CN114214339A

CN114214339A - 一种汉麻thcsas2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用

Info

Publication number: CN114214339A
Application number: CN202111492764.3A
Authority: CN
Inventors: 刘圆圆; 白旭; 李珉轩; 欧阳雨锃; 吴琴琴
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明公开了一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用，属于基因工程技术领域。本发明在8个品种的汉麻基因组和9个品种的转录组数据基础上，通过基因组学和转录组学手段，筛选出潜在的萜烯酚酸衍生物合酶候选基因THCSAS2及其编码产物。汉麻THCSAS2基因的cDNA全长为1641bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2，由546个氨基酸残基组成，具有催化CBGA底物活性；具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。汉麻THCSAS2基因及其编码产物对于萜烯酚酸衍生物生物合成的分子机理和汉麻育种研究具有重要的意义。

Description

一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用。

背景技术

萜烯酚酸衍生物THC（Δ⁹-tetrahydrocannabinol）和CBD（cannabidiol）在抗肿瘤、神经系统保护、免疫调节和抗炎抗氧化等方面具有重要的药用价值。2015年，英国GW制药公司研制的Epidiolex（CBD含量高达98%）成为首个获FDA批准大麻药物，用于治疗儿童癫痫症。目前基于汉麻中萜烯衍生物的药物例如 Marinol、Syndros、 Cesamet、Sativex 等已被美国、英国、加拿大等国家批准用于治疗疾病。

THC、CBD、CBC（cannabichromene）和CBG（cannabigerol）是THCA（Δ⁹-tetrahydrocannabinolic acid）、CBDA（cannabidiolic acid）、CBCA（cannabidiolicacid）和CBGA（cannabigerolic acid）的脱羧形式（化学结构见图1）。目前能够催化CBGA的氧化环化酶包括THCAS（Δ⁹-tetrahydrocannabinolic acid synthase）、CBDAS（cannabidiolic acid synthase）、CBCAS（cannabichromenic acid synthase）三种合酶，它们共同竞争相同的前体CBGA，分别产生THCA、CBDA和CBCA。催化CBGA的氧化环化酶是小檗碱桥酶（BBE，Berberine bridging enzyme）类家族的成员，其特征是一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD，flavin adenine dinucleotide）结合域，一个底物结合域和一个BBE样特异性C端。

汉麻中，目前有120多种萜烯酚酸衍生物已经被分离和鉴定，只有少部分的萜烯酚酸衍生物的合成酶被发现鉴定，大部分还不清楚，关键合酶基因的鉴定还需要不断的发掘。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用。本发明在8个品种的汉麻基因组和9个品种的转录组数据基础上，前期通过基因组学和转录组学手段，筛选出的潜在的萜烯酚酸衍生物合酶候选基因THCSAS2及其编码产物。基因组和转录组数据来源于本实验室所建立的大麻数据网站（http://gdb.supercann.net/）

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种汉麻THCSAS2基因，其cDNA全长为1641bp，位于汉麻Finola 品种的6号染色体22244171-22245809核苷酸之间，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种汉麻THCSAS2基因的编码产物萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2，所述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2由THCSAS2基因cDNA编码所得，由546个氨基酸残基组成，具有催化CBGA底物活性；具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有上述汉麻THCSAS2基因的克隆载体或表达载体。

一种含有上述汉麻THCSAS2基因的转基因株系。所述转基因株系包括重组转化所形成的转基因株系，以及由此产生的外源基因表达产物。

上述汉麻THCSAS2基因在汉麻育种中的应用。

上述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2在生物工程的应用。

上述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2在萜烯酚酸衍生物生物合成中的应用。

本发明的有益之处在于：本发明提供了一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用。利用cDNA芯片技术，从汉麻中克隆得到基因THCSAS2的cDNA全长，进一步构建了毕赤酵母表达系统和烟草瞬时表达体系，成功表达目的蛋白，并在体内和体外检测其生物学活性，最终经过UPLC-MSMS技术分析得到了验证。该酶的发现对于萜烯酚酸衍生物生物合成的分子机理和汉麻育种研究具有重要的意义。

附图说明：

图 1 THC、CBD、CBC、CBG、THCA、CBDA、CBCA和CBGA 化学结构图。

图2 本发明实施方式流程图。

图3 THCAS2构建在pPIC9K载体上的图谱示意图。

图4 THCAS2构建在pEAQ-HT载体上的图谱示意图。

图5 THCAS2体外酶促反应UPLC-MSMS分析。A:液相色谱图Standard显示的是CBDA,THCA,CBCA三种标准品的色谱峰图；THCAS2_P.pastoris 显示的是THCAS2基因在毕赤酵母中表达、纯化后的THCAS2蛋白加入CBGA底物后的体外酶反应色谱图，Empty 显示的是带有空载体的毕赤酵母表达的蛋白的加入CBGA底物后的体外酶反应色谱图；B:柱状图显示THCAS2将CBGA底物转化为CBDA,THCA,CBCA产物的量。

图6THCAS2烟草瞬时转化后对烟草叶片进行UPLC-MSMS分析。A:液相色谱图standards显示的是CBDA,THCA,CBCA三种标准品的色谱峰图；THCAS2_N.tabacum显示的是携带有外源THCAS2基因的农杆菌和底物CBGA一起被注射进入的在烟草叶肉细胞中，烟草叶片经甲醇提取后经过UPLC-MS 检测的色谱图；Empty 显示的是带有空载体的农杆菌和CBGA一起被注射进入的在烟草叶肉细胞中，烟草叶片经甲醇提取后经过UPLC-MS 检测的色谱图；B:柱状图显示THCAS2外源基因的表达产物将CBGA底物转化为CBDA,THCA,CBCA产物的量。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

本发明实施方式流程见图2。

实施例1、萜烯酚酸衍生物合酶候选基因THCSAS2的筛选

通过大麻基因组数据库（http://gdb.supercann.net/）现有的8个品种工业大麻的基因组数据与一组植物基因组序列（其中包括3种模式植物(水稻、拟南芥和番茄茄)、一种桑科植物(桑树)以及大麻的最近亲缘物种——啤酒花）进行比较，结果发现工业大麻和啤酒花中的单拷贝基因是其它物种的两倍，这些单拷贝基因主要是光合作用修复、蛋白质磷酸化和大麻素合酶家族（即催化CBGA生成THCA,CBDA,CBCA的合酶家族），对44种假定的大麻素合酶家族氨基酸序列建立进化树分析，THCAS2被分到了单独的一支，同时对9个大麻品种转录组数据分析大麻素合酶家族的表达量，除了已知的大麻素合酶THCAS,CBDAS,CBCAS高表达外，THCAS2基因在Finola品种中高表达，因此认为THCAS2有可能是一种具有生物催化活性的大麻素合酶。

实施例2、基因克隆及质粒构建

汉麻花总RNA提取：汉麻的总RNA提取使用天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取。提取结束后于-80℃冰箱保存待用。

汉麻花cDNA获取：汉麻叶片的cDNA获取使用北京全式金生物技术公司的TransScript® All-in-One反转录试剂盒，反应结束后置于-20℃冰箱保存待用。

根据筛选所得THCSAS2基因的cDNA序列（如SEQ ID NO.1所示，1641bp；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）及特异性引物从汉麻Finola品种的cDNA中克隆了THCSAS2的cDNA片段，然后将基因片段与pEASY-T1克隆载体连接测序，从测序结果中选择与我们预测序列一致的克隆载体作为模板，PCR扩增去除N端的信号肽序列（去除N端的第1-29位氨基酸所组成的信号肽序列）的目的片段，再通过同源重组方法将目的片段克隆到载体的多克隆位点，将连接产物转化大肠杆菌DH10B菌株，并分离出一个正确序列的单克隆。THCAS2构建在pPIC9K载体上的图谱见图3，THCAS2构建在pEAQ-HT载体上的图谱见图4。基因克隆及质粒构建过程中涉及引物如下：

THCAS2 cDNA片段扩增引物：

THCAS2-F：5’-ATGAAGTACTACTCAACATTCTCCTTTAGG-3’,

THCAS2-R：5’-TTAATGACGTCGTGGCGGAAGAG-3’；

克隆带有与pPIC9K载体同源臂并去除N端的信号肽的扩增引物：

pPIC9K-THCAS2-F：5’-GAGAGGCTGAAGCTTACGTACATCATCATCATCATCACGAATTCAATCCTCAAGAAAATTTCCTA-3’，

pPIC9K-THCAS2-R：5’-CTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAATGACGTCGTGGCGGAAG-3’；

克隆带有与pEAQ-HT载体同源臂的扩增引物：

pEAQ-HT-THCAS2-F：

5’-CACCATCACCATCATCCCGGGATGAAGTACTACTCAACATTCTCC-3’，

pEAQ-HT-THCAS2-R：

5’-GAAACCAGAGTTAAAGGCCTCGAGTTAATGACGTCGTGGCGGAAG-3’。

实施例3、毕赤酵母表达系统构建

1、转化子的筛选鉴定

在毕赤酵母表达体系中，去除N端信号肽目的片段被克隆到pPIC9K（图3）载体的EcoRI和NotI位点，此外在EcoRI位点上游加入了6×His标签，载体上的AOX1 启动子可以被甲醇诱导启动表达。在质粒转化前，用SacI限制酶去线性化质粒来提高转化效率，经过电穿孔法处理后将质粒转入毕赤酵母GS115菌株中，置于1 mL 4 ℃的1 M山梨醇和1 mL 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）中，28 ℃静置培养2 h后，将细胞均匀涂布在MD（1.34% YNB，4×10-5% 生物素，2%葡萄糖和2% 琼脂）平板上。空载质粒pPIC9K也被转入毕赤酵母中作为阴性对照。通过菌落PCR方法对单克隆进行筛选鉴定。

pPIC9K载体上在毕赤酵母中具有遗传霉素（G418）的抗性，每有一个基因拷贝插入到毕赤酵母AOX1位点时，毕赤酵母转化子会提高约0.25 mg L⁻¹ 的遗传霉素抗性水平。因此，将连接转化的产物复苏后均匀涂布于MD（2% 葡萄糖，1.34% 酵母基础氮源培养基YNB,4×10^-5%生物素,2% 琼脂)平板上，经过三轮的连续接种培养（挑取单克隆培养至饱和菌液，之后的每次取上一次10 μL菌液接种与1ml MD液体培养基中），最终在MD液体培养基中培养得到OD₆₀₀=2.0的转化子。分别吸取5μL菌液接种到不同浓度（G418含量分别为 0.25 μg mL^-1，0.5 μg mL^-1，0.75 μg mL^-1，1 μg mL^-1）的YEB平板上，28°培养3-5天，最终筛选出能够在含有G-418 0.75 μg mL^-1YPD平板上生长的单克隆。将单菌落重悬在20 µL的PCR lysisbuffer中，样品在90 ℃下加热15 min，取1 µL作为PCR模板，通过PCR和一代测序反应筛选鉴定成功插入目的片段至AOX1启动子和AOX1终止子之间的阳性转化子。

2、毕赤酵母中目的蛋白表达和纯化

将验证正确的阳性转化子单菌落接种至20 mL BMGY（1% 酵母提取物、2% 胰蛋白胨、100 mM 磷酸钾缓冲液、1.34% YNB、4×10-5% 生物素和1% 甘油），在28 °C，220 rpm下培养12小时，获得饱和培养细胞液。取1% 饱和培养细胞液接种至50 mL BMGY培养基中，于28 °C环境中培养至OD值为约1.5。在2500 g下离心10 min收集细胞，用100 mL BMMY （1%酵母提取物，2% 胰蛋白胨，100 mM 磷酸二氢钾，1.34% YNB，4×10-5% 生物素，0.5% 甲醇）培养基重悬细胞沉淀，并在20 ℃，180 rpm下孵育6天。每天取1 mL培养物用作WesternBlotting分析，每次在剩余的培养物中加入500 µL甲醇，以作为碳源。

在4 °C，5500 g下离心 10 min来沉淀细胞杂质，收集上清液中的粗酶。在上清液中加入0 ℃硫酸铵至80%饱和度，于4 °C下5500 g，离心 30 min来沉淀粗酶。去除上清，用100 mM pH5.0柠檬酸盐缓冲液重悬粗酶。

在粗酶溶液中加入2 mL Ni-NTA树脂，充分混匀后转移至重力柱，于4 ℃中孵育1小时。用10倍体积的冲洗液（100 mM pH6.0柠檬酸钠，150 mM 氯化钠和250 mM 咪唑）冲洗重力柱。漂洗后的蛋白质通过3倍体积的溶解液溶解（100 mM pH6.0 柠檬酸钠， 150 mM氯化钠， 250 mM咪唑和20% （v/v）甘油），用30000 kDa的蛋白截留器浓缩洗脱液，获得THCSAS2基因编码产物萜烯酚酸氧化环化酶粗酶液。

实施例4、THCAS2体外酶促反应

体外酶反应体系由 100 μM CBGA、0.1% （w/v） Triton X-100 、10 μM FAD，加入粗酶至总体积为 200 μL，将混合物在 37 °C 下孵育 24 小时。用两倍反应体积的乙酸乙酯萃取三次，然后将液体旋转蒸干。用50 μL质谱级甲醇重悬蒸干产物，进行UPLC-MS分析。纯化酶产物的浓度通过BCA法测定。

UPLC-MS/MS分析是通过使用Waters Acquity H-Class 超高效液相系统和Waters Vion IMS Qtof 质谱，ESI（electrospray ionization）负离子模式下测定。体外酶反应样品进样5 μL用于液相质谱分析，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC Shield RP18（2.1*50 mm，1.7 μm）。液相分离采用通过二元溶剂系统（组分A：0.1% 甲酸的甲醇溶液；组分B：0.1%甲酸的超纯水溶液）来分离。液相梯度条件如下：0-3 min，50% A到80% A，3-14 min80% A到100% A，并维持1分钟。15-17 min 100% A 到50% A，50% B维持3分钟至 20 min。色谱柱温度设置为40 ℃，毛细管电压设置为2.80 kV，锥体气体流速为50 L h^-1，脱溶剂气流速为600 L h^-1，离子源温度为120 ℃，脱溶剂温度为380 ℃。质谱扫描模式为MSMS，扫描时间为0.1秒，碰撞能量为25 kV。CBDA、THCA和CBCA前体的分子质量为357.20，CBGA前体分子质量为359.17。

THCAS2体外酶促反应UPLC-MSMS分析结果如图 5所示。图5结果表明THCAS2蛋白酶具有将CBGA底物转化为CBDA,THCA和CBCA的功能。

实施例4、烟草瞬时转化表达

在烟草表达体系中，目的片段完整的ORF被克隆到了pEAQ-HT（图4）载体的SmaI和XhoI位点，载体上的CaMV 35S启动子驱动目的基因在烟草中瞬时表达。采用液氮转化法将质粒转化到农杆菌GV3101菌株中，将细胞均匀涂布于含有卡那霉素（50 μg L⁻¹）、利福平（50μg L⁻¹）和庆大霉素（25 μg L⁻¹）的LB（5gL⁻¹ 酵母提取物，10gL⁻¹ 胰蛋白胨，10gL⁻¹NaCl）平板，通过PCR的方法筛选CaMV 35S promoter和NOS termintor之间的插入序列。空载质粒pEAQ-HT也被转入农杆菌GV3101菌株中作为阴性对照。

将表达质粒转染至农杆菌GV3101后于三抗（50 μg L⁻¹卡那霉素、25 μg L⁻¹利福平、25 μg L⁻¹庆大霉素）LB培养基28 °C，220 rpm培养16 小时。2500 g离心10 min后弃上清，用转染液（10 mM 吗啉乙磺酸、10 mM MgCl₂ 和 100 μM 乙酰丁香酮）重悬至OD₆₀₀为0.6的终浓度，置于室温静置孵育2-3小时。在酶转染液中加入10 μmol CBGA底物后用过2mL注射器注射至5周龄的健康烟草第5-7片叶叶片背面的远轴处，缓慢注射至整片叶。注射后的植株经暗处理2小时后置于温室环境培养。THCAS2基因在烟草瞬时转化后对烟草叶片进行UPLC-MSMS分析，结果如图6所示。结果表明：THCAS2外源基因在烟草叶肉细胞中表达，表达产物能将CBGA底物转化为CBDA,THCA和CBCA。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种汉麻THCSAS2基因及其编码产物萜烯酚酸氧化环化酶与应用

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

atgaagtact actcaacatt ctcctttagg tttgtttaca aaattatatt tttctttctc 60

tcattcaata tcaaaatttc aatagctaat cctcaagaaa atttcctaaa ttgcttctcc 120

caatatattc ataacaatcc agcaaatcta aaactcgtat acactcaaca cgaccaattg 180

tatatgtctg tcctgaattt gacaatacaa aatcttagat ttacctctga tacaacccca 240

aaaccactcg ttattgtcac tccttcaaat gtctcccata tccaagccac tattctatgc 300

tccaagaaag ttggcttgca gattcgaact cgaagcggtg gccatgatgc tgagggtttg 360

tcctacacat ctcaagtccc atttgttata gtagacttga gaaacatgca ttcggtgaaa 420

atagatattc gtagccaaac tgcgtgggtt gaagccggag ctacccttgg agaagtttat 480

tattggatta atgagaagaa tgagaatctt agttttcctg gtgggtattg ccctactgtt 540

ggcgtaggtg gacactttag tggaggaggc tatggagcat taatgcgaaa ttatggcctc 600

gcagctgata atatcattga tgcacactta gtcaatgttg atggaaaagt tctagatcga 660

aaatccatgg gggaagatct attttgggct atacgtggtg gtggaggtga aaactttgga 720

atcattgcag cgtggaaaat tagactggtt gctgtcccat caagggctac tatattcagt 780

gttaaaagga atatggagat acatgggctt gtcaagttat ttaacaaatg gcaaaatatt 840

gcttacaagt atgacaaaga tttattactc atgactcact tcataaccag gaatattata 900

gataatcaag gaaagaataa gactacagta cacggttact tctcttgcat tttccatggt 960

ggagtggata gtctagtcaa cttgatgaac aagagctttc ctgagttggg tattaaaaaa 1020

actgattgca aagaattgag ctggattgat actaccatct tctacagtgg tgttgtaaat 1080

tataacacta ctaattttca aaaggaaatt ttgcttgata gatcagctgg gcagaaagta 1140

gctttctcaa ttaagttaga ctacgttaag aaaccaattc cagaaactgc aattgtcaaa 1200

attttggaga aattgtatga agaagatgta ggagttggag tgtatgtatt gtacccttac 1260

ggtggtataa tggacaagat ctcagaatca acaattcctt tccctcatcg agctggaatc 1320

atgtacgaag tttggtacgc agctacctgg gagaagcaag aagataatga aaagcatata 1380

aactgggttc gaagtgttta taatttcatg acgccttatg tgtcccaaaa tccaagaatg 1440

gcgtatctca attataggga ccttgattta ggaaaaactg atcccaagag tcctaataat 1500

tacacccaag cacgtatctg gggtgaaaag tactttggta aaaactttga caagttagtt 1560

aaggtgaaaa ccaaagttga tcccaataat ttttttagaa acgagcaaag catcccacct 1620

cttccgccac gacgtcatta a 1641

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

Met Lys Tyr Tyr Ser Thr Phe Ser Phe Arg Phe Val Tyr Lys Ile Ile

1 5 10 15

Phe Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Lys Ile Ser Ile Ala Asn Pro Gln

20 25 30

Glu Asn Phe Leu Asn Cys Phe Ser Gln Tyr Ile His Asn Asn Pro Ala

35 40 45

Asn Leu Lys Leu Val Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val

50 55 60

Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp Thr Thr Pro

65 70 75 80

Lys Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser Asn Val Ser His Ile Gln Ala

85 90 95

Thr Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg Thr Arg Ser

100 105 110

Gly Gly His Asp Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Thr Ser Gln Val Pro Phe

115 120 125

Val Ile Val Asp Leu Arg Asn Met His Ser Val Lys Ile Asp Ile Arg

130 135 140

Ser Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr

145 150 155 160

Tyr Trp Ile Asn Glu Lys Asn Glu Asn Leu Ser Phe Pro Gly Gly Tyr

165 170 175

Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly

180 185 190

Ala Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Ile Asp Ala

195 200 205

His Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly

210 215 220

Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asn Phe Gly

225 230 235 240

Ile Ile Ala Ala Trp Lys Ile Arg Leu Val Ala Val Pro Ser Arg Ala

245 250 255

Thr Ile Phe Ser Val Lys Arg Asn Met Glu Ile His Gly Leu Val Lys

260 265 270

Leu Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu

275 280 285

Leu Leu Met Thr His Phe Ile Thr Arg Asn Ile Ile Asp Asn Gln Gly

290 295 300

Lys Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Cys Ile Phe His Gly

305 310 315 320

Gly Val Asp Ser Leu Val Asn Leu Met Asn Lys Ser Phe Pro Glu Leu

325 330 335

Gly Ile Lys Lys Thr Asp Cys Lys Glu Leu Ser Trp Ile Asp Thr Thr

340 345 350

Ile Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Tyr Asn Thr Thr Asn Phe Gln Lys

355 360 365

Glu Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Gln Lys Val Ala Phe Ser Ile

370 375 380

Lys Leu Asp Tyr Val Lys Lys Pro Ile Pro Glu Thr Ala Ile Val Lys

385 390 395 400

Ile Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Asp Val Gly Val Gly Val Tyr Val

405 410 415

Leu Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Asp Lys Ile Ser Glu Ser Thr Ile

420 425 430

Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Met Tyr Glu Val Trp Tyr Ala Ala

435 440 445

Thr Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Ile Asn Trp Val Arg

450 455 460

Ser Val Tyr Asn Phe Met Thr Pro Tyr Val Ser Gln Asn Pro Arg Met

465 470 475 480

Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Lys Thr Asp Pro Lys

485 490 495

Ser Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu Lys Tyr Phe

500 505 510

Gly Lys Asn Phe Asp Lys Leu Val Lys Val Lys Thr Lys Val Asp Pro

515 520 525

Asn Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro Pro Arg

530 535 540

Arg His

545

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> THCAS2-F

<400> 3

atgaagtact actcaacatt ctcctttagg 30

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> THCAS2-R

<400> 4

ttaatgacgt cgtggcggaa gag 23

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> pPIC9K-THCAS2-F

<400> 5

gagaggctga agcttacgta catcatcatc atcatcacga attcaatcct caagaaaatt 60

tccta 65

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> pPIC9K-THCAS2-R

<400> 6

ctaaggcgaa ttaattcgcg gccgcttaat gacgtcgtgg cggaag 46

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> pEAQ-HT-THCAS2-F

<400> 7

caccatcacc atcatcccgg gatgaagtac tactcaacat tctcc 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> pEAQ-HT-THCAS2-R

<400> 8

gaaaccagag ttaaaggcct cgagttaatg acgtcgtggc ggaag 45

Claims

1.一种汉麻THCSAS2基因，其特征在于：所述汉麻THCSAS2基因的cDNA全长为1641bp，位于汉麻Finola 品种的6号染色体22244171-22245809核苷酸之间，具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种汉麻THCSAS2基因的编码产物萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2，其特征在于：所述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2由THCSAS2基因cDNA编码所得，由546个氨基酸残基组成，具有催化CBGA底物活性；具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述汉麻THCSAS2基因的克隆载体或表达载体。

4.一种含有权利要求1所述汉麻THCSAS2基因的转基因株系。

5.根据权利要求4所述的转基因株系，其特征在于：所述转基因株系包括重组转化所形成的转基因株系，以及由此产生的外源基因表达产物。

6.权利要求1所述汉麻THCSAS2基因在汉麻育种中的应用。

7.权利要求2所述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2在生物工程的应用。

8.权利要求2所述萜烯酚酸氧化环化酶THCSAS2在萜烯酚酸衍生物生物合成中的应用。