CN102094028A - 月季RcLEA编码序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体提供了一种在月季中表达的RcLEA编码序列及其在提高大肠杆菌BL21温度耐受性的应用。本发明包括含有上述基因的重组表达载体及表达载体转化的大肠杆菌BL21。本发明将所说基因在原核生物（大肠杆菌BL21）中表达，所获得的大肠杆菌BL21多种非生物胁迫耐性显著提高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在月季中表达的RcLEA（月季胚胎发育后期丰富蛋白，Rosa chinensis late-embryogenesis-abundant protein，RcLEA）蛋白基因的克隆，基因表达模式分析，转基因载体的构建，大肠杆菌的转化，转基因菌株的获得及其非生物胁迫耐性的鉴定。
背景技术
由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白。研究发现在植物胚胎发育晚期，LEA蛋白表达量十分丰富，而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA蛋白mRNA也会大量累积，被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一。LEA蛋白在细胞中分布广泛，具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态，起稳定细胞膜、分子屏障、离子结合和防止氧化等作用。
在没有胁迫或激素处理的条件下，拟南芥中的一些LEA基因表现出组成型表达特性；在干旱、冷和盐胁迫条件下，部分LEA基因可被胁迫强烈诱导表达。月季RcLEA基因为热激诱导表达，但在高温胁迫条件下，RcLEA只在耐热月季品种中强表达，而在不耐热品种中弱表达甚至不表达，该基因的表达与否与月季品种的田间耐热性差异观察结果相吻合。
大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性，自1981 年Dure等在棉花子叶中报告LEA 蛋白以来, 在许多植物的种子、花粉粒和受干旱胁迫的幼苗营养组织中, 发现LEA 蛋白可高水平表达, 且表达水平与植物细胞的抗逆性有着密切的关系. 目前关于LEA蛋白的抗胁迫研究已经积累了一些资料. 如Cheng等将小麦PMA1959 (LEA1 )基因转化水稻, 使转基因水稻的脱水耐盐能力得到增强。利用酵母细胞与植物细胞在一些耐盐反应上的相似性； Swire-Clark将小麦Em 基因(LEA1) 转化酵母, 证明了单一LEA蛋白在提高重组酵母对高浓度NaCl、KCl和低温胁迫的耐受性中起着直接作用。蔡丹等（2006）将大豆Em基因(LEA1) 转化大肠杆菌和烟草, 证明了大豆Em 蛋白的过量表达不仅对提高重组菌耐盐性有着直接的贡献, 也可提高转基因烟草对高盐胁迫的耐受性. 这一结果与前人在水稻和酵母中得到的结果一致, 为前人提出的假说, 即“LEA蛋白在原核生物和真核细胞中可能采取相似的抗逆保护机制”提供了实验证据, 也表明大肠杆菌异源表达体系是研究LEA蛋白耐盐机制的简单、快捷、有效的体系.。
随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。
本发明研究了一种从月季中克隆的胚胎发育后期丰富蛋白基因，转入大肠杆菌后提高转基因菌株对高温、低温及其它非生物胁迫耐性的技术，应用该技术不仅可以提高原核生物的温度抗性，而且预期可以提高转基因植物的温度抗性。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明申请中提及的月季RcLEA序列及其核酸序列。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新的月季基因RcLEA(SEQ ID NO.1)，该基因是一个胚胎发育后期丰富蛋白基因。
本发明的第二目的是提供这种月季胚胎发育后期丰富蛋白RcLEA编码序列在利用转基因技术提高大肠杆菌对多种非生物胁迫耐受性的应用。
本发明一方面从月季分离出了一种DNA分子，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。它是一种胚胎发育后期丰富蛋白基因，该基因长度为981bp。
本发明另一方面得到了一种蛋白质分子，它编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，由326个氨基酸残基组成，分子量为36068.98道尔顿，pI为4.526。
本发明还提供了一种检测RcLEAmRNA表达模式的方法，其步骤如下：
（1）耐热性能差异显著的两个月季品种二年生嫁接苗于25℃常温及38℃热激处理2.5—3.5小时，分别提取它们嫩叶的总RNA(植物RNAout试剂盒，市售)。
（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA逆转录成cDNA，然后根据RcLEA的开放读框的第1-20，962-981的特异序列设计引物，进行PCR。
本发明还提供上述编码月季胚胎发育后期丰富蛋白RcLEA在提高月季多种非生物胁迫耐受性方面的应用。具体是利用转基因技术将编码月季胚胎发育后期丰富蛋白RcLEA的核苷酸序列转化到大肠杆菌，使转基因菌株耐受非生物胁迫性能增加。其步骤如下：
（1）将编码具有月季RcLEA基因的开放阅读框可操作地连接于原核表达载体，形成含有该基因的原核表达重组载体；
（2） 将步骤（1）中的表达载体转入大肠杆菌细胞；
（3）通过筛选如抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并最终再生转基因菌株。转基因菌株耐受非生物胁迫性能增加。
具体操作步骤为：
（1）将RcLEA基因的开放阅读框可操作地连接于原核表达载体，形成含有该基因的原核表达重组载体；
（2）将步骤（1）中的重组表达载体转入大肠杆菌细胞。将含重组表达载体的大肠杆菌在液体LB（Amp+，终浓度为100mg/L）振荡培养（37℃，220rpm）至OD600=0.6；加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）后在相同条件下振荡培养2小时，OD600达1.0，将菌液作如下处理：（1）取菌液稀释至1000 Cell/ml，吸取其中100ml进行涂板（LB, Amp+），4℃，分别暗培养0、2、4、6、8、12天后转至37℃过夜暗培养，计算菌落数；
（3）将菌液转至50℃摇床，220 rpm分别培养0、1、2、3、4、5小时，菌液稀释至1000 Cell/ml，吸取其中100ml进行涂板（LB, Amp+），37℃过夜暗培养，计算菌落数。上述步骤（2）、（3）均以转空载菌株作平行对照；
（4）将含有重组表达载体（L1、L2，平行样）、转空载（EV）BL21重组菌株经IPTG诱导培养2 h至OD600达1.0，野生型BL21（WT）菌株于LB培养基中诱导培养作平行对照；4500 rpm离心5 min，无菌水重悬菌体，调0D600至1.0；以接种环取菌液于含有不同抗性的LB板上由里向外划“Z”线涂布，37 ℃过夜培养，观察菌落生长势；固体LB中分别加入下列试剂以制作不同抗性的LB板：①100、200、300、400 mmol/L LiCl，②400、500、550、600 mmol/L NaCl，③10、15、20、25 mmol/L Na2CO3，④300、350、400、450 mmol/L CdCl2，⑤200、300、400、500 m mol/L H2O2。
在本发明中，术语“月季RcLEA基因的开放阅读框”指编码完整的月季RcLEA蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1－981位的核苷酸序列。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。
在本发明中，还提供用于鉴定含重组子的大肠杆菌阳性克隆的核酸分子，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中1-20个连续的核苷酸和962-981个连续核苷酸的反向互补序列。
在本发明中，还提供用于检测样品中是否存在月季RcLEA基因核苷酸序列的方法，它包括用前述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段。样品为转基因大肠杆菌菌株。
表1为本发明的月季RcLEA与杏（Prunus armeniaca）PaLEA的核苷酸序列（GenBank Accession No. AF071894）的同源性比较（FASTA）表。
表2为本发明的月季RcLEA与杏PaLEA的氨基酸序列（GenBank Accession No. AAC24588.1）的同源性比较（FASTA）表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。
附图说明
图1为RT-PCR鉴定月季RcLEA基因的表达模式。其中，NT-常温；HT-高温；KP-‘新十全’、 SM-‘曼海姆宫殿’、LV-‘赌城’。ACTIN为内参。
图2为含重组子和空载的菌株对4℃低温的不同耐性。
图3为含重组子和空载的菌株对50℃高温的不同耐性。
图4 为含重组子和空载的菌株及野生菌株对多种非生物胁迫的不同耐性。其中，EV是转入空载体的菌株，WT是野生型菌株，L1、L2是转入RcLEA的菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989）中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 月季RcLEA基因的克隆。
1．将耐热性强的月季品种‘曼海姆宫殿’（Schloss mannieim ）(以下简称‘曼海姆’)和耐热性弱的‘新十全’（Kordes' Perfecta）进行38℃热激3小时，提取叶片的可溶性总蛋白，采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，双向电泳后对其中差异明显的1个蛋白质点进行肽质量指纹谱的分析, 并检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测，结合分析软件分析的表观等电点、分子量和数据库检索结果进行综合分析，初步认定此蛋白质点为LEA。
2．提取热激处理后的‘曼海姆’嫩叶总RNA，提取试剂盒为植物RNAout（市售），利用反转录试剂盒（市售）将总RNA逆转录成cDNA 。根据古老玫瑰LEA（GenBank Accession No.BI978651）部分同源序列设计引物，采用RT-PCR方法从‘曼海姆’cDNA中扩增出一条721bp的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的胚胎发育后期丰富蛋白基因序列高度保守。在该片段序列中设计3对反向PCR引物。
3．基因组DNA的提取
取‘曼海姆’嫩叶片，研成液氮粉，立即加入预热的提取缓冲液，65℃保温25min，离心，上清以等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提2次，以乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤两次，最后用TE溶解DNA；加入RNaseA（0.5μg/ml），65℃消化RNA 1h；用0.8%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。
4．用限制性内切酶Sal I对基因组DNA进行充分酶切，纯化并回收酶切后的片段，以T4连接酶催化片段首尾自连成环。以自连后的片段作反向PCR模板，以上述3对反向引物进行三轮巢式PCR，获得一条1190bp片段，回收、纯化，连接到T-载体上，测序，序列分析后获得基因的5’端序列。
5．3’-RACE获得RcLEA基因3’ 端
用3’-RACE反转录试剂盒（市售）将‘曼海姆’嫩叶总RNA反转录成cDNA作3’-RACE模板，以上述3对反式PCR引物的正向引物（5’-3’）分别与3’-RACE引物AUAP配对进行三轮巢式PCR；回收获得的536bp片段，纯化，连接到T-载体上，测序，序列分析后获得基因的3’端序列。
6．全长基因的克隆
根据基因5’、3’端序列设计引物，采用RT-PCR方法从‘曼海姆’cDNA中扩增出一条981bp的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的胚胎发育后期丰富蛋白序列高度保守。
实施例2 月季RcLEA基因的序列信息与同源性分析。
本发明新的月季RcLEA基因长度为981 bp，详细序列见SEQ ID NO.1。该基因编码的多肽由326个氨基酸残基组成，分子量为36068.98道尔顿，pI为4.526。详细序列见SEQ ID NO.2。
将月季RcLEA全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序在Non－redundant GeneBank＋EMBL+DDBJ+PDB 和Non－redundant GeneBank CDS translations＋PDB+SwissPort＋Superdate＋PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与 杏PaLEA存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与杏PaLEA基因的mRNA编码序列（GenBank Accession No. AF071894）有一定的同源性（见表1），在氨基酸水平上，它与杏PaLEA蛋白的氨基酸残基有88%的相似性（见表2）。由上可见，该月季RcLEA基因与杏PaLEA基因存在较高的同源性。
实施例3 月季RcLEA表达模式分析。
用RT－PCR的方法检测
分别取25℃（常温）及38℃热激3h的‘曼海姆’、‘赌城’(Las vegas)和 ‘新十全’嫩叶提取总RNA，反转录成cDNA，然后根据RcLEA基因特异序列设计一对引物，进行PCR。电泳之后，用相对定量软件（天呈公司）进行分析。结果表明，常温下，RcLEA在三个月季品种中均不表达，热激后在耐热品种‘曼海姆’、‘赌城’表达而‘新十全’不表达（图1）。
实施例4 月季RcLEA基因在大肠杆菌中进行原核表达。
含目的基因（月季RcLEA）表达载体的构建
根据月季RcLEA基因全长序列设计引物以扩增除终止子TAA之外的编码阅读框，并在正、反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点Sac I和Sal I，以便构建原核表达载体。以实施例1中获得的‘曼海姆’cDNA为模板，经PCR扩增后，将月季RcLEA基因正向克隆到原核表达载体pET32a中，在保证阅读框架的前提下，将其转入大肠杆菌BL21中进行原核表达。
实施例5 月季RcLEA基因提高大肠杆菌对多种非生物胁迫的抗性。
（1）低温胁迫。将含重组表达载体的大肠杆菌在液体LB（Amp+）中培养，取菌液稀释至1000 Cell/ml，吸取其中100ml进行涂板（LB, Amp+），4℃，分别暗培养0、2、4、6、8、12天后转至37℃过夜暗培养，计算菌落数。在各个时间段，转RcLEA的菌株活力都高于转入空载的菌株（图2）。
（2）高温胁迫。将菌液转至50℃摇床，220 rpm分别培养0、1、2、3、4、5小时，菌液稀释至1000 Cell/ml，吸取其中100ml进行涂板（LB, Amp+），37℃过夜暗培养，计算菌落数。除处理5小时，全部死亡外，其他高温处理后，转RcLEA的菌株活力都高于转入空载的菌株（图3）。
（3）将含有重组表达载体（L1、L2，平行样）、转空载（EV）BL21重组菌株，野生型BL21（WT）菌株，以接种环取菌液于含有不同胁迫的LB板上由里向外划“Z”线涂布，37 ℃过夜培养，观察菌落生长势；固体LB中分别加入下列试剂以制作不同胁迫的LB板：①100、200、300、400 mmol/L LiCl，②400、500、550、600 mmol/L NaCl，③10、15、20、25 m mmol/L Na2CO3，④300、350、400、450 mmol/L CdCl2，⑤200、300、400、500 m mol/L H2O2。与野生型和空载相比，L1、L2对这些胁迫的抗性明显提高（图4）。
表1
月季RcLEA基因核苷酸序列与杏PaLEA基因核苷酸序列的同源性比较
F071894.1|AF071894 Prunus armeniaca late embryogenesis-like protein (LEA) mRNA,
partial cdsLength=993
Score = 910 bits (1008), Expect = 0.0
Identities = 672/784 (85%), Gaps = 0/784 (0%) Strand=Plus/Plus
Query为月季RcLEA基因核苷酸序列
Sbjct为杏PaLEA基因核苷酸序列（GenBank Accession No. AF071894）。
表2
月季RcLEA编码的蛋白质序列与杏PaLEA蛋白的氨基酸序列同源性比较
gb|AAC24588.1| late embryogenesis-like protein [Prunus armeniaca]
Length=262
Score = 455 bits (1170), Expect = 4e-126, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 221/250 (88%), Positives = 240/250 (96%), Gaps = 0/250 (0%)
Query为月季RcLEA氨基酸序列
Sbjct为杏PaLEA氨基酸序列（GenBank Accession No. AAC24588.1）。
<110> 上海植物园/复旦大学
<120> 月季RcLEA编码序列及其应用
<130> 001
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213>
<400> 1
atggcatcct atgatgactc agcaagatca gatcgcggca ttaaggagga ggagaaaaaa 60
cacaatgggg aggaagagga gggtgacagc ttcatagata aggtcaagga tttcattcat 120
gacattggcg agaagatcga gggagctatc ggatttggta agcccactgc agatgtggct 180
gcaattcaca tcccctgcat aaatctggag aaggcagaga ttgcggttga tgtgcttatt 240
aagaacccaa atcctgtgcc catcccgctc attgacataa actacttgat tgaaagtgat 300
ggtaggaaac tggtgtctgg attgatcccg gacgctggaa caatccaggc tcatggagaa 360
gagactgtca aagttccact tcacttgatt tacgatgaca tcaagagcac ctacaatgat 420
atcgagcctg gaagcatcat tccctacagg atcaaggttg atctcattgt ggatgtccct 480
gttcttggca ggctcactct cccacttgag aaaactggag agatccccat cccctacaaa 540
cctgatgttg atgttgacaa aatcaagttt cagaaattct cctttgaaga aactgttgca 600
gtgctccatt tgaagctcga gaacatgaat gactttgact tgggcctcaa tgttttagac 660
tacgagattt ggctctgtga ggtcagcatt ggaggcgctg agctctccaa atctgccaac 720
cttgaaaaga aaggtatcac ttttgttgac gttcctatta ccttcaggcc aaaggatttt 780
ggctctgcac tctgggatat gatccgcggt aggggtactg gttatacctt caaaggccat 840
atcgatgttg atactccctt tggggccatg aagttaccca ttgtcaagga gggtggtact 900
acacgcctca agaagagcaa ggaagatggt ggcgacgatg atgacgatga tgaggtaagt 960
aatctctaca ctggatttta a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213>
<400> 2
Met Ala Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Arg Ser Asp Arg Gly Ile Lys Glu
1 5 10 15
Glu Glu Lys Lys His Asn Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Ser Phe Ile
20 25 30
Asp Lys Val Lys Asp Phe Ile His Asp Ile Gly Glu Lys Ile Glu Gly
35 40 45
Ala Ile Gly Phe Gly Lys Pro Thr Ala Asp Val Ala Ala Ile His Ile
50 55 60
Pro Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Glu Ile Ala Val Asp Val Leu Ile
65 70 75 80
Lys Asn Pro Asn Pro Val Pro Ile Pro Leu Ile Asp Ile Asn Tyr Leu
85 90 95
Ile Glu Ser Asp Gly Arg Lys Leu Val Ser Gly Leu Ile Pro Asp Ala
100 105 110
Gly Thr Ile Gln Ala His Gly Glu Glu Thr Val Lys Val Pro Leu His
115 120 125
Leu Ile Tyr Asp Asp Ile Lys Ser Thr Tyr Asn Asp Ile Glu Pro Gly
130 135 140
Ser Ile Ile Pro Tyr Arg Ile Lys Val Asp Leu Ile Val Asp Val Pro
145 150 155 160
Val Leu Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Glu Lys Thr Gly Glu Ile Pro
165 170 175
Ile Pro Tyr Lys Pro Asp Val Asp Val Asp Lys Ile Lys Phe Gln Lys
180 185 190
Phe Ser Phe Glu Glu Thr Val Ala Val Leu His Leu Lys Leu Glu Asn
195 200 205
Met Asn Asp Phe Asp Leu Gly Leu Asn Val Leu Asp Tyr Glu Ile Trp
210 215 220
Leu Cys Glu Val Ser Ile Gly Gly Ala Glu Leu Ser Lys Ser Ala Asn
225 230 235 240
Leu Glu Lys Lys Gly Ile Thr Phe Val Asp Val Pro Ile Thr Phe Arg
245 250 255
Pro Lys Asp Phe Gly Ser Ala Leu Trp Asp Met Ile Arg Gly Arg Gly
260 265 270
Thr Gly Tyr Thr Phe Lys Gly His Ile Asp Val Asp Thr Pro Phe Gly
275 280 285
Ala Met Lys Leu Pro Ile Val Lys Glu Gly Gly Thr Thr Arg Leu Lys
290 295 300
Lys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Val Ser
305 310 315 320
Asn Leu Tyr Thr Gly Phe
325
Claims (6)
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，是月季RcLEA基因，长度为981bp，其核苷酸序如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，其编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一种如权利要求1所述的DNA分子在提高转基因菌株非生物胁迫耐性方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于具体操作步骤为：
（1）将编码具有月季RcLEA基因的开放阅读框可操作地连接于原核表达载体，形成含有该基因的原核表达重组载体；
（2） 将步骤（1）中的表达载体转入大肠杆菌细胞；
（3）通过筛选，获得转化细胞并最终再生转基因菌株，该转基因菌株耐受非生物胁迫性能增加。
5.一种用于鉴定含重组子的大肠杆菌阳性克隆的核酸分子，其特征在于，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中1-20个连续的核苷酸和962-981个连续核苷酸的反向互补序列。
6.一种用于检测样品中是否存在月季RcLEA基因核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求5所述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因大肠杆菌菌株。
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