Line 4和Line 6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。

图4是Western blot证明DoLEA43蛋白可在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)中正常表达；其中WT为野生型拟南芥，Line 2、Line 4和Line 6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。

图5是野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)的愈伤组织诱导率；其中WT为野生型拟南芥，Line 2、Line 4和Line 6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。

图6是野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA43)愈伤组织图片；其中WT为野生型拟南芥，Line 2、Line 4和Line 6为筛选到的DoLEA43超表达转基因拟南芥株系编号。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：DoLEA43基因的全长克隆

下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)从福建冠豸山收集得到，其种子无菌播种后得到的原球茎进一步增殖获得类原球茎，该类原球茎作为种质资源保存于中国科学院华南植物园的组培室内，培养在1/2MS+0.1％活性炭+2％蔗糖+0.2％琼脂粉PH 5.4的培养基上，在26±1℃，40μmol m^-2s^-1，12-h光照/12-h黑暗，60％相对湿度的培养室中。逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；DNase I(RNaseFree)购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；普通PCR反应buffer为2×TSINGKE Master Mix(blue)购自擎科生物公司，其货号为TSE004-5ML；构建超表达载体采用高保真酶进行扩增，所用的高保真酶为KOD-401，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，其货号为：KOD-401；pMD18-T载体和Nco I酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号分别为D101A和1160BH；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》；1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

以SDS法提取铁皮石斛类原球茎RNA，提取得到的RNA用DNase I进行去基因组DNA处理，具体操作按照使用说明书进行。得到的纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于-80℃冰箱备用。采用Promega公司逆转录酶M-MLV进行逆转录得到cDNA。在铁皮石斛全基因组CDS拼接文件中查找得到DoLEA43的CDS核苷酸序列，根据序列信息设计正向引物(5′-ATGGAAGCCGCTAAGGAGAA-3′)和反向引物(5′-CTACAATCCTGTGCCAGTGT-3′)，以cDNA为模板，进行常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，30个循环；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段(图1)，连接于pMD18-T载体，连接反应：PCR产物4.5μL，pMD18-T载体0.5μL，Solution I 5μL，共10μL体积，16℃连接3h。所有连接产物，转到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中(TaKaRa，D9057A)，加800mL LB液体培养基，复苏45min，涂于含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养至长出菌落(约10h)。挑取单菌落于含100mg/L Amp的LB液体培养基中扩增培养，进行PCR扩增，具体操作与CDS扩增方法一致，检测到的阳性重组子送交华大基因进行测序。扩增的目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第1位到432位碱基，长432bp，将此开放阅读框命名为铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43，其编码143个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，将该蛋白命名为铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43。

实施例2：DoLEA43超表达转基因拟南芥的获得与鉴定

1、铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43超表达载体的构建

pCAMBIA1302载体是含有一个花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(35Spromoter)，将铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43(如SEQ ID NO.1的第1位到432位碱基所示)接在此启动子后面，构建成铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43超表达载体，将此重组表达载体命名为pCAMBIA1302-DoLEA43。具体构建步骤如下：

根据pCAMBIA1302载体上的序列，设计两个接头引物，上游引物接头：5′-CGAACGATAGCCATGG-3′，下游引物接头：5′-GTCAGATCTACCATGGT-3′。下划线表示NcoⅠ酶切位点。在DoLEA43的起始密码子和终止密码子附近设计引物(不包含终止密码子)，根据铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43全长设计引物，保证基因的三联体密码子不移码。以铁皮石斛类原球茎的cDNA为模板，高保真扩增获得铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43全长，扩增引物为DoLEA43OE_F(5′-GGACTCTTGACCATGGTAATGGAAGCCGCTAAGGAG-3′)和DoLEA43OE_R(5′-GTCAGATCTACCATGGTCAATCCTGTGCCAGTGTGGT-3′)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。pCAMBIA1302质粒载体经Nco Ⅰ单酶切后获得含有粘性末端的线性质粒载体，具体操作按说明书进行。回收线性质粒载体，-20℃保存备用。采用Clontech公司的In-fusion试剂盒将目的DNA片段与线性质粒载体在两端的同源序列处融合，50℃反应60min后立即放在冰上，将连上目的DNA片段的重组载体(即将铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA43(如SEQ ID NO.1所示，不包含终止密码子)插入到pCAMBIA1302上获得的重组载体，即重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43)转化DH5α，涂在含有50mg/L Kan的LB固体培养板上，37℃倒置培养12h。待长出菌落，挑取单菌落在含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，后进行菌液PCR验证阳性重组子。阳性克隆送至华大基因测序，测序正确的菌液(已成功将重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43转入到DH5α中)，接种到含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，提取质粒(即重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43)并保存在-20℃冰箱备用。

2、重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43转化到农杆菌EHA105

采用冻融法将重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43转入农杆菌EHA105。取1μl(浓度为1μg/μl)重组表达载体pCAMBIA1302-DoLEA43与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min，液氮速冻1min，迅速转到37℃孵化5min。加800μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃，100rpm转速中培养3h。将培养物涂到含50mg/L Kan LB固体平板上，28℃倒置培养，直至菌落长出(约48h)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定引物为DoLEA43OE_F和DoLEA43OE_R。能扩增得到目的条带的菌落为阳性克隆(即重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43转化进入了农杆菌EHA105中)，在含50mg/L Kan LB液体培养基上培养至OD₆₀₀为1左右，加入适量的无菌甘油(终浓度为25～30％)，液氮速冻2min，-80℃保存备用。

3、农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥

从-80℃冰箱中取出保存的菌种(即含有重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA43的农杆菌EHA105)，在含50mg/L Kan LB固体平板上划线进行活化农杆菌，挑取单菌落于100ml LB液体培养基中(含50mg/L Kan)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD₆₀₀＝0.8-1.0。室温5000rpm离心10min收集菌体。用100ml渗透培养基(1/2MS+0.5g/L MES+5％蔗糖，pH 5.7)重悬农杆菌，并加入20μl表面活性剂Silwet L-77，得到农杆菌重悬液。用大约4-5周，开始抽苔至10cm左右时(即刚开花，形成1-2个角果时)的拟南芥进行花序侵染转化。将所有的花序浸泡在农杆菌重悬液中浸泡1min，斜置晾干多余的农杆菌重悬液。黑暗共培养1天后，在光照条件下培养。直至种子成熟，收集T₀代种子。待种子成熟后进行下一步的培养筛选工作或保存在-20℃冰箱中。

4、DoLEA43超表达转基因拟南芥的鉴定

将保存的T₀代种子用现配的1％NaClO消毒10min后，无菌水漂洗6次后播种在含有潮霉素B(25mg/L)1/2MS固体培养基中，4℃黑暗同步化2天，移至培养室，在22±2℃，16-h光照/8-h黑暗条件下培养，筛选长出根和真叶的抗性植株，得到T1代小苗(即DoLEA43超表达转基因拟南芥株系)，将得到的小苗移栽到蛭石：泥炭土(2:1)的基质中，在22±2℃，16-h光照/8-h黑暗条件下培养，提取野生型拟南芥和T₁代小苗叶片RNA并逆转录成cDNA，以ddH₂O调至相同浓度，并以拟南芥AtUBQ10基因作为参考，其引物为AtUBQ10F(5′-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-3′)和AtUBQ10R(5′-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-3′)。以构建超表达载体的引物(DoLEA43OE_F和DoLEA43OE_R)作为引物，分别以野生型拟南芥和T₁代小苗叶片的cDNA作为模板进行PCR扩增，如图3所示，DoLEA43超表达转基因拟南芥株系Line 2、Line4和Line 6均可以扩增到条带，而野生型拟南芥则没有该条带，说明DoLEA43基因已经嵌入到拟南芥的基因组中，由此获得DoLEA43超表达转基因拟南芥。

为了进一步证明DoLEA43在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系中可以正常表达，因此进行Western blot验证。如图4所示，在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系均可看到GFP带，证明DoLEA43可在DoLEA43超表达转基因拟南芥株系中正常表达。具体Western blot步骤如下：

野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系液氮碾磨至粉碎，加入Extraction Buffer 200μL，4℃14,000g离心20min，得到的上清即为总蛋白液，过液氮后-80℃保存备用。Extraction Buffer具体配方如下表1：

表1 Extraction Buffer的配方

电泳和转膜等相关仪器设备均采用Bio Rad公司的产品。使用的anti-GFP一抗和鼠二抗均购自Thermo Fisher Scientific公司，其货号分别为cat#GF28R和#62-6520。具体方法参照He C,Yu Z,Teixeira da Silva JA,Zhang J,Liu X,Wang X,Zhang X,Zeng S,WuK,Tan J et al:DoGMP1from Dendrobium officinale contributes to mannose contentof water-soluble polysaccharides and plays a role in salt stressresponse.Scientific reports 2017,7:41010-41010.。使用分离胶浓度为12％，具体配方如下表2：

表2分离胶(12％)的配方

按表2中所列顺序依次加入上述药品，轻轻摇匀，在室温下凝结30min，后加入浓缩胶，浓缩胶配方如下表3：

表3浓缩胶的配方

插入梳子，待凝固后拔出梳子，放入加有电泳缓冲液的电泳槽中，加入上样蛋白(每孔能加入30-40μl)，先用低电压(90V)跑一会跑出浓缩胶，再用高电压120V进行电泳大约2h，电泳结束后取出凝胶做好标记先用甲醇漂洗几分钟后就行转膜，用PVDF膜，压膜过程中防止膜与滤纸之间有气泡。之后放入转膜缓冲液中进行转膜，转膜电压为100V电流不超过300mA，转膜2h后取出PVDF膜先用5％的脱脂奶粉进行封闭，室温小转速1h，之后倒出奶粉加入anti-GFP一抗(GFP抗体)小转速1h，之后用TBST缓冲液进行清洗3次/10min之后加入鼠二抗小转速1h，之后TBST缓冲液进行清洗3次/10min，显影，在ChemiDocTM MP Imagingsystem(Bio-Rad)拍照。

实施例3：超表达DoLEA43对转基因植株愈伤组织形成的影响

DoLEA43超表达转基因拟南芥株系种子和野生型拟南芥种子经现配的1％NaClO消毒10min后，无菌水漂洗6次后播种在1/2MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基(PH值5.7)中。4℃黑暗同步化2天，移至培养室，在22±2℃，16-h光照/8-h黑暗条件下培养。取6天大小的小苗进行愈伤组织诱导实验，用锋利的手术刀切在子叶和下胚轴连接约0.7mm处，用牙签小心挑起含根的下胚轴移至1/2MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基(PH值5.7)中，黑暗培养12天，统计野生型拟南芥和DoLEA43超表达转基因拟南芥株系的愈伤组织诱导率。如图5，DoLEA43超表达转基因拟南芥株系(DoLEA43超表达转基因拟南芥株系Line 2、Line 4和Line 6，均已确认成功将DoLEA43基因嵌入到拟南芥的基因组中)的愈伤组织诱导率显著高于野生型拟南芥的诱导率。DoLEA43超表达转基因拟南芥株系的愈伤组织比野生型拟南芥愈伤组织的大(图6)。因此DoLEA43参与到愈伤组织诱导，促进植物愈伤组织的形成。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43在促进植物愈伤组织形成中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

<400> 1

atggaagccg ctaaggagaa ggtctcgaac atctctgcaa cagctaaggc tggcttggac 60

aagacgaagg ccacagctga agaaaaggtc gacaaagtga agacaaggga tccgctacag 120

aaggaagtgg cggaggacag aaaagaccag aagattcatc aagctgagtt ggagaagcag 180

caagcgtacg agcagaatgc tatacataag ggagaagctc atcacacagg actcgggcac 240

caaactggcc tgggcgggca ccacacagga gttgggcagc ataccggctt gggtgggcac 300

cacactggag ttggacacca tactggctta gatgagacta ctggtggcgc aactggctta 360

cacagtacta atgcaccaat tacagacact aataaacact tgcctggcca ccacactggc 420

acaggattgt ag 432

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

<400> 2

Met Glu Ala Ala Lys Glu Lys Val Ser Asn Ile Ser Ala Thr Ala Lys

1 5 10 15

Ala Gly Leu Asp Lys Thr Lys Ala Thr Ala Glu Glu Lys Val Asp Lys

20 25 30

Val Lys Thr Arg Asp Pro Leu Gln Lys Glu Val Ala Glu Asp Arg Lys

35 40 45

Asp Gln Lys Ile His Gln Ala Glu Leu Glu Lys Gln Gln Ala Tyr Glu

50 55 60

Gln Asn Ala Ile His Lys Gly Glu Ala His His Thr Gly Leu Gly His

65 70 75 80

Gln Thr Gly Leu Gly Gly His His Thr Gly Val Gly Gln His Thr Gly

85 90 95

Leu Gly Gly His His Thr Gly Val Gly His His Thr Gly Leu Asp Glu

100 105 110

Thr Thr Gly Gly Ala Thr Gly Leu His Ser Thr Asn Ala Pro Ile Thr

115 120 125

Asp Thr Asn Lys His Leu Pro Gly His His Thr Gly Thr Gly Leu

130 135 140

Claims (4)

1.铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43或其编码基因在促进植物愈伤组织形成中的应用；所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA43的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的促进植物愈伤组织形成为促进植物下胚轴愈伤组织形成。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。

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