CN109354619B

CN109354619B - 一种牡丹myb蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109354619B
Application number: CN201811552016.8A
Authority: CN
Inventors: 张延召; 许书贞; 彭正峰; 程彦伟; 杨学义; 张晓申
Original assignee: Luoyang Normal University
Current assignee: Luoyang Normal University
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109354619A

Abstract

本发明属于植物基因育种领域，具体涉及一种牡丹MYB蛋白及其编码基因与应用。所述的牡丹MYB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该基因能够在烟草叶片中调控花青素的合成，使烟草叶片呈现花斑，这个特性与已报道的其它花青素调控基因的效果明显不同，同时能够使烟草提前开花。因此，该基因具有同时调控花青素和开花时间的双重作用，这在其它物种中尚未被发现。本发明提供的牡丹MYB蛋白及其编码基因不仅可以为牡丹育种提供重要基因资源，而且可以应用到其它花卉植物的育种中去。

Description

一种牡丹MYB蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因育种领域，具体涉及一种牡丹MYB蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

彩色植物是育种过程中人们关注的重点性状之一，特别是在观赏植物育种领域，一个新的彩色品种能产生巨大的经济效益。长期以来，彩色植物育种以传统的杂交育种为主，存在育种周期长，不易获得特定性状等弊端。随着分子生物学技术的发展，科研工作者开始关注利用基因工程方法开展花卉育种研究，其典型的特点是育种周期大大缩短，采用功能基因能够有效获得目的性状。多数植物颜色主要成分是花青素，花青素含量及成分的差异是不同品种花色多样性的决定因素。近年来，人们对于植物中花青素合成及调控机制有了初步了解。花青素合成途径由一系列酶参与，这些酶依次催化特定底物生成花青素，花青素在转运蛋白的作用下被运输到液泡中，显示出我们看到的颜色。MYB基因是植物最大的基因家族之一，已报道的研究中多数植物的MYB家族基因包含多于100个成员。模式植物拟南芥MYB家族有124个基因，其中PAP1、PAP2、MYB113和MYB114基因可以直接调控花青素合成酶基因的转录水平，进而在细胞中合成花青素。因此，MYB基因在花卉植物中是花色的决定性基因之一，MYB基因的改变会对花青素的积累造成明显的影响，进而决定植物的颜色。

牡丹功能基因的研究开展的相对较晚，目前直接参与花青素调控的MYB家族基因还没有被报道。因此，在牡丹中鉴定参与花青素合成的MYB基因，对牡丹新品种培育具有重要意义，可以以此基因为资源开展以花色改良为目的的基因工程育种和分子标记育种。目前植物花期也有较多研究，在模式植物中人们通常认为FT基因控制开花时间。对于目前已经报道的花青素调控相关的MYB基因，并未发现其有改变开花时间的作用。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种牡丹MYB蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述牡丹MYB蛋白的基因。

本发明的再一目的在于提供上述牡丹MYB蛋白的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种与上述牡丹MYB蛋白相关的生物材料。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种牡丹MYB蛋白，为具有如下A1)、A2)或A3)所示序列的蛋白质：

A1)由序列表中序列1(SEQ ID No.1)所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)在序列表中序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A)衍生的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

其中，序列表中序列1由269个氨基酸残基组成；

编码上述牡丹MYB蛋白的基因，为如下B1)、B2)或B3)所示的基因：

B1)核苷酸序列是序列表中序列2(SEQ ID No.2)的cDNA分子或DNA分子；

B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述牡丹MYB蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述牡丹MYB蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述的牡丹MYB蛋白在改变植物花色和/或开花时间中的应用；

一种与上述牡丹MYB蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b6)中的任一种：

b1)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的表达盒；

b2)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；

b3)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；

b4)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的转基因植物细胞系、或含有b1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b5)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的转基因植物组织、或含有b1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b2)所述重组载体的转基因植物组织；

b6)含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的转基因植物器官、或含有b1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b2)所述重组载体的转基因植物器官；

b1)中所述的含有编码上述牡丹MYB蛋白的基因的表达盒(MYB基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达上述牡丹MYB蛋白的DNA，该DNA不但可包含启动MYB基因转录的启动子，还可包含终止MYB基因转录的终止子，进一步地，该表达盒还可包含增强子序列；可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子；

可用现有的植物表达载体构建含有MYB基因表达盒的重组表达载体；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因；

本发明实施例中所述的植物表达载体为pCAMBIA1301；

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述农杆菌可为农杆菌Gv3101；

所述的与上述牡丹MYB蛋白相关的生物材料在改变植物花色和/或开花时间中的应用；

一种改变植物花色和/或开花时间的方法，包含如下步骤：

向受体植物中导入编码上述牡丹MYB蛋白的基因，得到转基因植物；

所述的编码上述牡丹MYB蛋白的基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明牡丹MYB蛋白的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

所述的编码上述牡丹MYB蛋白的基因通过含有MYB基因表达盒的重组表达载体导入目的植物中；

所述的含有MYB基因表达盒的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明从牡丹品种二乔中克隆到一个MYB家族基因，在转基因实验中发现其能够在烟草叶片中调控花青素的合成，使烟草叶片呈现花斑，这个特性与已报道的其它花青素调控基因的效果明显不同，同时能够使烟草提前开花。因此其同时具有调控花青素和开花时间的双重作用，这在其它物种中尚未被发现。这个基因不仅可以为牡丹育种提供重要基因资源，而且可以应用到其它花卉植物的育种中去。

(2)本发明提供的牡丹MYB蛋白及其编码基因可以作为一个优良的蛋白和基因资源，可以广泛应用到植物遗传育种领域，对于以同时改变花色和开花时间为目的的分子育种具有重要作用。

附图说明

图1是转基因阳性烟草植株和对照烟草植株叶片花斑展示图，其中，A：转基因阳性烟草植株一全株展示(叶片花斑明显)，B：转基因阳性烟草植株二全株展示(叶片花斑明显)，C：对照烟草植株全株展示(叶片无花斑)，D：转基因阳性烟草植株一叶片展示(叶片花斑明显)，E：转基因阳性烟草植株二叶片展示(叶片花斑明显)，F：对照烟草植株叶片展示(叶片无花斑)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，相关试剂配制方法如下：

1M Tris PH＝8.0(每25ml SSTE用0.25ml，每200ml CTAB提取液用20ml)：100ml中加12.114g Tris碱，加DEPC处理过的水至80ml，用浓HCl调pH至8.0。

0.5M EDTA(每200ml CTAB中加10ml，每25ml SSTE中加0.05ml)：50ml中加9.3gEDTA，加NaOH约1g，DEPC-H₂O 40ml，调pH＝8.0(不要调过)，定容后加50μl DEPC-H₂O。EDTA很难溶，可稍加热。

10wt％SDS(每25ml SSTE加1.25ml)：50ml中加入5g SDS，用DEPC-H₂O定容至50ml。SDS很难溶，可稍加热。

4M LiCl：每200ml加33.912g无水LiCl，定容后加200μl DEPC水，灭菌。3M NaAc：每10ml加4.0824g NaAc粉末。

CTAB提取液：2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，25mM EDTA，100mM Tris-Cl pH 8.0，2.0M NaCl，0.5g/l Spermidine(亚精胺)，灭菌后加入2％(V/V)β-巯基乙醇。

SSTE buffer：1.0M NaCl，0.5wt％SDS，10mM Tris-Cl pH 8.0，1mM EDTA。氯仿/异戊醇(24:1，V/V)：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

培养基配方：

MS1培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；

MS2培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+Cb 250mg/L；

MS3培养基：1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L。

实施例1

一、CTAB法提取植物总RNA

(1)65℃水浴中预热15mL CTAB提取液(加入300μLβ-巯基乙醇)；

(2)液氮中研磨2～3g新鲜或-70℃冷冻的牡丹二乔材料；

(3)转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30～60s，短时放回65℃水浴中(4～5min)；

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)并涡旋混合，10000rpm常温离心15min，沉淀蛋白质；

(5)将上清转移至一新离心管，重复抽提一次，沉淀蛋白质；

(6)将上清转移至一新离心管中，加入等体积的4M LiCl，使LiCl的终浓度为2M，4℃下沉淀过夜(<16h)使RNA变性；

(7)4℃，15000rpm离心1h沉淀RNA，弃上清去除DNA，用500μL体积分数为70％的乙醇洗沉淀去除杂质，然后用500μL体积分数为100％的乙醇洗沉淀；

(8)用500μL SSTE溶解沉淀(RNA)，转移至1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇去除蛋白质杂质抽提一次；

(9)加入1/10体积的3M NaAc(pH＝5.2)，2×体积的无水乙醇，在-70℃沉淀60min或-20℃沉淀2h；

(10)4℃，15000rpm离心20min沉淀RNA(全速)；

(11)先用400μL体积分数为70％的乙醇洗沉淀，然后用400μL体积分数为100％的乙醇洗沉淀，干燥后用65μL DEPC水溶解RNA。

二、cDNA合成

cDNA合成采用宝生物试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行。

三、基因克隆

设计引物对MYB基因编码区全长进行克隆。引物如下：

正向引物MYB-F：5’-ATGGAGGGAATGTTAGGATTG-3’；

反向引物MYB-R：5’-TTAATTCACCGCTTGCCCTTC-3’；

扩增体系及反应程序如表1和2所示，经PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物克隆到T载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行测序。

表1 PCR扩增体系

表2 PCR反应程序

获得该基因编码区全长序列如下：

ATGGAGGGAATGTTAGGATTGAGAAAAGGTGCATGGACTGATGAAGAGGATCGCCTGCTTAGGAAGTGTATAGAAAAGTATGGAGAAGGCAAATGGCATCAAGTTCCTTTCAGAGCAGGATTGAACAGGTGCAGGAAGAGCTGTAGATTGAGGTGGTTGAACTATCTCAGGCCAAATATTAAGAGGGGAGAATTCTCAGCGGATGAAGTTGATCTTATCATTAGACTGCATAAACTGTTGGGTAACAGATGGTCACTGATTGCCGGTAGACTACCAGGAAGAACTGCAAATGATGTAAAGAACTATTGGAACACGCACCTACACAAGAAGAGGATATCATGCGGTGCAACCACCAATGATAAGACCCGGAAAACATGCATGCGAGTCAATGTAATAAAGCCTCAGCCTCGGACCTTCTCCAAAAATCTATCATGGATGAGCGGAAAATCTTCAACATTATTTGAAAAAATTGAAGTTGGAAGCAATATTCTTAGAAAACCAGCTTTGTCAACACTGCCCATACTGCCATCGCCATCGCCATCGCCAACACCACAACCGACCCATGGAATTCAGTGGTGGGAGAGCTTAGTTGTTGATGGCGAAGGGGATCAAGTAGCCCCCACTGCCTCTTCTACAACTGGGCCAGGAGATGACCCATTATGCTTTAACAGCCTGTGGACTGAAGAAACTGCACCAGAGACAGGACAAAGTTCTTTTAATCTCGAAGGCCAGACATGTTGGATTAATGATTTTTCTCTTGATATGAACATTTGGGATCTATTAAGTGCTGAAGGGCAAGCGGTGAATTAA

该基因编码区包含810个碱基，编码269个氨基酸：

MEGMLGLRKGAWTDEEDRLLRKCIEKYGEGKWHQVPFRAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPNIKRGEFSADEVDLIIRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTHLHKKRISCGATTNDKTRKTCMRVNVIKPQPRTFSKNLSWMSGKSSTLFEKIEVGSNILRKPALSTLPILPSPSPSPTPQPTHGIQWWESLVVDGEGDQVAPTASSTTGPGDDPLCFNSLWTEETAPETGQSSFNLEGQTCWINDFSLDMNIWDLLSAEGQAVN.

通过系统发育分析发现该牡丹MYB基因与拟南芥花青素调控的PAP1基因功能比较相近。

实施例2基因表达载体构建及烟草遗传转化

(1)设计5’端加酶切位点的引物扩增牡丹MYB基因(扩增体系及程序见表1和表2)，引物如下(下划线部分为Sal I和Pst I酶切位点)：

正向引物MYB-F2：5’-ACGCGTCGACATGGAGGGAATGTTAGGATTGAGAAAAG-3’；

反向引物MYB-R2：5’-ATTGGCTGCAGTTAATTCACCGCTTGCCCTTCAGCACTTAATAG-3’；

(2)将PCR产物用Sal I和Pst I进行双酶切后连入植物表达载体pCAMBIA1301载体中，利用电击法将表达载体转入农杆菌Gv3101，采用农杆菌介导法转化烟草，其中，含有空载体pCAMBIA1301的农杆菌Gv3101作为对照。具体方法如下：

①烟草无菌苗的快繁

先将烟草种子用体积分数为75％的乙醇浸泡0.5min，再用体积分数为2％的NaClO浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，用无菌吸水纸吸干水分，接种于MS培养基上，25℃下光照培养，即可获得烟草无菌试管苗。切取烟草无菌试管苗的叶片，去掉其主叶脉和叶缘，将其剪成约1cm2见方的小叶片，接种于芽分化培养基MS1中，待芽长出以后，切取单个芽接种于MS培养基中，20天左右即可长成植株。

②农杆菌的培养

在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素(antibiotic))中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm，10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5～20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5左右。

③农杆菌侵染

取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉和叶缘，将其剪成约1cm²见方的小叶片。将叶片放入制备好的菌液中，浸泡5～10min，在无菌滤纸上吸干多余菌液。

④共培养

将吸干的叶片外植体放在愈伤组织诱导或分化培养基MS1，25℃暗培养48h。

⑤选择培养

将经过共培养的叶片外植体转入加有选择压的脱菌分化或愈伤组织诱导培养基MS2上，叶片背面向下，边缘压入培养基中，25℃光照下培养。培养7～15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出。

⑥生根培养

待芽长大后，切下，置于含有选择压的生根培养基MS3上进行生根培养，2～7天左右长出不定根。

⑦转基因烟草的移栽

等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

⑧对步骤⑦获得的转基因烟草植株提取RNA，反转录得到cDNA，采用引物MYB-F2和引物MYB-R2作为扩增引物，进行鉴定，获得转基因阳性烟草植株；

⑨选择5株转基因阳性烟草植株进行花青素含量分析：取1g烟草叶片，加入0.2g石英砂研磨，然后加入5ml 1％盐酸甲醇(v/v)于4℃条件下萃取6h。12000rpm离心后取上清检测花青素。花青素计算方法为：A530-0.25×A657，其中，转入空载的烟草植株作为对照烟草植株。

⑩对步骤⑨中的5株转基因阳性植株的生长发育过程进行记录。

结果分析：

实验结果表明，对照烟草植株叶片提取液的吸光值为0.11，而5株转基因阳性烟草植株叶片提取液的吸光值分别为0.94、1.93、1.36、1.57和1.75。以上数据充分说明转基因植株中花青素含量有了显著提升。且，与对照烟草植株相比，5株转基因阳性烟草植株的叶片呈现花斑，而对照烟草植株叶片无花斑(图1)。

对5株转基因阳性植株的生长发育过程进行记录，发现转基因阳性烟草植株开花时间明显提前。相对于对照烟草植株，5株转基因植物开花提前时间分别是15天，12天，12天，7天和3天。说明该MYB蛋白具有同时调控花青素和开花时间的双重作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳师范学院

<120> 一种牡丹MYB蛋白及其编码基因与应用

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 序列1

<400> 1

Met Glu Gly Met Leu Gly Leu Arg Lys Gly Ala Trp Thr Asp Glu Glu

1 5 10 15

Asp Arg Leu Leu Arg Lys Cys Ile Glu Lys Tyr Gly Glu Gly Lys Trp

20 25 30

His Gln Val Pro Phe Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys

35 40 45

Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly Glu

50 55 60

Phe Ser Ala Asp Glu Val Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu Leu

65 70 75 80

Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ala

85 90 95

Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu His Lys Lys Arg Ile

100 105 110

Ser Cys Gly Ala Thr Thr Asn Asp Lys Thr Arg Lys Thr Cys Met Arg

115 120 125

Val Asn Val Ile Lys Pro Gln Pro Arg Thr Phe Ser Lys Asn Leu Ser

130 135 140

Trp Met Ser Gly Lys Ser Ser Thr Leu Phe Glu Lys Ile Glu Val Gly

145 150 155 160

Ser Asn Ile Leu Arg Lys Pro Ala Leu Ser Thr Leu Pro Ile Leu Pro

165 170 175

Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Gln Pro Thr His Gly Ile Gln Trp

180 185 190

Trp Glu Ser Leu Val Val Asp Gly Glu Gly Asp Gln Val Ala Pro Thr

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Thr Gly Pro Gly Asp Asp Pro Leu Cys Phe Asn Ser

210 215 220

Leu Trp Thr Glu Glu Thr Ala Pro Glu Thr Gly Gln Ser Ser Phe Asn

225 230 235 240

Leu Glu Gly Gln Thr Cys Trp Ile Asn Asp Phe Ser Leu Asp Met Asn

245 250 255

Ile Trp Asp Leu Leu Ser Ala Glu Gly Gln Ala Val Asn

260 265

<210> 2

<211> 810

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 序列2

<400> 2

atggagggaa tgttaggatt gagaaaaggt gcatggactg atgaagagga tcgcctgctt 60

aggaagtgta tagaaaagta tggagaaggc aaatggcatc aagttccttt cagagcagga 120

ttgaacaggt gcaggaagag ctgtagattg aggtggttga actatctcag gccaaatatt 180

aagaggggag aattctcagc ggatgaagtt gatcttatca ttagactgca taaactgttg 240

ggtaacagat ggtcactgat tgccggtaga ctaccaggaa gaactgcaaa tgatgtaaag 300

aactattgga acacgcacct acacaagaag aggatatcat gcggtgcaac caccaatgat 360

aagacccgga aaacatgcat gcgagtcaat gtaataaagc ctcagcctcg gaccttctcc 420

aaaaatctat catggatgag cggaaaatct tcaacattat ttgaaaaaat tgaagttgga 480

agcaatattc ttagaaaacc agctttgtca acactgccca tactgccatc gccatcgcca 540

tcgccaacac cacaaccgac ccatggaatt cagtggtggg agagcttagt tgttgatggc 600

gaaggggatc aagtagcccc cactgcctct tctacaactg ggccaggaga tgacccatta 660

tgctttaaca gcctgtggac tgaagaaact gcaccagaga caggacaaag ttcttttaat 720

ctcgaaggcc agacatgttg gattaatgat ttttctcttg atatgaacat ttgggatcta 780

ttaagtgctg aagggcaagc ggtgaattaa 810

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物MYB-F

<400> 3

atggagggaa tgttaggatt g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物MYB-R

<400> 4

ttaattcacc gcttgccctt c 21

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物MYB-F2

<400> 5

acgcgtcgac atggagggaa tgttaggatt gagaaaag 38

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物MYB-R2

<400> 6

attggctgca gttaattcac cgcttgccct tcagcactta atag 44

Claims

1.一种牡丹MYB蛋白，其特征在于为具有如下A1）或A2）所示序列的蛋白质：

A1）由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述的牡丹MYB蛋白的基因，其特征在于为如下B1）、B2）或B3）所示的基因：

B1）核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

B2）与B1）限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的牡丹MYB蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

B3）在严格条件下与B1）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的牡丹MYB蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

3.权利要求1所述的牡丹MYB蛋白在改变植物花色和/或开花时间中的应用，其特征在于：所述的植物为牡丹或烟草。

4.一种与权利要求1所述的牡丹MYB蛋白相关的生物材料，其特征在于为下述b1）至b3）中的任一种：

b1）含有编码牡丹MYB蛋白的基因的表达盒；

b2）含有编码牡丹MYB蛋白的基因的重组载体、或含有b1）所述表达盒的重组载体；

b3）含有编码牡丹MYB蛋白的基因的重组微生物、或含有b1）所述表达盒的重组微生物、或含有b2）所述重组载体的重组微生物。

5.根据权利要求4所述的与牡丹MYB蛋白相关的生物材料，其特征在于：

所述的载体为pCAMBIA1301。

6.根据权利要求4所述的与牡丹MYB蛋白相关的生物材料，其特征在于：

所述微生物为农杆菌Gv3101。

7.权利要求4～6任一项所述的与牡丹MYB蛋白相关的生物材料在改变植物花色和/或开花时间中的应用，其特征在于：

所述的植物为牡丹或烟草。

8.一种改变植物花色和/或开花时间的方法，其特征在于包含如下步骤：

向受体植物中导入编码权利要求1所述的牡丹MYB蛋白的基因，得到转基因植物；

所述的植物为牡丹或烟草。

9.根据权利要求8所述的改变植物花色和/或开花时间的方法，其特征在于：

所述的编码权利要求1所述的牡丹MYB蛋白的基因通过含有MYB基因表达盒的重组表达载体导入目的植物中。

10.根据权利要求9所述的改变植物花色和/或开花时间的方法，其特征在于：

所述的含有MYB基因表达盒的重组表达载体通过使用植物病毒载体法、直接DNA转化法或农杆菌介导法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

11.根据权利要求10所述的改变植物花色和/或开花时间的方法，其特征在于：

所述的农杆菌介导法为使用Ti质粒、Ri质粒转化植物细胞或组织；

所述的直接DNA转化法为使用显微注射、电导或基因枪法转化植物细胞或组织。