CN114214332A

CN114214332A - 一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用

Info

Publication number: CN114214332A
Application number: CN202111657700.4A
Authority: CN
Inventors: 王丰青; 左鑫; 张重义; 智惊宇; 徐莉萍; 杜家方; 姬祥; 杨习文
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114214332B

Abstract

本发明提供一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用，首次从天目地黄花冠中克隆得到一条正调控花青素的MYB转录因子RcMYB1的cDNA序列，推测获得了其编码的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在地黄中异源表达RgMYB1可明显地提高地黄叶、块根和花中的花青素含量，从而确定其参与正调控植物花青素合成的功能。

Description

一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用

技术领域

本发明涉及一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。

背景技术

花青素(Anthocyanidin)是广泛存在于高等植物的次生代谢物质，其被糖苷修饰后形成稳定的水溶性物质，储存在细胞的液泡中，使植物的花朵、果实和储藏根等器官呈现丰富的色彩。大量的研究表明，花青素具有抗癌、抗糖尿病、改善视觉健康、抗菌、保护心血管、抗肥胖及预防慢性疾病等作用。因此，花青素在食品和医药保健方面具有重要的研究价值和应用潜力。

花青素的生物合成在模式植物拟南芥和园艺植物中研究较多，花青素的生物合成途径已经基本明确。花青素在植物体内由一系列酶催化生成，酶由相应的结构基因编码，这些结构基因的表达受一个复杂的转录调控网络调节，其中MYB转录因子是参与花青素结构基因表达调控的重要成员，在花青素的生物合成中发挥着重要的作用。植物的MYB转录因子是一个大的基因家族，广泛参与植物的生长发育、逆境胁迫和次生代谢产物的合成调控，不同家族成员发挥作用也不相同。迄今已经在拟南芥、橄榄、非洲菊、苹果、葡萄、番茄、甘薯、百合等多种植物中克隆出参与花青素合成的MYB转录因子。

地黄属有6种植物，包括天目地黄Remannia chingii、地黄Remannia glutinosa、裂叶地黄Remannia piasezkii、湖北地黄Remannia henryi、高地黄Remannia elata和茄叶地黄Remannia solanifolia。地黄属的6种植物均含有丰富的环烯醚萜苷、苯乙醇苷、多糖等化学成分，具有广泛的药理活性。2015年江西省海昏侯墓出土的木质漆盒盛装的样品，经鉴定为玄参科地黄属植物根的辅料炮制品，可见，2000多年前已经开始将地黄属植物的根经过炮制入药。在地黄属的6种植物中，地黄为传统大宗药材，在我国用药历史最为悠久，为著名的“四大怀药”之一，在河南、山西的种植面积最大，河北、山东等地也有栽培。天目地黄以全草入药，在浙江省民间普遍应用。因此，深入挖掘地黄属植物中的优良基因资源，对于促进地黄属植物的品种改良和产业化发展具有重要的意义。

在地黄属6种植物中，天目地黄的花颜色最红，花青素含量非常丰富，挖掘天目地黄中调控花青素合成的MYB基因，有助于揭示MYB调控地黄属植物花青素合成的分子机理，也为培育富含花青素的地黄属植物新种质提供了优异的基因资源。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用，首次从天目地黄花冠中克隆得到一条正调控花青素的MYB转录因子RcMYB1的cDNA序列，推测获得了其编码的氨基酸序列。在地黄中异源表达RgMYB1可明显地提高地黄叶、块根和花中的花青素含量，从而确定其参与正调控植物花青素合成的功能。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述RcMYB1基因的重组载体；所述RcMYB1基因的重组载体的重组菌株。

更进一步的，本申请还包括所述天目地黄花青素相关基因RcMYB1在制备转基因植物中的应用；

所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1在调控植物花青素合成中的应用；

所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1在调控地黄花青素合成中的应用。

本发明有益效果：

MYB转录因子在地黄属植物花青素合成调控中的研究还未见报道，本发明提供一种天目地黄花青素调控基因RcMYB1，该基因与已知花青素调控转录因子拟南芥MYB114的同源性仅为51.4％，可为相关研究提供新的基因信息和研究思路。本发明还涉及关于RcMYB1在常用大宗中药材地黄中的应用，大幅度增加了地黄叶和块根中的花青素含量，提升了花青素在中药材品质改良中的应用前景。具体如下：

本发明首次从天目地黄中克隆得到RcMYB1基因，本发明人通过对不同发育时期的天目地黄花冠进行转录组测序，筛选到一条与拟南芥MYB114同源性较高的序列，转录本长度为1311bp。设计引物进行PCR，克隆得到798bp的RcMYB1基因，包含777bp的完整的开放阅读框。天目地黄RcMYB1基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。该基因编码258个氨基酸，蛋白质的分子量推测为29174Da，等电点是8.14。天目地黄RcMYB1基因推测得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。实时荧光定量PCR分析表明，该基因在天目地黄蕾期花冠中有较高的表达量。

在植物双元表达载体中插入得到的RcMYB1基因，以花椰菜病毒(CaMV)35S为启动子进行表达驱动。构建好的表达载体转入到根癌农杆菌LBA4404中。把携带表达载体的农杆菌以叶盘法转染地黄，观察转基因地黄植株的表型变化。结果显示：转基因地黄的叶片出现紫红色斑点，块根表皮变红，块根横截面有紫红色斑块，花冠裂片红色加深，转基因地黄叶、块根和花冠中的总花青素含量显著高于未转基因地黄，说明转基因植株的花青素合成显著增强，说明天目地黄RcMYB1的异源表达促进了地黄花青素的合成，证明本发明克隆得到的基因是天目地黄中正向调控花青素合成的MYB转录因子。

附图说明

图1为本发明实施例1中RcMYB1基因的核苷酸序列比对

图2为本发明实施例1中RcMYB1基因克隆的cDNA电泳图。

图3为本发明实施例2中RcMYB1在天目地黄不同组织中的相对表达量。

图4为本发明实施例3中转入RcMYB1基因的地黄的表型变化。

其中，A，叶；B，花冠；C，块根；D，块根横截面；WT，对照组；RcMYB1-OX，实验组。

图5为本发明实施例3中转入RcMYB1基因的地黄叶、块根和花冠中花青素的含量分析。

其中，A，叶；B，花冠；C，块根。WT，对照组；RcMYB1-OX，实验组；**，有显著性差异，p<0.01(下同)。

图6为本发明实施例4中转基因RcMYB1地黄叶、花冠和块根花青素途径催化酶基因表达量分析。

其中，A，叶中催化酶基因表达量分析；B，花冠中催化酶基因表达量分析；C，块根中催化酶基因表达量分析。

图7为本发明实施例5中RcMYB1结合烟草NtANS和NtDFR基因启动子的双荧光素酶活性分析。

其中，+pNtDFR，RcMYB1绑定NtDFR启动子的活性分析；+pNtANS，RcMYB1绑定NtANS启动子的活性分析；*，有显著性差异，p<0.05。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。但本发明的实施方式不限于此。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的改进，都属于本发明的保护范围。

实施例中所涉及仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；涉及试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；涉及试验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、天目地黄花青素合成基因RcMYB1的克隆

取新鲜的天目地黄花冠100mg，液氮速冻后研磨成粉末。以

Reagent试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，提取方法参考说明书进行，提取的总RNA用DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)进行DNA消化。RNA的浓度和质量以Nanodrop^TM 2000分光光度计进行检测。之后用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，合成cDNA，经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，完成文库制备工作。

测序在深圳华大基因进行，测序平台为Illumina HiSeq^TM 2000。测序获得的原始序列经过滤形成clean reads，使用Trinity对clean reads进行组装，使用Tgicl对转录本进行聚类去冗余得到Unigene，聚类后的Unigene即为天目地黄的转录本数据库。之后将对组装得到的Unigene进行七大功能数据库(KEGG、GO、NR、NT、SwissProt、Pfam和KOG)注释。

在地黄的转录本数据库中筛选到一条与拟南芥MYB114基因的cDNA相似性为51.4％的片段(RcMYB1)(图1)，核苷酸序列长度为1311bp，包含完整的开放阅读框，CDS长度为777bp，天目地黄RcMYB1基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。该基因编码258个氨基酸，蛋白质的分子量推测为29174Da，等电点是8.14。天目地黄RcMYB1基因推测得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1：

SEQ ID NO:2：

设计特异引物RcMYB1_F(SEQ ID NO:3：5’-ATGGAAGGCAATCCAGTTGG-3’)和RcMYB1_R(SEQ ID NO:4：5’-TCAGTCACCTAACCTAAGAAG-3’)，以天目地黄花冠cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系：

缓冲液(Mg²⁺plus)10μL，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸，各2.5mmol/L)4μL，正反向引物(10μmol/L)均为1μL，cDNA模板0.5μL，

HS DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，灭菌蒸馏水33μL，共计50μL。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃1min，30个循环；72℃4min。

得到包含RcMYB1完整编码区的789bp的cDNA片段(图2)。

实施例2、RcMYB1基因的表达特性分析

分别提取天目地黄不同发育阶段(幼蕾、中蕾、成熟蕾、初开花、成熟花)花冠、及叶中的总RNA，反转录为cDNA用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。

在RcMYB1基因的编码区设计特异引物RcMYB1_qF(SEQ ID NO:5：5’-CAGATGGTCACTGATAGCCG-3’)和RcMYB1_qR(SEQ ID NO:6：5’-ACGAGCTTCTTGTCGATGTG-3’)。用TaKaRa公司的TB

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR检测，以RcTIP41为内参基因，引物序列为RcTIP41_qF(SEQ ID NO:7：5’-AAGAGCAGCTTCAGACTTCC-3’)和RcTIP41_qR(SEQ ID NO:8：5’-GAATTTCCATTGAGCAGCCG-3’)。

PCR扩增体系：TB

Premix Ex酶12.5μL，正反向引物(10μmol/L)各1μL，cDNA模板2.0μL，去离子水8.5μL，共计25μL。反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。根据BIO-RAD iQ5软件生成的Ct(cycle threshold)值，以2^-ΔΔCt计算RcMYB1基因的相对表达量。

结果发现，RcMYB1基因在蕾期的花冠中具有较高的表达量，尤其是在成熟花蕾的花冠中的表达水平最高(图3)，说明RcMYB1在天目地黄花色形成的过程中表达水平较高。

实施例3、RcMYB1在地黄中的功能验证

为了分析RcMYB1在地黄中的花青素合成中的分子功能，以正向带有Sal I酶切位点的引物RcMYB1_oxF(SEQ ID NO:9：5’-gcGTCGACgcagaATGGAAGGCAATCCAGTTGG-3’)和反向带有BamH I酶切位点的RcMYB1_oxR(SEQ ID NO:10：5’-cgGGATCCTCAGTCACCTAACCTAAGAAG-3’)进行PCR扩增。

PCR反应体系为50μL，包括10μL的

缓冲液(Mg²⁺plus)，4μL的dNTP混合物，正反向引物(10μmol/L)均为1μL，1μL模板cDNA，0.5μL

HS DNA聚合酶(2.5U/μL)，添加32.5μL的去离子水。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃1min，30个循环；72℃4min。

扩增产物纯化后以Sal I和BamH I进行双酶切，酶和酶切缓冲液的用量参考说明书，酶切反应体系总体积为20μL，反应条件为37℃、3h。酶切产物在割胶仪中进行切胶回收，具体操作按照天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行。

回收产物以T4-DNA连接酶连接到以Sal I和BamH I进行双酶切的带有潮霉素筛选基因的植物双元表达载体上。连接反应体系为：质粒DNA 6μL，RcMYB1 cDNA片段2μL，10×Buffer1μL，T4 DNA连接酶1μL，总体系10μL。

体系配置完毕后置于PCR扩增仪中16℃过夜连接。驱动RcMYB1表达的启动子为花椰菜病毒(CaMV)35S，终止子为Nos，构建好的过量表达载体命名为p35S-RcMYB1-Nos。构建好的载体进行测序确认序列正确，之后以冻融转化法转入到根癌农杆菌LBA4404中。

以携带表达载体p35S-RcMYB1-Nos的根癌农杆菌侵染地黄叶片。

1)将根癌农杆菌在含卡那霉素的YEB固体培养基表面划线后暗培养活化，培养温度为28℃，活化后的菌株在YEB固体培养基表面划线培养48h后，以含有100mg/L乙酰丁香酮(AS)液体MS培养基冲洗农杆菌至菌体浓度至OD₆₀₀＝0.5制备成侵染培养基。

2)将继代30d的无菌地黄苗叶片去叶脉后剪成长和宽均约0.5～0.8cm的叶片小块(叶盘)，浸泡入侵染培养基中5～8min，之后取出叶盘接种到含有100mg/L乙酰丁香酮的固体MS培养基上进行暗培养，培养温度为26℃。

3)48h后取出共培养后的叶盘，无菌水洗净表面的农杆菌，放入MS筛选培养基上进行愈伤诱导和再生芽分化，培养温度为26℃，光照强度为2000～4 000lx，每天14光照，MS筛选培养基中含有2mg/L 6-BA(6苄基腺嘌呤)、0.1mg/L NAA(萘乙酸)、200mg/L特美汀和12mg/L潮霉素。

4)叶盘在筛选培养基上培养6～8周，即可见到再生分化芽生出，待分化芽长至2-3cm时剪下进行在含200mg/L特美汀的MS固体培养基中生根培养，培养温度为26℃，光照强度为2000～4 000lx，每天14光照。待再生芽的根长至2-3cm取出，移栽到营养土中，在温室中进行培养，培养温度为26℃，光照强度为2000～4 000lx，每天14光照。在温室中生长40d后进行表型分析。

实验组为转入RcMYB1基因的处理组(RcMYB1-OX)，并以未转入RcMYB1基因的空白处理组为对照(WT)。

结果发现，在转RcMYB1基因的地黄(RcMYB1-OX实验组)叶片有斑块状紫红色斑点，但部分不均匀(图4A)；转基因地黄花冠的颜色明显较对照(空白处理组WT)红，尤其是花冠裂片的颜色变化较大(图4B)；转基因地黄的块根表皮也有紫红色斑点(图4C)，块根横截面上也有紫红色色斑沉积(图4D)。

利用全波长酶标仪测定转RcMYB1基因的地黄叶、块根和花中的总花青素含量，结果表明(图5)，转基因地黄(RcMYB1-OX实验组)叶、花冠和块根中的总花青素含量分别为7.51mg/g FW、9.36mg/g FW和1.12mg/g FW，分别为对照(空白处理组WT)的118.08、1.95和6.11倍。表明本发明提供的RcMYB1基因进行转基因育种促进花青素的合成是可行且有效的。

实施例4、RcMYB1调控花青素途径催化酶基因的表达分析

随机选取在温室里生长40d的转RcMYB1基因的3个地黄株系(实验组RcMYB1-OX)，及未转入RcMYB1基因的3个地黄株系(对照组WT)，取同样部位的叶和块根分别混匀，液氮速冻后提取总RNA。总RNA逆转录后合成cDNA第一链，作为检测基因表达量的模板。根据地黄的转录组信息，筛选编码花青素生物合成途径的关键催化酶基因RgCHS、RgCHI、RgF3H、RgDFR和RgANS的转录本，设计特异引物，用于检测转基因植株中相关基因的表达量，以RgTIP41为内参基因。引物由上海生工生物工程公司合成。定量PCR引物见表1。实时荧光定量PCR检测用TaKaRa公司TB

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒。PCR扩增体系和反应条件见实施例2。

表1地黄花青素合成途径结构基因实时荧光定量PCR引物

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)
		RgCHS_qF	AATTGCGTGGATCAGAGCAC(SEQ ID NO:11)
RgCHS_qR	TGTAAGCGCACATGTTTGGA(SEQ ID NO:12)
		RgCHI_qF	CTGTATCGCCTTCTGTCACC(SEQ ID NO:13)
RgCHI_qR	TGGCAGTGAACTTGACGAAC(SEQ ID NO:14)
		RgF3H_qF	GGTTATATCGCTCGACGGAG(SEQ ID NO:15)
RgF3H_qR	TTCTCTTGAGCAGGCAACTC(SEQ ID NO:16)
		RgDRF_qF	AAACCAACTGGAGTGACCTG(SEQ ID NO:17)
RgDRF_qR	GAATGGACCAACCACTACAGG(SEQ ID NO:18)
		RgANS_qF	CAGACATCAACTCCGACGAC(SEQ ID NO:19)
RgANS_qR	CCGATTTATGAGCTCCTCCG(SEQ ID NO:20)
		RgTIP41_qR	TGGCTCAGAGTTGATGGAGTG(SEQ ID NO:21)
RgTIP41_qR	TCTCCAGCAGCTTTCTCGGA(SEQ ID NO:22)

定量分析结果表明，RgCHI在转基因地黄3个组织中的表达量变化不明显，其余4个催化酶基因RgCHS、RgF3H、RgDFR和RgANS在转基因地黄的叶片和块根中的表达水平均极显著高于对照组WT(图6)。RgCHS、RgCHI、RgF3H、RgDFR和RgANS转基因地黄叶中的表达量分别增加了108.62、0.40、731.67、57.24、和1722.24倍(图6A)，在花冠中分别增加了15.52、-0.14、21.87、132.96和128.33倍(图6B)，在块根中分别增加了19965.35、1.02、162.94、12.53和355.06倍(图6C)。说明RcMYB1提高了地黄花青素途径催化酶基因的表达量，转RcMYB1提高地黄叶、花冠和块根中的花青素含量是通过促进催化酶基因的表达量实现的。

实施例5、RcMYB1调控烟草NtANS和NtDFR基因启动子活性分析

由于地黄基因组信息有限，获得地黄花青素合成途径催化酶基因的启动子基因组序列难度很大，分析了RcMYB1结合烟草花青素催化酶基因NtANS和NtDFR启动子的活性。克隆NtDFR和NtANS的启动子序列，设计特异引物(表2)进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μL的

HS DNA 聚合酶(2.5U/μL)，去离子水32.5μL，总体积为50μL。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃2min，30个循环；72℃4min。

提取pGreen II 0800-LUC质粒，用KpnI限制性核酸内切酶单酶切并胶回收纯化；在启动子扩增重组引物两端添加同源臂，根据ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)说明书进行无缝克隆，分别构建成含有目标基因启动子的报告基因载体pGreenII-Luc-pNtDFR和pGreenII-Luc-pNtANS。

利用冻融法分别把实施例3构建的RcMYB1过量表达载体p35S-RcMYB1-Nos(处理组)、不含RcMYB1的空载体(对照组)和荧光素酶报告基因载体pGreenII-Luc-pNtDFR、pGreenII-Luc-pNtANS分别转入农杆菌GV3101。

分别取转入启动子荧光素酶报告基因载体、RcMYB1过量表达载体、不含RcMYB1的空载体的农杆菌菌液，接种于LB液体培养基悬浮培养，待菌液浓度OD₆₀₀值为0.5时取等量的待测菌液进行混合，以含启动子荧光素酶报告基因载体和RcMYB1过量表达载体的混合农杆菌菌液为处理组，以含启动子荧光素酶报告基因载体和空载体的混合农杆菌菌液为对照，利用注射器分别将混合菌液注射入状态良好的本生烟草叶片。在处理后48h取烟草叶片进行荧光值的测定，计算荧光素酶相对活性。

表2烟草花青素合成途径催化酶基因启动子克隆引物

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)
		NtANSp_F	ATCCCTTATCCCGCATGCA(SEQ ID NO:23)
NtANSP_R	GCACTGATCACCACCATCTCTG(SEQ ID NO:24)
		NtDFRp_F	AGAGTTAGGTCGGGCAAACGC(SEQ ID NO:25)
NtDFRp_R	CATGAACAGCTGCATGACCTTC(SEQ ID NO:26)

结果表明，RcMYB1可以绑定到NtANS和NtDFR启动子上，增强启动子的活性，RcMYB1使NtANS启动子的活性较对照组增强了1.18倍，使NtDFR启动子的活性较对照组增强了9.26倍(图7)。说明RcMYB1可以激活NtDFR和NtANS启动子的表达。

以上仅以地黄为实施例，RcMYB1也可以用于其它地黄属植物的遗传改良，同时该基因对于地黄属以外的植物也具有潜在的应用前景。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用

<130> RcMYB1基因

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggaaggca atccagttgg agtgagaaaa ggtgtttgga cacctgaaga agatattcgc 60

ttgagaaaat gcattcagaa ttttggagaa gggaaatggc atcttgtccc tctaagagca 120

gggctaaaca gatgcaggaa aagttgcagg ttgagatggt tgaattatct gaatccaaat 180

attaaaagag gtcaatttaa taaagatgaa gttgatctca ttatcaggct tcataaactg 240

ttgggcaaca gatggtcact gatagccggt agactccccg gaagaacagc caacgatgtg 300

aagaacttct ggaacagcca catcgacaag aagctcgtcg gcgccgcaac cgccgccgga 360

gaaacaacgg ccaaattcca gaaaaccatc acccacacca acatcgcgcg gccccaacct 420

cggaccttta cgaacctatc cttgcagaaa acaagagaaa caagacttca attaccaaac 480

aatattgata ttaattataa gcagcatcca tcttcgacga cgtcgtgtga tgcggcggat 540

gaatgcataa ggtggtggag caacctgctc gaaaagggac agctggttga cgacgacgat 600

gaggaggaga ataaaatgga gcccggcccg ttgggaatgt cgggtggatt gcgtgatggt 660

gacattaatg ccacaccagt acgaggacgt gaaggggatg ttgatgatga taaaggtttt 720

ggtggtgatt tctgcattga tgtggaagtt tgcgaacttc ttaggttagg tgactga 777

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Glu Gly Asn Pro Val Gly Val Arg Lys Gly Val Trp Thr Pro Glu

1 5 10 15

Glu Asp Ile Arg Leu Arg Lys Cys Ile Gln Asn Phe Gly Glu Gly Lys

20 25 30

Trp His Leu Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser

35 40 45

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Asn Pro Asn Ile Lys Arg Gly

50 55 60

Gln Phe Asn Lys Asp Glu Val Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu

65 70 75 80

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Val Lys Asn Phe Trp Asn Ser His Ile Asp Lys Lys Leu

100 105 110

Val Gly Ala Ala Thr Ala Ala Gly Glu Thr Thr Ala Lys Phe Gln Lys

115 120 125

Thr Ile Thr His Thr Asn Ile Ala Arg Pro Gln Pro Arg Thr Phe Thr

130 135 140

Asn Leu Ser Leu Gln Lys Thr Arg Glu Thr Arg Leu Gln Leu Pro Asn

145 150 155 160

Asn Ile Asp Ile Asn Tyr Lys Gln His Pro Ser Ser Thr Thr Ser Cys

165 170 175

Asp Ala Ala Asp Glu Cys Ile Arg Trp Trp Ser Asn Leu Leu Glu Lys

180 185 190

Gly Gln Leu Val Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Asn Lys Met Glu Pro

195 200 205

Gly Pro Leu Gly Met Ser Gly Gly Leu Arg Asp Gly Asp Ile Asn Ala

210 215 220

Thr Pro Val Arg Gly Arg Glu Gly Asp Val Asp Asp Asp Lys Gly Phe

225 230 235 240

Gly Gly Asp Phe Cys Ile Asp Val Glu Val Cys Glu Leu Leu Arg Leu

245 250 255

Gly Asp

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggaaggca atccagttgg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tcagtcacct aacctaagaa g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cagatggtca ctgatagccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

acgagcttct tgtcgatgtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aagagcagct tcagacttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gaatttccat tgagcagccg 20

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcgtcgacgc agaatggaag gcaatccagt tgg 33

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cgggatcctc agtcacctaa cctaagaag 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aattgcgtgg atcagagcac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tgtaagcgca catgtttgga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctgtatcgcc ttctgtcacc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

tggcagtgaa cttgacgaac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ggttatatcg ctcgacggag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ttctcttgag caggcaactc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

aaaccaactg gagtgacctg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gaatggacca accactacag g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

cagacatcaa ctccgacgac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccgatttatg agctcctccg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tggctcagag ttgatggagt g 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tctccagcag ctttctcgga 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

atcccttatc ccgcatgca 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

gcactgatca ccaccatctc tg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agagttaggt cgggcaaacg c 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

catgaacagc tgcatgacct tc 22

Claims

1.一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1，其特征在于，RcMYB1的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.如权利要求1所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1，其特征在于，RcMYB1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.含有如权利要求1所述RcMYB1基因的重组载体。

4.含有如权利要求3所述RcMYB1基因的重组载体的重组菌株。

5.如权利要求1或2所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1在制备转基因植物中的应用。

6.如权利要求1或2所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1在调控植物花青素合成中的应用。

7.如权利要求1或2所述的天目地黄花青素相关基因RcMYB1在调控地黄花青素合成中的应用。