CN113429465B

CN113429465B - 一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN113429465B
Application number: CN202110562499.5A
Authority: CN
Inventors: 孙婷婷; 邹莉; 刘瑞鹏
Original assignee: Harbin University
Current assignee: Harbin University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113429465A

Abstract

本发明公开了一种桑黄MADS‑box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用。所述的转录因子PbMADS1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，并且公开了该编码基因在调控桑黄菌丝的生长速度中的用途。同时还公开了一种过表达重组载体，其包含转录因子PbMADS1编码基因序列。本发明通过量表达PbMADS1的转基因桑黄菌株(T)与野生型(WT)相比，菌丝生长速度可提高17.5％，说明所获得的转录因子PbMADS1参与桑黄菌丝生长发育的调控，在实际生产中应用有助于缩短桑黄人工培育周期。

Description

一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于食用菌基因工程领域，具体涉及一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用。

背景技术

桑黄(Phellinus baumii)是十分珍贵的大型药用真菌，在我国有着2000多年的药用历史。《神农本草经》描述为“久服轻身不老延年”；《中药大辞典》叙述可治内科多种疾病，其子实体入药，味微苦，能利五脏宣肠气等；《本草纲目》记载桑黄能治血崩、血淋、经闭等症。近年来学界对于桑黄药理活性的关注始于1968年日本学者Ikekawa发现桑黄提取物具有很好的肿瘤抑制活性，且不表现细胞毒性。随后，科学家们对桑黄的研究不断深入，越来越多的证据表明桑黄具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降低血糖、保护肝脏、增强机体免疫力等多种重要的药理活性作用。这些都使得桑黄的研究成为人们关注的热点，使其在药品研发、临床应用、以及保健品开发等领域有着广阔的应用前景。然而目前野生桑黄资源逐渐枯竭，远不能满足人们对桑黄的需求，加之人们对桑黄生长发育的调控机理知之甚少，导致人工栽培桑黄仍处于起步阶段，尚未实现大规模工厂化生产。

MADS-box是一个保守性很强的DNA结合结构域，对植物的成熟衰老和食用菌的发育起到重要的调控作用。在植物中，番茄MADS-box的突变体果实不能正常成熟；香蕉MADS-box转录因子基因受到RNA干扰后也出现了延缓成熟的表型。在食用菌中，比较茶树菇菌丝与子实体两个时期的cDNA文库时，发现了一个MADS-box差异表达基因，认为它参与了子实体形成的调控；香菇MADS-box转录因子在菌丝转色形成中可能有作用；草菇MADS-box转录因子，推测其参与调控草菇菌柄的伸长，菌盖的开伞。然而，桑黄作为一种珍稀药用真菌，生长周期较长，而有关其生长发育调控机制的研究仍很缺乏。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于参与桑黄菌丝生长发育的调控。

本发明的另一目的是提供一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，如上所述的编码基因，在调控桑黄菌丝的生长速度中的用途，在实际生产中应用有助于缩短桑黄人工培育周期。

进一步，如上所述的用途将所述编码基因转入桑黄基因组中，并在转基因菌株中超量表达，能使菌丝的生长速度提高。

本发明的另一目的是提供一种过表达重组载体，其包含如上所述的转录因子PbMADS1编码基因cDNA全长核苷酸序列。

进一步的，所述的过表达重组载体是将所述的桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1的编码基因插入pCAMBIA1301-gpd-gpd载体的BglⅡ酶切位点间所得。

本发明的另一目的是提供一种转基因菌株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将如上所述的过表达重组载体转入桑黄基因组中，筛选获得桑黄转基因菌株。

进一步的，如上所述的桑黄转基因菌株与野生型相比，桑黄菌丝的生长速度提高。

本发明的优点及有益效果：本发明的过表达PbMADS1基因的桑黄菌株可以显著提高菌丝的生长速度，提高17.5％，结果表明转录因子PbMADS1参与桑黄菌丝生长发育的调控，在实际生产中应用有助于缩短桑黄人工培育周期，该基因可作为重要的基因资源，在桑黄培育基因工程中得到应用。

附图说明

图1是桑黄PbMADS1基因的PCR扩增电泳图，M：DL2000 DNA marker；1：PbMADS1基因DNA全长扩增结果；2：PbMADS1基因cDNA全长扩增结果；

图2是桑黄PbMADS1蛋白的保守结构域结果图；

图3是桑黄PbMADS1蛋白三级结构预测图；

图4是桑黄pCAMBIA1301-gpd-gpd-PbMADS1过表达载体的构建；

图5是转基因桑黄菌株和野生型菌株的潮霉素抗性基因PCR检测，M：DL2000 DNAmarker；T1-T3：转基因桑黄菌株；WT：野生型桑黄菌株；

图6是转基因桑黄菌株与野生型菌株在PDA培养基上的生长状况比较，WT：野生型桑黄菌株；T：转基因桑黄菌株。

具体实施方式

本发明提供了一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1，分别以桑黄DL101菌株的基因组DNA和RNA反转录的cDNA为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了PbMADS1基因全长序列，并确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列；进一步将PbMADS1基因构建到表达载体pCAMBIA1301-gpd-gpd中，并转化根癌农杆菌EHA105，采用根癌农杆菌介导桑黄的遗传转化来鉴定PbMADS1的功能。下面举例对本发明做进一步的说明：

实施例1、桑黄PbMADS1基因的克隆

对桑黄菌种DL101(该桑黄菌DL101，Phellinus baumii DL101，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072，保藏日期为2011年4月25日，保藏编号为：CCTCC No：M 2011137)采用PDA培养基进行活化，25℃培养8～10d，收集桑黄菌丝体，并分别使用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒和RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒进行桑黄菌丝体DNA的提取和RNA的提取，经检测合格的RNA样品，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)试剂盒说明书将RNA样品反转录为cDNA。已提取的桑黄DNA和反转录获得的cDNA置于-20℃保存备用。

根据本实验室测得的桑黄转录组数据库分析、筛选得到桑黄PbMADS1基因，根据基因全长序列设计一对克隆引物：

正向引物序列F1为：5ˊ-TCTCAGATCCCTTCCCCGAA-3ˊ；

反向引物序列R1为：5ˊ-TTACCTCCTATACGTTGGCTGC-3ˊ。

分别以上述-20℃保存的桑黄DNA和cDNA为模板，采用50μL体系进行PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物如图1所示，与预测大小相符，PCR产物经胶回收纯化后分别与pMD18-T载体(TaKaRa，大连)连接，转化大肠杆菌Top10，挑选阳性克隆，进行测序。测序结果表明，PbMADS1基因DNA序列全长1141bp，序列如SEQ ID NO.1所示，包含两个外显子和一个内含子，含有一个957bp的开放阅读框(ORF)，编码318个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2、桑黄PbMADS1基因的生物信息学分析

采用ExPASy服务器上的ProtParam tool软件对PbMADS1基因编码的氨基酸序列进行分子量大小、等电点等理化性质分析，结果显示其分子量为32.71kDa，等电点为6.97；对该蛋白的保守结构域预测显示PbMADS1蛋白属于MADS superfamily(图2)；采用ExPASy服务器上的ProtScale软件对氨基酸的亲/疏水性分析，PbMADS1蛋白中疏水性氨基酸数量多于亲水性氨基酸，属于疏水性蛋白；分别使用在线工具TMHMM Server v.2.0和SignalP5.0server对蛋白的跨膜区和信号肽进行分析，结果表明PbMADS1蛋白不具跨膜结构，不含信号肽；通过ExPASy服务器上的GOR在线软件对PbMADS1蛋白进行二级结构预测，表明PbMADS1蛋白的主要组成部分包括19.18％的α-螺旋、7.86％％的延伸链和72.96％的无规卷曲组成；采用比较建模法，运用SWISS-MODEL对蛋白的三级结构进行预测，PbMADS1蛋白三级结构预测图是以Serum response factor(SRF)(SMTL id：1srs.1.C)的蛋白结构图为模板得到的，建模残基范围是第46位氨基酸到第127位氨基酸，序列相似度为74.16％(图3)。将得到的cDNA序列，序列如SEQ ID NO.2所示，进行Blastx比对，结果表明，该序列与灵芝、草菇、平菇MADS-box转录因子的相似性分别为88.72％、85.83％、83.85％。

实施例3、桑黄PbMADS1基因的功能鉴定

对PbMADS1基因编码区进行克隆，以桑黄cDNA为模板，根据PbMADS1编码区设计引物并分别引入BglⅡ酶切位点，

FB：GGAagatctATGCAAGCAACTGACTCGCAAG

RB：GGAagatctTTACCTCCTATACGTTGGCTGC，

其中小写字母为引入的BglⅡ酶切位点。

将pCAMBIA1301-gpd-gpd重组质粒(前期已将pCAMBIA1301载体上的两个CaMV35Spromoter替换为香菇gpd promoter)用限制性内切酶BglⅡ进行单酶切后切胶回收，与同样经过BglⅡ单酶切的PbMADS1基因编码区的纯化产物采用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒进行测序。

将上述测序结果正确的质粒，采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆，即获得PbMADS1过表达载体pCAMBIA1301-gpd-gpd-PbMADS1，构建过程如图4所示。PbMADS1过表达载体通过农杆菌介导法转化桑黄原生质体，主要步骤为：将上述验证含有重组质粒pCAMBIA1301-gpd-gpd-PbMADS1的农杆菌菌液加入LB培养基，于28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.6后，离心收集菌体，沉淀用IM(诱导培养基)重悬，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.3；每10⁶～10⁷个桑黄原生质体与200μL上述农杆菌混合，同时添加乙酰丁香酮(终浓度为0.2mM)，置于25℃共培养36h；用0.6M甘露醇洗涤一次，离心收集菌体后再加入1ml 0.6M甘露醇溶解沉淀，取200μl涂布于再生抗性培养基(含20μg/ml潮霉素)上，28℃避光倒置培养。以经潮霉素筛选的抗性菌株基因组DNA为模板，以野生型菌株基因组DNA为阴性对照，以引物HygF：CGATCGACAGATCCGGTCGGCA和HygR：GTGCTTGACATTGGGGAGTTTAG进行PCR反应，结果如图5所示，扩增片段大小与预期相符，表明目的基因已成功转入桑黄中。将鉴定出的转基因桑黄菌株(T)和野生型菌株(WT)分别接种于PDA培养基，26℃避光培养。对其生长状况进行观察，与WT相比，转基因菌株的生长速度提高17.5％(图6)。

序列表

<110> 哈尔滨学院

<120> 一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1141

<212> DNA

<213> Phellinus baumii

<400> 1

atgcaagcaa ctgactcgca aggcgctcca atccagcagc agccggcgac tgaggacggc 60

ttcgtcaatg acaatgatgc cgccgagtct cccggtgatg acgatgagga agaaggcgca 120

aaatcggaca agaaggctgg tcgtcgtaaa attaagatcg agttcatcca ggacaagagt 180

cggcgccaca ttacattctc gaaacggaag gctggtgagt gtgccatttc tggtcataca 240

tacattgctt ccgtcacgcc gacgcgtaca cggcatgcct gtcggtgtcg ttctcgccgc 300

gcacattatt tccattattt tcctcttatt tcgtctgaat attcgaaccg tgtgaacata 360

tgcgctgatt gcaacaacac tgccttcatc acgcacaggt attatgaaga aggcctatga 420

actttctact ctcactggca ctcaagtgct tttgctcgtc gtgtccgaaa ccggccttgt 480

ctataccttc accactgcga aactgcagcc gttggtgacc cagccagagg gcaaaaatct 540

tatccaggca tgtcttaatg ctcctcatgg tcaacttccg tcaagcatgc ccgttggtac 600

accacttggc cggcctgcgc ctcagcaaat gcagactcag gcaggtgcag gcgggcaaaa 660

tcagtcagtt tcaggaatgc cgccgccgcc aatgggccaa cgcaatgttc ctggtggtct 720

cgcaattggc ggcggcgccg gcggtgtatc aggacaagct ggcgaagatg cagatggtga 780

acgcgataca cacgacgatg tcgatgttga agctgacaaa cgtggggctc ctcgtcgaag 840

gacatcaggt gcttcaaagc aaggtgctaa tgcgagtagc ggccaagctg gtgcagcgcg 900

aagcccaacg actccaagtg cacacgttgg cgcgcctccg cagggcatcc cgcccatggg 960

tcagccatca tatggcgccg cacctggtag tgctggtcag gacggtgcag ctggacatcc 1020

agcgcctccg gtgtacccga tgtacgcaaa tgcgccccaa acagggtatt atcctcctcc 1080

tggaatggct tggggccagc ctcagggagg tcctcccccg cagccaacgt ataggaggta 1140

a 1141

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> Phellinus baumii

<400> 2

atgcaagcaa ctgactcgca aggcgctcca atccagcagc agccggcgac tgaggacggc 60

ttcgtcaatg acaatgatgc cgccgagtct cccggtgatg acgatgagga agaaggcgca 120

aaatcggaca agaaggctgg tcgtcgtaaa attaagatcg agttcatcca ggacaagagt 180

cggcgccaca ttacattctc gaaacggaag gctggtatta tgaagaaggc ctatgaactt 240

tctactctca ctggcactca agtgcttttg ctcgtcgtgt ccgaaaccgg tcttgtctat 300

accttcacca ctgcgaaact gcagccgttg gtgacccagc cagagggcaa aaatcttatc 360

caggcatgtc tcaatgctcc tcatggtcaa cttccgtcaa gcatgcccgt tggtacacca 420

cttggccggc ctgcgcctca gcaaatgcag actcaggcag gtgcaggcgg gcaaaatcag 480

tcagtttcag gaatgccgcc gccgccaatg ggccaacgca atgttcctgg tggtctcgca 540

attggcggcg gcgccggcgg tgtatcagga caagctggcg aagatgcaga tggtgaacgc 600

gatacacacg acgatgtcga tgttgaagct gacaaacgtg gggctcctcg tcgaaggaca 660

tcaggtgctt caaagcaagg tgctaatgcg agtagcggcc aagctggtgc agcgcgaagc 720

ccaacgactc caagtgcaca cgttggcgcg cctccgcagg gcatcccgcc catgggtcag 780

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cctccggtgt atccgatgta cgcaaatgcg ccccaaacag ggtattatcc tcctcctgga 900

atggcttggg gccagcctca gggaggtcct cccccgcagc caacgtatag gaggtaa 957

<210> 3

<211> 318

<212> PRT

<213> Phellinus baumii

<400> 3

Met Gln Ala Thr Asp Ser Gln Gly Ala Pro Ile Gln Gln Gln Pro Ala

1 5 10 15

Thr Glu Asp Gly Phe Val Asn Asp Asn Asp Ala Ala Glu Ser Pro Gly

20 25 30

Asp Asp Asp Glu Glu Glu Gly Ala Lys Ser Asp Lys Lys Ala Gly Arg

35 40 45

Arg Lys Ile Lys Ile Glu Phe Ile Gln Asp Lys Ser Arg Arg His Ile

50 55 60

Thr Phe Ser Lys Arg Lys Ala Gly Ile Met Lys Lys Ala Tyr Glu Leu

65 70 75 80

Ser Thr Leu Thr Gly Thr Gln Val Leu Leu Leu Val Val Ser Glu Thr

85 90 95

Gly Leu Val Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Lys Leu Gln Pro Leu Val Thr

100 105 110

Gln Pro Glu Gly Lys Asn Leu Ile Gln Ala Cys Leu Asn Ala Pro His

115 120 125

Gly Gln Leu Pro Ser Ser Met Pro Val Gly Thr Pro Leu Gly Arg Pro

130 135 140

Ala Pro Gln Gln Met Gln Thr Gln Ala Gly Ala Gly Gly Gln Asn Gln

145 150 155 160

Ser Val Ser Gly Met Pro Pro Pro Pro Met Gly Gln Arg Asn Val Pro

165 170 175

Gly Gly Leu Ala Ile Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ser Gly Gln Ala

180 185 190

Gly Glu Asp Ala Asp Gly Glu Arg Asp Thr His Asp Asp Val Asp Val

195 200 205

Glu Ala Asp Lys Arg Gly Ala Pro Arg Arg Arg Thr Ser Gly Ala Ser

210 215 220

Lys Gln Gly Ala Asn Ala Ser Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Arg Ser

225 230 235 240

Pro Thr Thr Pro Ser Ala His Val Gly Ala Pro Pro Gln Gly Ile Pro

245 250 255

Pro Met Gly Gln Pro Ser Tyr Gly Ala Ala Pro Gly Ser Ala Gly Gln

260 265 270

Asp Gly Ala Ala Gly His Pro Ala Pro Pro Val Tyr Pro Met Tyr Ala

275 280 285

Asn Ala Pro Gln Thr Gly Tyr Tyr Pro Pro Pro Gly Met Ala Trp Gly

290 295 300

Gln Pro Gln Gly Gly Pro Pro Pro Gln Pro Thr Tyr Arg Arg

305 310 315

Claims

1.一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1编码基因在调控桑黄菌丝的生长速度中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于,将所述编码基因转入桑黄基因组中，并在转基因菌株中超量表达，能使菌丝的生长速度提高。

5.一种过表达重组载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的转录因子PbMADS1编码基因cDNA全长核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的过表达重组载体，其特征在于：所述的过表达重组载体是将所述的桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1的编码基因插入pCAMBIA1301-gpd-gpd载体的BglⅡ酶切位点间所得。

7.一种转基因菌株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将权利要求5所述的过表达重组载体转入桑黄基因组中，筛选获得桑黄转基因菌株。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的桑黄转基因菌株与野生型相比，桑黄菌丝的生长速度提高。