CN109943575B - 黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的基因克隆、载体构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芩花青素转录调控因子，其包括SbMYB75基因和SbDEL基因中的至少一种，其中，所述SbMYB75基因序列如SEQ ID No.1所示，所述SbDEL基因序列如SEQ ID No.3所示，并提供了扩增上述基因的引物组合物，以及由该基因编码的蛋白，以及由上述基因构建的重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系或转基因植物组织及其应用。本发明利用黄芩花青素转录因子SbMYB75和SbDEL及其构建的重组载体来提高转基因细胞系的花青素产量。本发明首次从黄芩中克隆到花青素转录因子SbMYB75和SbDEL及其编码的蛋白，并通过基因工程和细胞工程得到高花青素含量的转基因细胞系，为工业上提高花青素产量打下了坚实的基础。

Description

黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的基因克隆、载体 构建及其应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及黄芩花青素转录因子SbMYB75和SbDEL基因序列及其构建的载体和应用。

背景技术

花青素是一大类黄酮的总称，不仅构成了自然界的缤纷色彩，更因其具有强抗氧化性，被广泛应用于食品领域，尤其是保健品，市场需求日益增长，具有巨大的经济价值和市场前景。

MYB家族和bHLH家族都是调控黄酮类物质合成的转录因子家族，一些转录因子能在胞内或者体外促进花青素合成，提高花青素产量。

黄芩是一种在我国使用已达数千年的药用植物，为唇形科多年生草本植物；其主要应用于治疗上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾等症。现代医学表明，黄芩中主要活性成分为其根中大量积累的黄酮物质，其MYB家族和bHLH家族对黄酮类物质的调控具有显著作用，但是目前对此的相关研究还不多。

近年来，利用基因工程和细胞工程等现代生物技术手段对各种宿主细胞进行改造来高产花青素的研究越来越多，但是，利用黄芩MYB家族和bHLH家族提高各种宿主细胞和转基因细胞系花青素含量的方法尚未报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供两条黄芩花青素转录因子，克隆该黄芩花青素转录因子，转化上述基因均可以有效提高转基因细胞系花青素含量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种黄芩花青素转录调控因子，其包括SbMYB75基因和SbDEL基因中的至少一种，其中，所述SbMYB75基因序列如SEQ ID No.1所示，所述SbDEL基因序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种用于扩增上述黄芩花青素转录调控因子的引物组合物。

进一步地，用于扩增SbMYB75基因的引物包括如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示序列，用于扩增SbDEL基因的引物包括如SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示序列。

进一步地，所述用于扩增SbMYB75基因的引物具有Gateway重组位点，所述用于扩增SbDEL基因的引物具有酶切位点保护碱基或融合PCR位点。更进一步地，SEQ ID No.7所示序列的引物具有酶切位点保护碱基，SEQ ID No.7所示序列的引物具有融合PCR位点。

本发明的第三个目的是提供一种由由上述黄芩花青素转录调控因子编码的蛋白。

进一步地，由SbMYB75基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示，由SbDEL基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的第四个目的是提供一种由上述黄芩花青素转录调控因子构建的重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系、转基因植物组织或转基因植物。

进一步地，所述重组载体包括pDonar207-SbMYB75载体、SbMYB75基因的植物表达载体(载体是pK7WG2R)、CaMV35S-SbDEL融合片段、SbDEL基因的植物表达载体(载体是pK7WG2R)、双元植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL中的至少一种。

进一步地，所述重组微生物包括含有SbMYB75的表达载体的农杆菌、含有SbDEL的表达载体的农杆菌、含有SbMYB75和SbDEL的双元表达载体的农杆菌，含有SbMYB75、SbDEL的表达载体的大肠杆菌；具体地，该农杆菌具体为发根农杆菌A4，该大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。

进一步地，所述转基因细胞系中采用植物底盘细胞，具体为胡萝卜底盘细胞；所述转基因植物组织为转基因胡萝卜发根。

本发明的第五个目的是一种上述黄芩花青素转录调控因子，或上述重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系、转基因植物组织或转基因植物在合成花青素中的应用。

进一步地，在所述应用中，构建合成花青素的生物材料的方法包括如下步骤：

(1)扩增如SEQ ID No.1所示序列的SbMYB75基因和/或如SEQ ID No.3所示序列的SbDEL基因；

(2)利用扩增产物构建含SbMYB75基因和/或SbDEL基因的植物过表达载体，转化微生物，获得含SbMYB75基因和/或SbDEL基因的重组微生物；

(3)利用重组微生物转化植物细胞，获得含SbMYB75基因和/或SbDEL基因的转基因细胞系，并培养以获得转基因植物组织。

进一步地，在所述构建合成花青素的生物材料的方法中，还采用用于扩增CaMV35S的引物，其包括SEQ ID No.9～SEQ ID No.10所示序列，用于扩增CaMV35S的引物具有酶切位点保护碱基或融合PCR位点；具体地，SEQ ID No.9所示序列的引物具有酶切位点保护碱基，SEQ ID No.10所示序列的引物具有融合PCR位点。

进一步地，所述构建合成花青素的生物材料的方法还包括步骤：测定转基因植物组织中的SbMYB75基因和/或SbDEL基因表达量和总花青素含量；其中，在测定基因表达量中，采用用于扩增SbMYB75基因的如SEQ ID No.11～SEQ ID No.12所示序列的引物，用于扩增SbDEL基因的如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示序列的引物。

更进一步地，构建合成花青素的生物材料的方法包括如下步骤：

(1)克隆黄芩花青素转录因子家族MYB家族基因SbMYB75和bHLH家族基因SbDEL；

(2)构建含SbMYB75的植物过表达载体及同时含SbMYB75和SbDEL的双元植物过表达载体，转化发根农杆菌，获得可用于转化植物底盘细胞的含SbMYB75及同时含SbMYB75和SbDEL的发根农杆菌菌株；

(3)利用所构建的发根农杆菌菌株转化植物底盘细胞，经红色荧光蛋白检测和PCR验证获得转基因细胞系，液体培养45天后，对转基因胡萝卜发根的SbMYB75和SbDEL基因的表达量及总花青素含量进行测定。

进一步地，SbMYB75植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

一、SbMYB75基因的克隆：以黄芩根为材料，提取黄芩根部的总RNA，反转录得到黄芩根部的cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为引物进行扩增反应，获得SbMYB75基因。

二、构建pDonar207-SbMYB75载体：回收步骤一中的PCR产物，以进行BP反应，将反应产物转入大肠杆菌，根据测序结果提取得到质粒pDonar207-SbMYB75。

三、构建SbMYB75基因的植物过表达载体：SbMYB75所用的植物表达载体是pK7WG2R，将步骤二中经BP反应得到的质粒测定浓度后，进行LR反应，将反应产物转入大肠杆菌，进行菌落PCR验证，得到的阳性克隆提取质粒，即SbMYB75的植物过表达载体pK7WG2R-SbMYB75。

进一步地，含有SbMYB75和SbDEL的双元植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：。

A、SbDEL和CaMV35S的克隆：以黄芩根为材料，提取黄芩根部的总RNA，反转录得到黄芩根部的cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列为引物进行扩增反应，获得SbDEL基因；以pK7WG2R为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列为引物进行扩增反应，获得CaMV35S启动子序列；

B、构建pMD19-T-SbDEL和pMD19-T-CaMV35S载体：回收PCR产物，与pMD19-T sample载体用T4DNA连接酶连接，将反应产物转入大肠杆菌，根据测序结果提取得到质粒pMD19-T-SbDEL和pMD19-T-CaMV35S。

C、构建CaMV35S-SbDEL融合片段：分别以pMD19-T-SbDEL和pMD19-T-CaMV35S为模板，并分别以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列为引物进行扩增反应，回收扩增产物并进行融合PCR反应，得到CaMV35S-SbDEL融合片段。

D、构建双元植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL：将CaMV35S-SbDEL融合片段和pK7WG2R-SbMYB75分别进行双酶切，利用酶切产物进行连接反应，将反应产物转入大肠杆菌，根据测序结果提取质粒得到双元植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL。

本发明中涉及的基因、蛋白及引物的序列如下所示：

表1核苷酸或氨基酸序列表

注：表中SbMYB75-F和SbMYB75-R加下划线的序列为Gateway重组位点，SbDEL-F和CaMV35S-R加下划线的序列为融合PCR位点，SbDEL-R和CaMV35S-F加下划线的序列为酶切位点保护碱基。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用黄芩花青素转录因子SbMYB75和SbDEL及其构建的重组载体来提高转基因细胞系的花青素产量。本发明首次从黄芩中克隆到花青素转录因子SbMYB75和SbDEL及其编码的蛋白，并通过基因工程和细胞工程得到高花青素含量的转基因细胞系，为工业上提高花青素产量打下了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明一实施例中转基因胡萝卜发根固体培养图；其中，a为空载体转基因胡萝卜发根，b为转入SbMYB75的转基因胡萝卜发根，c为同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根；

图2为本发明一实施例中转基因胡萝卜发根液体培养图；其中，a为空载体转基因胡萝卜发根，b为转入SbMYB75的转基因胡萝卜发根，c为同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根

图3为本发明一实施例中转基因胡萝卜发根荧光实时定量PCR检测结果图；其中，a为转基因胡萝卜发根SbMYB75基因的表达量，b为转基因胡萝卜发根SbDEL基因的表达量，内参基因为DcActin。

图4为本发明一实施例中转基因胡萝卜发根的花青素含量结果图，

具体实施方式

本发明提供了一种黄芩花青素转录调控因子，其包括SbMYB75基因和SbDEL基因中的至少一种，其中，所述SbMYB75基因序列如SEQ ID No.1所示，所述SbDEL基因序列如SEQID No.3所示，并提供了扩增上述基因的引物组合物，以及由该基因编码的蛋白，以及含有上述基因的重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系或转基因植物组织及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的各种试剂盒、酶均购于天根生化科技有限公司、ThermoFisher公司、NEB公司和Takara公司，质粒pK7WG2R购于Thermo Fisher公司，质粒pDoner207购于Thermo Fisher公司，pMD19-T sample载体和T4连接酶混合液购于Takara公司。

实施例1

本实施例为SbMYB75的克隆及构建相应植物表达载体。

(1)SbMYB75基因引物设计和合成

首先对黄芩转录组进行深度测序，然后利用拟南芥PAP1基因的蛋白质序列在黄芩转录组数据库中进行比对，以拟南芥和唇形科植物已报道过的近缘物种相关序列为标准，选取部分编码蛋白相似度>60％的序列，得到黄芩中的相关基因序列，利用primerpremier5.0设计引物全长引物，并在引物加上了Gateway重组位点(Gateway重组位点用下划线表示)。

SbMYB75-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAAAAGAAAGGTGAAGTAAAGAG(SEQ ID No.5)；

SbMYB75-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTAACTCGAATAGGGACCTATGAG(SEQID No.6)；

引物由上海生工合成。

(2)SbMYB75的克隆

以黄芩根为材料，按照RNA提取试剂盒的说明书提取黄芩根部的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录得到黄芩根部的cDNA。

以cDNA为模板，以SbMYB75-F和SbMYB75-R为引物进行扩增反应，获得SbMYB75基因。

PCR反应体系：cDNA 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，phusion HF buffer 10μL，10mM dNTP mix 1μL，phusion enzyme 0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)53℃或55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

PCR反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得了864bp的SbMYB75。

(3)构建pDonar207-SbMYB75载体

将步骤(2)中的PCR产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度。

之后利用SbMYB75的回收产物进行BP反应。BP反应：PCR产物100-200ng(3μL)，pDonar207 100ng(1μL)，1×TE 0.5μL，BP Clonase酶0.5μL；25℃温育5h，加入0.5μL蛋白酶K 37℃温育10min，终止BP反应。

将反应产物转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有40mg/L的庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养12h。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证并将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pDonar207-SbMYB75。

(4)构建SbMYB75基因的植物过表达载体。

SbMYB75所用的植物表达载体是pK7WG2R。将(3)中的经BP反应得到的质粒测定浓度后，进行LR反应。LR反应：pDonar207-SbMYB75 100-200ng(3μL)，pK7WG2R 100ng(1μL)，1×TE 0.5μL，LR Clonase酶0.5μL；25℃温育5h，加入0.5μL蛋白酶K 37℃温育10min，终止LR反应。

将反应产物转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有50mg/L的壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养12h。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证，得到的阳性克隆提取质粒即得到含有SbMYB75的植物过表达载体pK7WG2R-SbMYB75。

实施例2

本实施例为SbDEL的克隆及同时含有SbMYB75和SbDEL的双元植物表达载体的构建。

(1)SbDEL基因和CaMV35S启动子引物设计和合成

首先对黄芩转录组进行深度测序，然后利用金鱼草DEL基因的蛋白质序列在黄芩转录组数据库中进行比对，以拟南芥和唇形科植物已报道过的近缘物种相关序列为标准，选取部分编码蛋白相似度>60％的序列，得到黄芩中的相关基因序列，利用primerpremier5.0设计引物全长引物，并在在SbDEL的上游引物前引入CaMV35S启动子末端序列，在下游引物前引入RsrII限制性酶切位点和保护碱基。

以pK7WG2R为模板，采用primer premier 5.0软件，设计启动子CaMV35S全长，上游引物前引入XhoI限制性酶切位点和保护碱基，在下游引物前引入SbDEL的5’序列。

SbDEL-F：CAATTTACTATTCTAGTCGACCTGCAATGGGGAGTGCAAAGCAAAAGC(SEQ IDNo.7)；

SbDEL-R：CCCGGGCGGTCCGTCATCTCTTTTTGATGACTTTCTGAAGTGC(SEQ ID No.8)；

CaMV35S-F：GGGCCCCTCGAGGAGAAGATTAGCCTCTTCAATTTC(SEQ ID No.9)；

CaMV35S-R：GCTTTTGCTTTGCACTCCCCATTGCAGGTCGACTAGAATAGTAAATTG(SEQ IDNo.10).

引物由上海生工合成。

(2)SbDEL和CaMV35S的克隆及测序

以黄芩根为材料，按照RNA提取试剂盒的说明书提取黄芩根部的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录得到黄芩根部的cDNA。

以cDNA为模板，以SbDEL-F和SbDEL-R为引物进行扩增反应，获得SbDEL基因。以pK7WG2R为模板，分别以CaMV35S-F和CaMV35S-R为引物进行扩增反应，获得CaMV35S启动子序列。

PCR反应体系：cDNA 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，phusion HF buffer 10μL，10mM dNTP mix 1μL，phusion enzyme 0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)53℃或55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

PCR反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得了1875bp的SbDEL和749bp的CaMV35S。

将上述PCR产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度。

之后利用回收产物与pMD19-T sample载体用T4DNA连接酶连接，反应体系为：PCR产物100-200ng(1μL)，pMD19-T sample 50ng(1μL)，T4DNA连接酶混合液5μL，16℃连接3h。将反应产物转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有100mg/L的氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养12h后置于4℃中培养10～20min，挑选白色菌落进行菌落PCR检测并将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pMD19-T-SbDEL和pMD19-T-CaMV35S。

(3)构建CaMV35S-SbDEL融合片段

分别以pMD19-T-SbDEL和pMD19-T-CaMV35S为模板，并分别以SbDEL-F和SbDEL-R、CaMV35S-F和CaMV35S-R为引物进行扩增反应，PCR反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度。

PCR反应体系：cDNA 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，phusion HF buffer 10μL，10mM dNTP mix 1μL，phusion enzyme 0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)53℃或55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

利用上述得到的回收产物进行融合PCR反应，反应分为两步，第一步为：CaMV35S50ng(1μL)和SbDEL 50ng(1μL)，10mM dNTP mix 0.5μL，phusion HF buffer 5μL，phusionenzyme 0.25μL，ddH₂O 17.25μL。

PCR的设定程序是：1)98℃，5min；2)98℃，20s；3)55℃，20s；4)72℃，2min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数10个。

第二步为：第一步的反应产物(25μL)，CaMV35S-F 2.5μL，SbDEL-R 2.5μL，10mMdNTP 0.5μL，5×HF buffer 5μL，phusion enzyme 0.25μL，ddH₂O 14.25μL。

PCR的设定程序是：1)98℃，5min；2)98℃，20s；3)55℃，20s；4)72℃，2min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

PCR反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度，得到CaMV35S-SbDEL融合片段。

(4)构建双元植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL

将CaMV35S-SbDEL融合片段和pK7WG2R-SbMYB75分别用XhoI酶和RsrII酶进行双酶切，酶切体系为：载体或PCR产物1μg，10×CutSmart Buffer 5μL，XhoI enzyme 1μL，RsrIIenzyme 1μL，ddH₂O补足至50μL，37℃温育1h，65℃温育20min停止反应。

对产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度。

利用上述酶切产物进行连接反应，反应体系为：pK7WG2R–SbMYB75酶切产物50ng(1μL)，CaMV35S-SbDEL酶切产物150ng(1μL)，T4DNA ligase1μL，ddH2O补足至20μL，25℃温育10min。将反应产物转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有50mg/L的壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养12h。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证并将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，双元植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL。

实施例3

本实施例为利用外源植物胡萝卜得到含有SbMYB75、SbMYB75和SbDEL的转基因细胞系。

采用电击法，分别将植物表达载体pK7WG2R-SbMYB75和pK7WG2R-SbMYB75-SbDEL转入发根农杆菌A4中，分别获得含有SbMYB75的表达载体和同时含有SbMYB75和SbDEL的双元表达载体的发根农杆菌菌株，同时将含有CaMV 35S启动子的空质粒转入菌株作为阴性对照。

将胡萝卜种子常规表面灭菌后，置于MS培养基中，于25℃下光照培养。培养30天后，即可获得无菌胡萝卜组培苗。通过侵染叶脉的方法转化胡萝卜，并将侵染过的叶片置于含有50mM乙酰丁香酮(AS)的MS固体培养基上，25℃暗培养48-72h后，将其转移至含有400mg/L头孢霉素(cef)的MS固体培养基上，待其长出发根后，通过荧光显微镜观察是否有红色荧光来初步判断是否为阳性并进行PCR验证(图1)。

液体培养上述得到的转基因胡萝卜发根(图2)，25℃100rpm培养40天。

实施例4

本实施例为转基因胡萝卜发根的相关基因表达量和总花青素含量的测定。

(1)转基因胡萝卜发根的相关基因表达量的测定

利用天根植物RNA提取试剂盒提取上述转基因胡萝卜发根的总RNA，然后用Invitrogen反转录试剂盒将其合成cDNA，并稀释到合适的浓度。

利用primer 3分别设计SbMYB75和SbDEL的荧光实时定量PCR引物引物分别命名为：qSbMYB75-F，qSbMYB75-R；qSbDEL-F，qSbDEL-R。

引物序列：

qSbMYB75-F：AAATCCCAAGAGCAACAACG(SEQ ID No.11)；

qSbMYB75-R：GATCCTGGTCGGAGAACAAA(SEQ ID No.12)；

qSbDEL-F：AGTGAGCCACAATGAGCTCAACTG(SEQ ID No.13)；

qSbDEL-R：GAAGCCTCCACATCGATGCCTTGT(SEQ ID No.14)；

用上述qPCR的引物检测转基因胡萝卜发根的相关基因表达量，内参为DcActin，PCR反应体系为：cDNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBR Premix Ex Taq(2×)5μL，ddH₂O 2μL。

PCR的设定程序是：1)95℃，30s；2)95℃，5s；3)60℃，30s；4)72℃，30s；循环从2)到4)，循环数40个。

结果如图3所示。结果表明，SbMYB75在转入SbMYB75的转基因胡萝卜发根和同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根中和对照组相比均显著提高；SbDEL在同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根中和对照组相比显著提高。

(2)转基因胡萝卜发根的总花青素含量的测定

以矢车菊素cyanidin作为外标物绘制总花青素浓度标准曲线，吸收波长为530nm。

待实施例3中的转基因胡萝卜发根长满培养瓶后，将其冻干并磨碎，利用酸化甲醇提取发根干粉的总花青素，并测定A530。结果如图4所示。

结果表明，转入SbMYB75的转基因胡萝卜发根和同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根的总花青素含量均显著高于对照组，其中同时转入SbMYB75和SbDEL的转基因胡萝卜发根的总花青素含量显著高于转入SbMYB75的转基因胡萝卜发根。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海辰山植物园

<120> 黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的基因克隆、载体构建及其应用

<130> IPI190509

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> SbMYB75基因(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaaga aaggtgaagt aaagagaggt gcttggacaa aagaggaaga tactcttttg 60

aggatttgca ttgaaaaatt tggagaagga aagtggcaca aggttcctat aagagctgga 120

ttgaacagat gcagaaagag ttgcaggttg agatggatga actatctcag accaaatatc 180

aagagaggtt acttcacaaa agatgaggtg gatctcattc aacgccttca taaattgtta 240

ggaaacagat ggtcattgat tgcgggtaga ttgcctggaa gaactgcaaa cgatgtgaag 300

aacttttgga acacatacat taatggcaag aggactccac aattgggttt gggggaaagt 360

tcgaaggtga aaacaatcac taaaaccaac atcatacgac cccgtcctcg gaccttctcc 420

gaagggcttg gatcctctaa gaacacaaca acgagtaatg tgcacaacag aagatccaaa 480

tcctcctcat cggaattaca aataacacgt tcggggtcga gtgaatccct aaaactcatg 540

agtgttagcc ctagtgatga aaatcccaag agcaacaacg catcttcatg tgcgttgtca 600

cccgaagatc ccaagagcat gaatcaatct tcaccatcgg atgagaaagt cgatgagtgt 660

gtgcagtggt ggagcaactt gctagatatt acggaaaatg gtggaggggc ctcgattttg 720

ttctccgacc aggatccggt gtcaatggac ctgatggcca tgccggagat cggggatagt 780

ggaagtgacg acgccattga agatggcatg tgtagtttat caccggatga tatttgggaa 840

ctcataggtc cctattcgag ttaa 864

<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 由SbMYB75编码的蛋白质(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Lys Lys Gly Glu Val Lys Arg Gly Ala Trp Thr Lys Glu Glu

1 5 10 15

Asp Thr Leu Leu Arg Ile Cys Ile Glu Lys Phe Gly Glu Gly Lys Trp

20 25 30

His Lys Val Pro Ile Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys

35 40 45

Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly Tyr

50 55 60

Phe Thr Lys Asp Glu Val Asp Leu Ile Gln Arg Leu His Lys Leu Leu

65 70 75 80

Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ala

85 90 95

Asn Asp Val Lys Asn Phe Trp Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Lys Arg Thr

100 105 110

Pro Gln Leu Gly Leu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Thr Ile Thr Lys

115 120 125

Thr Asn Ile Ile Arg Pro Arg Pro Arg Thr Phe Ser Glu Gly Leu Gly

130 135 140

Ser Ser Lys Asn Thr Thr Thr Ser Asn Val His Asn Arg Arg Ser Lys

145 150 155 160

Ser Ser Ser Ser Glu Leu Gln Ile Thr Arg Ser Gly Ser Ser Glu Ser

165 170 175

Leu Lys Leu Met Ser Val Ser Pro Ser Asp Glu Asn Pro Lys Ser Asn

180 185 190

Asn Ala Ser Ser Cys Ala Leu Ser Pro Glu Asp Pro Lys Ser Met Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Pro Ser Asp Glu Lys Val Asp Glu Cys Val Gln Trp Trp

210 215 220

Ser Asn Leu Leu Asp Ile Thr Glu Asn Gly Gly Gly Ala Ser Ile Leu

225 230 235 240

Phe Ser Asp Gln Asp Pro Val Ser Met Asp Leu Met Ala Met Pro Glu

245 250 255

Ile Gly Asp Ser Gly Ser Asp Asp Ala Ile Glu Asp Gly Met Cys Ser

260 265 270

Leu Ser Pro Asp Asp Ile Trp Glu Leu Ile Gly Pro Tyr Ser Ser

275 280 285

<210> 3

<211> 1875

<212> DNA

<213> SbDEL基因(Artificial Sequence)

<400> 3

atggggagtg caaagcaaaa gcatgaggaa ttaaggatgc aacttgctct tgctgttaga 60

accattcaat ggagctatgc tatcttctgg tctccttcat ctacacaacc aggggcattg 120

gaatggggtg atgggttcta caatggtgat atcaaaacaa gaaaaacagt tcaggccaca 180

gagttgaaca tggatcagtt gggattgcaa aggagtgatc atctgagaga gctttatgag 240

tctctctcac ttggtgaaac taaccctcaa gctaaaaggc caactgctgc attatcccct 300

gaagatctca ctgatgcaga gtggtatttc ttagtttgca tgtcctttgt attcaatgcc 360

aaccaagggt ttcctggaaa ggcgttcgct agaaaccaga cgatgtggct gtgcaatgct 420

cattgcgctg acaccaaagt tttctctcgt tctttgctcg caaagagcgc atcaattcag 480

acaattgtgt gctttccgca tttaggaggt gtggtggagc ttggaacaac tgagctagtt 540

tcagaggatc cggatttgat tcagcatata aaaagttcgt tcctggagaa taatccttct 600

tcgactgtta ccaaggatcc tacctatgtg atcaacaata tagtgagcca caatgagctc 660

aactgtgaag tgcttgacca tcctcatatg cctgaaaatg gttgtgatca gcttttggat 720

ggtccaaaca tggatggcct ttgttctccc aacaattgct cggatgattt tgcagacaat 780

gtgctaagag aggaatcgaa tttggtacaa ggcatcgatg tggaggcttc tcaaattcaa 840

agctggccat ttatggatga tgctattagc aattgtcgaa acaattctat gaattccagt 900

gactgtatat ctcaaactca gggagaacct gagacgagag tcccactttc agatgcgatg 960

aaagaaacca acactcaaga ctgcattcag cagaaaggct cagggggtac tgcacaaggc 1020

gatgaggtcc attatcatag tgtactttcc aaccttttga agagttctca ccagttgatt 1080

ctgggcccat atatcagaaa cggcagcagg gaatcgagct ttgtttgctg gagaaaagat 1140

ggagccgtgg tgccccagag tggagcttca caaaagttgc tcaagaaact actttttgaa 1200

gctcctagga tgcatgaacg tagtaaggtt gcatctggta aaaataatgg caattccaag 1260

gcggaagttg atgaagttga tagaaaccat gtcttgtctg agaggaaacg aagagaaaaa 1320

ataaacgaga gatttgtgat tcttggatct ctagtcccat ctggtggcaa ggttgataaa 1380

gtatcaattc ttgatcatac aatagactac ttgagagagc tggagagaag agttgaagag 1440

ctggagtcgt ataaagaatc ttcgacgact cacagcaaat ctcatgatgc aattgagagg 1500

acctcagata attacggccc tagtaaaaat ggtcattcca agaagccatc gacaaacaag 1560

agaaaagctt gtgaaaagga tatgatagga gctgaaaata gcaagcttcg gttgagagat 1620

tcgtggacag atgatataac agtcagtgtt ttagataagg atgtgttgat tgagataaga 1680

tgttcttgca aggattatgc attgctccag gttatggaag tgctaaacaa gctgcgtttg 1740

gatacggaga cggttcaatc ctcaaccacc gatggaactc tttatgtgac tataaaagcc 1800

aagtgcaagg gattgaaagc agcatcagca cttgtgatca aacaggcact tcagaaagtc 1860

atcaaaaaga gatga 1875

<210> 4

<211> 624

<212> PRT

<213> 由SbDEL编码的蛋白质(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Ala Lys Gln Lys His Glu Glu Leu Arg Met Gln Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Val Arg Thr Ile Gln Trp Ser Tyr Ala Ile Phe Trp Ser Pro

20 25 30

Ser Ser Thr Gln Pro Gly Ala Leu Glu Trp Gly Asp Gly Phe Tyr Asn

35 40 45

Gly Asp Ile Lys Thr Arg Lys Thr Val Gln Ala Thr Glu Leu Asn Met

50 55 60

Asp Gln Leu Gly Leu Gln Arg Ser Asp His Leu Arg Glu Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Ser Leu Ser Leu Gly Glu Thr Asn Pro Gln Ala Lys Arg Pro Thr Ala

85 90 95

Ala Leu Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp Ala Glu Trp Tyr Phe Leu Val

100 105 110

Cys Met Ser Phe Val Phe Asn Ala Asn Gln Gly Phe Pro Gly Lys Ala

115 120 125

Phe Ala Arg Asn Gln Thr Met Trp Leu Cys Asn Ala His Cys Ala Asp

130 135 140

Thr Lys Val Phe Ser Arg Ser Leu Leu Ala Lys Ser Ala Ser Ile Gln

145 150 155 160

Thr Ile Val Cys Phe Pro His Leu Gly Gly Val Val Glu Leu Gly Thr

165 170 175

Thr Glu Leu Val Ser Glu Asp Pro Asp Leu Ile Gln His Ile Lys Ser

180 185 190

Ser Phe Leu Glu Asn Asn Pro Ser Ser Thr Val Thr Lys Asp Pro Thr

195 200 205

Tyr Val Ile Asn Asn Ile Val Ser His Asn Glu Leu Asn Cys Glu Val

210 215 220

Leu Asp His Pro His Met Pro Glu Asn Gly Cys Asp Gln Leu Leu Asp

225 230 235 240

Gly Pro Asn Met Asp Gly Leu Cys Ser Pro Asn Asn Cys Ser Asp Asp

245 250 255

Phe Ala Asp Asn Val Leu Arg Glu Glu Ser Asn Leu Val Gln Gly Ile

260 265 270

Asp Val Glu Ala Ser Gln Ile Gln Ser Trp Pro Phe Met Asp Asp Ala

275 280 285

Ile Ser Asn Cys Arg Asn Asn Ser Met Asn Ser Ser Asp Cys Ile Ser

290 295 300

Gln Thr Gln Gly Glu Pro Glu Thr Arg Val Pro Leu Ser Asp Ala Met

305 310 315 320

Lys Glu Thr Asn Thr Gln Asp Cys Ile Gln Gln Lys Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Thr Ala Gln Gly Asp Glu Val His Tyr His Ser Val Leu Ser Asn Leu

340 345 350

Leu Lys Ser Ser His Gln Leu Ile Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Asn Gly

355 360 365

Ser Arg Glu Ser Ser Phe Val Cys Trp Arg Lys Asp Gly Ala Val Val

370 375 380

Pro Gln Ser Gly Ala Ser Gln Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Phe Glu

385 390 395 400

Ala Pro Arg Met His Glu Arg Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Asn Asn

405 410 415

Gly Asn Ser Lys Ala Glu Val Asp Glu Val Asp Arg Asn His Val Leu

420 425 430

Ser Glu Arg Lys Arg Arg Glu Lys Ile Asn Glu Arg Phe Val Ile Leu

435 440 445

Gly Ser Leu Val Pro Ser Gly Gly Lys Val Asp Lys Val Ser Ile Leu

450 455 460

Asp His Thr Ile Asp Tyr Leu Arg Glu Leu Glu Arg Arg Val Glu Glu

465 470 475 480

Leu Glu Ser Tyr Lys Glu Ser Ser Thr Thr His Ser Lys Ser His Asp

485 490 495

Ala Ile Glu Arg Thr Ser Asp Asn Tyr Gly Pro Ser Lys Asn Gly His

500 505 510

Ser Lys Lys Pro Ser Thr Asn Lys Arg Lys Ala Cys Glu Lys Asp Met

515 520 525

Ile Gly Ala Glu Asn Ser Lys Leu Arg Leu Arg Asp Ser Trp Thr Asp

530 535 540

Asp Ile Thr Val Ser Val Leu Asp Lys Asp Val Leu Ile Glu Ile Arg

545 550 555 560

Cys Ser Cys Lys Asp Tyr Ala Leu Leu Gln Val Met Glu Val Leu Asn

565 570 575

Lys Leu Arg Leu Asp Thr Glu Thr Val Gln Ser Ser Thr Thr Asp Gly

580 585 590

Thr Leu Tyr Val Thr Ile Lys Ala Lys Cys Lys Gly Leu Lys Ala Ala

595 600 605

Ser Ala Leu Val Ile Lys Gln Ala Leu Gln Lys Val Ile Lys Lys Arg

610 615 620

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> SbMYB75- F(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggaaaag aaaggtgaag taaagag 57

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> SbMYB75- R(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttaactcgaa tagggaccta tgag 54

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> SbDEL-F(Artificial Sequence)

<400> 7

caatttacta ttctagtcga cctgcaatgg ggagtgcaaa gcaaaagc 48

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> SbDEL-R(Artificial Sequence)

<400> 8

cccgggcggt ccgtcatctc tttttgatga ctttctgaag tgc 43

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> CaMV35S-F(Artificial Sequence)

<400> 9

gggcccctcg aggagaagat tagcctcttc aatttc 36

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> CaMV35S-R(Artificial Sequence)

<400> 10

gcttttgctt tgcactcccc attgcaggtc gactagaata gtaaattg 48

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> qSbMYB75-F(Artificial Sequence)

<400> 11

aaatcccaag agcaacaacg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> qSbMYB75-R(Artificial Sequence)

<400> 12

gatcctggtc ggagaacaaa 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> QSbDEL-F(Artificial Sequence)

<400> 13

agtgagccac aatgagctca actg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> QSbDEL-R(Artificial Sequence)

<400> 14

gaagcctcca catcgatgcc ttgt 24

Claims (16)

1.一种黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的组合，其特征在于，所述SbMYB75的基因序列如SEQ ID No. 1所示，所述SbDEL的基因序列如SEQ ID No. 3所示。

2.根据权利要求1所述的黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的组合，其特征在于，SbMYB75的蛋白序列如SEQ ID No. 2所示，SbDEL的蛋白序列如SEQ ID No. 4所示。

3.一种用于扩增如权利要求1或2中所述的黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的组合的引物组合物。

4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，用于扩增SbMYB75基因的引物包括如SEQ ID No. 5~ SEQ ID No.6所示序列，用于扩增SbDEL基因的引物包括如SEQ ID No. 7~ SEQ ID No.8所示序列。

5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于，用于扩增SbMYB75基因的引物具有Gateway 重组位点，用于扩增SbDEL基因的引物具有酶切位点保护碱基或融合PCR位点。

6.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，用于扩增SbMYB75基因的如SEQ IDNo.11~ SEQ ID No.12所示序列的引物，用于扩增SbDEL基因的如SEQ ID No.13~ SEQ IDNo.14所示序列的引物。

7.由权利要求1或2所述的黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的组合构建的重组载体、重组微生物或宿主细胞。

8.一种如权利要求1或2所述的黄芩花青素转录调控因子SbMYB75和SbDEL的组合，或权利要求7所述的重组载体、重组微生物或宿主细胞在合成花青素中的应用。

9.根据权利要求8述的应用，其特征在于，构建合成花青素的生物材料的方法包括如下步骤：

（1）扩增如SEQ ID No.1所示序列的SbMYB75基因和如SEQ ID No.3所示序列的SbDEL基因；

（2）利用扩增产物构建含SbMYB75基因和SbDEL基因的植物过表达载体，转化微生物，获得含SbMYB75基因和SbDEL基因的重组微生物；

（3）利用重组微生物转化植物细胞，获得含SbMYB75基因和SbDEL基因的转基因细胞系，并培养以获得转基因植物组织。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述构建合成花青素的生物材料的方法中，采用用于扩增CaMV35S的引物，其包括SEQ ID No.9~ SEQ ID No.10所示序列，用于扩增CaMV35S的引物具有具有酶切位点保护碱基或融合PCR位点。

11.一种黄芩花青素转录调控因子SbDEL，其特征在于，所述SbDEL的基因序列如SEQ IDNo. 3所示。

12.根据权利要求11所述的黄芩花青素转录调控因子SbDEL，其特征在于，SbDEL的蛋白序列如SEQ ID No. 4所示。

13.由权利要求11所述的黄芩花青素转录调控因子SbDEL构建的重组载体、重组微生物或宿主细胞。

14.一种如权利要求11所述的黄芩花青素转录调控因子SbDEL，或权利要求13所述的重组载体、重组微生物或宿主细胞在合成花青素中的应用。

15.根据权利要求14述的应用，其特征在于，构建合成花青素的生物材料的方法包括如下步骤：

（1）扩增如SEQ ID No.3所示序列的SbDEL基因；

（2）利用扩增产物构建含SbDEL基因的植物过表达载体，转化微生物，获得含SbDEL基因的重组微生物；

（3）利用重组微生物转化植物细胞，获得含SbDEL基因的转基因细胞系。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述构建合成花青素的生物材料的方法中，采用用于扩增CaMV35S的引物，其包括SEQ ID No.9~ SEQ ID No.10所示序列，用于扩增CaMV35S的引物具有具有酶切位点保护碱基或融合PCR位点。

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